一种稳定液体谷氨酰胺转氨酶酶活的制剂的制作方法

文档序号:18620009发布日期:2019-09-06 22:23阅读:430来源:国知局
本发明属于酶制剂领域和食品添加剂领域,涉及一种使液体谷氨酰胺转氨酶酶活保持稳定的制剂。发明背景谷氨酰胺转氨酶在食品加工行业有着广泛应用和前景,但是目的大部分的谷氨酰胺转氨酶还是以粉末制剂的形式生产和使用。粉末制剂已经实现规模化生产但是存在着生产成本偏高,保存受限制和使用不便的缺陷,而液体酶制剂则可以解决以上的问题。目前虽然已有商品化的液体酶制剂,但是仍然存在着多方面的问题,其中最突出的问题就是市售的液体酶制剂只能在室温(25℃,下同)下长期保存,但在实际的运输,贮存过程中,很难保证稳定的室温条件,在夏季或是气候炎热地区,其应用效果可能会受到很大的影响。因此开发一种可在较高温度下(30℃,下同)长期稳定保存的液体谷氨酰胺转氨酶制剂是推广液体酶制剂的关键。技术实现要素:本发明的目的是提供一种可以使谷氨酰胺转氨酶液体酶酶活在较高温度长期保存下保持稳定的制剂,该制剂使液体谷氨酰胺转氨酶(即谷氨酰胺转氨酶液体酶)可在30℃保存三个月剩余酶活不低于85%且在室温(25℃)下保存6个月剩余酶活不低于90%。本发明提出了一种稳定液体谷氨酰胺转氨酶酶活的制剂,其组成成分包括糖类和醇类、抗氧化剂、谷氨酰胺转氨酶、水活度调节剂和酸度调节剂。优选地,所述制剂的组成成分及含量包括:150-200u的谷氨酰胺转氨酶/每毫升制剂,20%-100%(w/v)重量体积比的糖类和/或醇类,0.01%-2%(w/v)重量体积比的抗氧化剂,以及0.01%-1%(w/v)重量体积比的酸度调节剂。其中,所述糖类和/或醇类的含量为20%-100%(w/v);优选地,为20%、27%和29%。所述抗氧化剂的含量为0.01%-2%(w/v);优选地,为0.2%。所述谷氨酰胺转氨酶的含量为150-200u/毫升,即1毫升液体酶制剂中包含150-200u的谷氨酰胺转氨酶。所述酸度调节剂的含量为0.01%-1%(w/v);优选地,为0.1%。所述水活度调节剂的含量为30%-40%(w/v);优选地,为30%、33%和40%。本发明制剂中,所述制剂的理化性质:ph范围在5.5-9.0,水活度范围在0.5-0.89,电导率范围在0.1-5ms/cm,氧化还原电位范围在-350-100mv;优选地,ph为6.5,水活度为0.61,电导率为1.2ms/cm,氧化还原电位为-200mv。本发明制剂中,所述糖类和/或醇类为:海藻糖、蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖、低聚异麦芽糖、环糊精、麦芽糊精、可溶性淀粉、山梨糖醇、乳糖醇、麦芽糖醇、木糖醇、聚乙二醇、甘露糖醇、丙二醇、丙三醇中的一种或多种。优选地,为木糖醇、山梨糖醇、葡萄糖、海藻糖、蔗糖中的一种或多种。本发明制剂中,所述抗氧化剂是:茶多酚、茶多酚棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(bha)、二丁基羟基甲苯(bht)、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、甘草抗氧化物、l-抗坏血酸及其盐、磷脂、没食子酸丙酯、迷迭香提取、山梨酸钾、乳酸钙、l-半胱氨酸及其盐、乙二胺四乙酸二钠、还原型谷胱甘肽、大豆蛋白水解物、酵母水解物、竹叶抗氧化物、植酸等的一种或多种。优选地,为没食子酸丙酯,谷胱甘肽,茶多酚棕榈脂,l-半胱氨酸和亚硫酸钠的一种或多种。本发明制剂中,所述酸度调节剂为:乙酸钠、dl-苹果酸及其钠盐、柠檬酸及其盐、葡萄糖酸钠、乳酸及其钠盐、碳酸盐、富马酸及其钠盐、dl-酒石酸、硫酸钙、氢氧化钙、盐酸、氢氧化钠等的一种或多种。