本发明涉及植物保护领域，尤其涉及一种利用活立木茎干接种担子菌中病原木腐菌的方法及其致病性验证应用。
背景技术：
木腐菌(wood-decayingfungi)能够降解腐木和倒木，绝大多数为担子菌门真菌，其中有些种类能够侵染树林活立木的茎干或根系，引起树木的茎腐病或根腐病，影响树木长势，严重时整株死亡，是重要的病原木腐菌。由病原木腐菌引起的树木茎腐病或根腐病，在完成柯赫法则验证其致病性过程中，致病性测定是一大难题。目前大部分都利用离体材料人工接种来完成木腐菌所致树木茎腐或根腐病病菌致病性的测定，如专利cn201610276468公开了一种离体茎测定烟草疫霉致病性的方法，专利cn201610276471公开了一种南瓜片测定烟草疫霉致病性的方法，专利cn201710132452公开了一种测定甘蔗梢腐病病菌致病性的方法，以上均为离体接种方法，实验环境易控制，但与病害实际的致病性验证存在一定差异，而且所报道的病原菌归属于卵菌和半知菌类，而利用活立木的茎干进行人工接种验证担子菌中的病原木腐菌的致病性未见报道。另外也有部分研究利用根块接种进行根腐病病菌致病性的测定，挖根费时费力且成功率低。
本发明人经过十多年的研究和反复验证，成功摸索出一种利用活树茎干测定担子菌中病原木腐菌致病性的接种方法，并应用于危害树木茎干或根系的病原木腐菌的致病性验证。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供了一种利用活立木茎干测定担子菌中病原木腐菌致病性的方法，解决了现有接种方法离体操作麻烦、成功率低的问题。
本发明采用的技术手段如下：一种利用活立木茎干测定担子菌中病原木腐菌致病性的方法，包括以下步骤：
(1)制作木屑培养基
按重量百分比将木屑82％、麦麸15％、葡萄糖2％和石膏1％配好，加水润湿后混匀并分装到直径3-6cm、高5-10cm的小塑料袋中，封口，在121℃下湿热灭菌1-2h；
(2)制作接种菌棒
从培养的病原木腐菌菌落上挑取菌丝块，接种到步骤(1)的木屑培养基中，置于26℃-28℃下培养10-40天制作接种体，待接种体内的菌丝长满菌袋后作为接种菌棒备用；
(3)接种
在适宜病菌侵染的季节，选择生长2-3年生的健康幼树，先对幼树地上30cm内的茎干消毒，后在近地面10-30cm处的茎干上削出一个长1-5cm、深1-5mm的平面切口为接种部位，同时在接种菌棒的一侧剪开一个与茎干伤口相匹配的剪口，将接种菌棒紧贴在茎干伤口上，接种部位下端附上湿棉花保湿，用3-5cm宽的塑料条包裹固定，再在距离接种部位上方约5-10cm处，围绕茎干用胶带将厚纸包裹呈伞形遮盖住接种菌棒；
(4)致病性验证
接种侵染1-2个月，解开包裹接种体的厚纸及塑料条，若接种菌棒牢固地附着在幼树茎干上，菌棒颜色无变化，接种菌棒附近的茎干上均长满菌丝和菌膜，在】茎干伤口处削去表皮组织，可见内部组织变色并发生白腐，说明接种成功；继续观察幼树是否出现病原木腐菌的发病症状，从而验证病原木腐菌的致病性。
优选地，步骤(3)中的接种时间选为5-9月。
优选地，步骤(3)中，采用70％的酒精对茎干表面进行消毒。
优选地，每棵幼树接种1-3个菌棒。
采用本发明提供一种利用活立木茎干测定担子菌中病原木腐菌致病性的方法，首次在活立木茎干上进行接种，不仅实现引起树木茎腐病的病原木腐菌的致病性测定，完成柯赫法则验证；而且验证了担子菌中的一大类木腐菌所致树木茎腐及根腐病的致病性测定无需根系接种，可直接通过在茎干接种进行验证。
另外采用自制的木屑培养基，自制的接菌棒以及保湿遮阳的接种方法，提高接种成功率，缩短侵染时间，且在活立木上进行致病性验证结果可靠。
附图说明
图1为实施例一的槟榔茎基腐病病菌接种后的发病效果图，a、接种后保湿遮阳；b、接种后发病症状；c、接种点内部组织变褐；
图2为实施例一的槟榔茎基腐病病菌接种前后槟榔树冠的症状对照图，其中a、对照槟榔株的正常树冠；b、发病槟榔株树冠叶片失绿发黄,下层叶片人叶柄基部下折倒挂；
图3为实施例二的柳树白腐病病菌的致病性测定效果图，a：对照柳树；b:接种垂柳呈现枯枝及生长不良；c：垂柳接种部位长出的白色菌丝；d：接种垂柳后期长出的病菌担子果；
图4为实施例三的橡胶树红根病菌接种前后的发病效果图，a：对照橡胶幼树茎干伤口已愈合；b:接种橡胶幼树接种菌棒未变色,上、下方沿胶树茎干长出菌膜；c：接种部位的胶树茎干组织白腐。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例一：一种利用活立木茎干测定槟榔茎基腐病病菌(ganodermaboninensepat.)致病性的方法，包括以下步骤：
1、制作培养基
木屑培养基：按重量百分比将木屑82％、麦麸15％、葡萄糖2％和石膏1％配好，加水润湿后混匀并分装到直径3cm、高约5cm的小塑料袋中，封口，在121℃下湿热灭菌1h。
2、制作接种菌棒
从纯化培养的槟榔茎基腐病病菌菌落上挑取1cm×1cm大小的菌丝块2块，接种到灭菌好的木屑培养基中，置于26℃下培养10天制作接种体，待接种体内的菌丝长满菌袋后作为接种菌棒备用。
3、接种
在适宜病菌侵染的季节(5月)，选择生长2年生的健康槟榔，先用70％的酒精对槟榔地上30cm内的茎干喷雾进行表面消毒，待酒精风干后，用消毒好的小刀在近地面约10cm处的茎干上削出一个长1cm、深1mm的平面切口，然后在接种菌棒的一侧剪开一个与切出的平面伤口相匹配的剪口，将接种菌棒紧贴在伤口上，接种部位下端附上湿棉花保湿，用3cm宽的塑料条