优选地,为柠檬酸及柠檬酸钠的一种或两种。本发明制剂中,所述水活度调节剂优选为甘油三醇。本发明制剂中,所述液体谷氨酰胺转氨酶的酶活在30℃下保存三个月后的剩余酶活不低于85%,且在25℃室温下保存六个月后的剩余酶活不低于90%。本发明有益效果在于:本发明提供的稳定酶活的制剂实现了谷氨酰胺转氨酶液体酶在30℃条件下储存3个月酶活剩余率85%以上;常温条件下存储6个月,酶活剩余率90%以上且溶液性状均一稳定,达到了市场商业化要求,生产工艺简单、使用效果良好,在较高温度的运输和储存条件下不影响液体酶的品质。本发明具有广泛应用前景,其推广应用和发展具有重大意义。具体实施方式结合以下具体实施例,对本发明作进一步的详细说明,本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下,本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中,并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等,除以下专门提及的内容之外,均为本领域的普遍知识和公知常识,本发明没有特别限制内容。为获得满足条件的液体酶制剂,需要根据谷氨酰胺转氨酶的具体生化性质,本发明创新地提出了研究和筛选液体谷氨酰胺转氨酶添加物的思路:首先,研究发现对液体酶长期保存存在影响的因素有:温度,ph,微生物,电导率和氧化还原电位,通过针对不同因素对液体酶长期保存的影响的原因,从gb2760-2014(食品安全国家标准食品添加剂使用标准)中有目的的选择添加物,初步筛选得到效果较好的添加物组成初始配方,再通过实际液体酶保存实验来验证配方的效果,从中筛选出所需的液体酶配方。实施例1:温度对谷氨酰胺转氨酶液体酶保存的影响将纯化除菌后的酶液装在密封的离心管中,置于不同温度的培养箱中,放置7天,观察溶液状态并检测剩余酶活。结果如表1所示。表1.谷氨酰胺转氨酶液体酶置于不同温度下7天后的酶活剩余情况温度初始酶活剩余酶活酶活剩余率溶液状态4℃100u/ml99.8u/ml99.8%澄清25℃100u/ml97.2u/ml97.2%澄清30℃100u/ml84.8u/ml84.8%混浊37℃100u/ml51.6u/ml51.6%浑浊45℃100u/ml7.8u/ml7.8%浑浊从表1的数据中可以发现,当温度低于25℃时,酶活保存较好,随着温度的升高,酶活剩余率不断降低,在30℃时,溶液出现了浑浊的现象,当温度在45℃时,酶活剩余率仅有7.8%,说明谷氨酰胺转氨酶的热稳定性较差,需要添加能提高液体酶热稳定性的添加物。实施例2不同保护剂对液体酶热稳定性的提高效果选择对在高温下对蛋白有保护作用的物质进行实验,将其与液体酶混合,在60℃水浴锅中处理10min,观察其对液体酶的热稳定性是否有提高。结果见表2。表2.不同添加物在高温下对液体酶的保护作用从表2中可以发现,部分糖类和醇类物质对液体酶在高温下的保护作用比较明显,无机盐保护作用一般。继续观察添加保护剂的液体酶在30℃下保存七天后的剩余酶活,结果见表3。表3.不同添加物在30℃对液体酶的保护作用添加物添加物浓度初始酶活处理后酶活酶活剩余率无-100u/ml23.15u/ml23.15%甘油20%100u/ml51.14u/ml51.14%蔗糖20%100u/ml78.03u/ml78.03%葡萄糖20%100u/ml63.54u/ml63.54%麦芽糖20%100u/ml68.66u/ml68.66%氯化钠20%100u/ml43.29u/ml43.29%氯化钙20%100u/ml41.50u/ml41.50%山梨糖醇20%100u/ml75.28u/ml75.28%海藻糖20%100u/ml83.16u/ml80.16%从表3结果可以得出,在高温下对液体酶有保护作用的物质,在30℃条件下也对液体酶有保护作用。实施例3ph值对谷氨酰胺转氨酶酶液长期保存的影响将纯化除菌后的液体酶用hcl和naoh调节至不同的ph,检测初始酶活,装入密封的无菌离心管中,置于30℃下保存7天,观察酶活保存情况,具体见表4表4.调节至不同ph值的液体酶的保存效果ph初始酶活调节ph后酶活剩余酶活酶活剩余率352u/ml17.54u/ml0.054u/ml0.31%452u/ml36.88u/ml24.80u/ml67.24%552u/ml46.32u/ml32.81u/ml70.83%652u/ml51.72u/ml43.57u/ml84.24%752u/ml44.42u/ml39.09u/ml87.99%852u/ml32.07u/ml28.12u/ml87.69%952u/ml35.34u/ml28.94u/ml81.86%从表4中可以发现,在ph5.0-9.0的范围内,酶活剩余率较高,优选5.5-9.0作为初始液体酶配方的ph。实施例4不同酸度调节剂对液体酶保存的影响使用不同的酸度调节剂调节液体酶ph至6.5,装入无菌密封的离心管中,置于30℃保存七天都检测剩余酶活,观察不同的酸度调节剂是否会对液体酶酶活的保存产生影响。详见表5。表5.不同酸度调节剂对液体酶酶活保存的影响从表中结果可以发现,柠檬酸及其钠盐作为液体酶的酸度调节剂效果明显。实施例5微生物对谷氨酰胺转氨酶酶液长期保存的影响因为液体谷氨酰胺转氨酶中含有微生物生长所需的营养物质,而微生物的代谢产物很可能会对液体酶的保存产生影响,因此在长期保存中,微生物是需要考虑的关键因素,微生物在液体酶中滋生会导致酶液发臭,酶活下降迅速,见表6。表6.感染微生物对液体酶长期保存的影响保存温度保存时间初始酶活剩余酶活酶液状态30℃7天100u/ml84.8u/ml未染菌30℃7天100u/ml35.5u/ml染菌实施例6水活度对谷氨酰胺转氨酶酶液长期保存的影响为防止微生物感染,在不考虑使用防腐剂的情况下,还可以通过降低溶液水活度来实现。使用丙三醇来调节液体酶的水活度,将酶液与不同比例的丙三醇混合,检测其水活度,然后加入等量的大肠杆菌,最后装入密封的无菌离心管中,置于30摄氏度下保存7天,观察液体酶染菌情况及酶活的保存情况,详见表7。表7.水活度与液体酶长期保存的影响从表7结果可以看出降低溶液水活度能够抑制微生物的滋生,有利于液体酶的长期保存,但考虑到添加物的量会提高成本,选择0.7-0.85的水活度范围。实施例7电导率对谷氨酰胺转氨酶液体酶长期保存的影响在纯化除菌的酶液中加入氯化钠来调节溶液至不同的电导率,测定初始酶活,置于30℃保存7天,检测剩余酶活,观察电导对酶活剩余率的影响。详见表8表8.电导率对液体酶长期保存的影响从表8中可以看出,电导率增大对液体酶保存产生了负面影响,因此液体酶应尽量降低溶液的电导率,结合实际生产,电导率控制在5.0ms/cm以下。实施例8氧化还原电位对液体酶长期保存的影响因为谷氨酰胺转氨酶具有易被氧化的特性,因此氧化还原电位也是需要考虑的一个重要因素。使用亚硫酸钠和双氧水作为氧化还原电位调节剂,将亚硫酸钠和双氧水溶液ph调至6.0,加入到酶液中,调节氧化还原电位至不同的值,置于30℃培养箱中放置7天,观察酶活剩余率。详见表9表9.氧化还原电位对液体酶长期保存的影响氧化还原电位初始酶活剩余酶活酶活剩余率200mv100u/ml33.36u/ml33.36%150mv100u/ml51.11u/ml51.11%100mv100u/ml63.54u/ml63.54%50mv100u/ml84.36u/ml84.36%0mv100u/ml85.21u/ml85.21%-50mv100u/ml97.87u/ml97.87%-100mv100u/ml97.24u/ml97.24%-200mv100u/ml98.31u/ml98.31%-300mv100u/ml96.27u/ml96.27%-350mv100u/ml97.46u/ml97.46%-400mv100u/ml84.68u/ml84.68%上表结果说明,氧化还原电位与液体酶的保存有很重要的联系,当液体酶的氧化还原电位为负值时,更有利于液体酶的长期保存。选择氧化还原电位在-350-0mv范围内。实施例9不同种类的抗氧化剂对液体酶长期保存的影响为了筛选出更加适合谷氨酰胺转氨酶的抗氧化剂,从gb2760-2014中挑选不同的抗氧化剂添加到液体酶中,在30℃放置7天,观察酶活剩余率,得到最适合谷氨酰胺转氨酶的抗氧化剂。详见表10。表10.不同种类的抗氧化剂对液体酶长期保存的影响从表10.中可以发现添加了抗氧化剂没食子酸丙酯,谷胱甘肽,茶多酚棕榈脂,l-半胱氨酸和亚硫酸钠的液体酶保存效果较好。通过上面的实验确定了液体酶中将包括糖类或醇类作为谷氨酰胺转氨酶的保护剂,提高热稳定性,加入抗氧化剂保证溶液中的酶不会被氧化失活,加入丙三醇降低溶液的水活度,达到抑菌的目的,使用酸度调节剂调节调节液体酶的ph,最后检测溶液电导率是否在规定范围内。实施例10制备谷氨酰胺转氨液体酶的方法,该液体酶制剂终体积为1000ml,制备过程如下,根据表11配方添加各物质。表11.谷氨酰胺转氨液体酶配方表称取配方表中的各添加物,搅拌均匀后,通过0.22um的无菌滤膜过滤除菌,得到澄清的淡黄色溶液,测定氧化还原电位为-70mv、水分活度0.76、ph6.5、酶活为160u/ml,最终制备成的液体型谷氨酰胺转氨酶制剂,将其装入无菌的塑料瓶中,分别置于30℃和室温下下保存90天和180天后观察溶液状态,并检测酶活,计算酶活剩余率,参照gb4789.2-2010食品安全国家标准《食品微生物学检验菌落总数测定》。结果发现,液体酶制剂的溶液性状未发生明显变化,酶活保存率30℃为85.5%,常温为92%,且微生物指标符合gb25594-2010标准要求,可以用于商业化生产。实施例11制备谷氨酰胺转氨液体酶的方法,该液体酶制剂终体积为1000ml,制备过程如下,根据表12配方添加各物质。表12.谷氨酰胺转氨液体酶配方表配制完成的液体酶测定氧化还原电位为-150mv、水分活度0.74、ph6.3、酶活为150u/ml。长期保存酶活测定结果:液体酶制剂的溶液性状未发生明显变化,酶活保存率30℃为87.1%,常温为91%,且微生物指标符合gb25594-2010标准要求,可以用于商业化生产。实施例12制备谷氨酰胺转氨液体酶的方法,该液体酶制剂终体积为1000ml,制备过程如下,根据表13配方添加各物质。表13.谷氨酰胺转氨液体酶配方表配制完成的液体酶测定氧化还原电位为-45mv、水分活度0.76、ph6.5、酶活为158u/ml。长期保存酶活测定结果:液体酶制剂的溶液性状未发生明显变化,酶活保存率30℃为86.9%,常温为93%,且微生物指标符合gb25594-2010标准要求,可以用于商业化生产。本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下,本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中,并且以所附的权利要求书为保护范围。当前第1页12
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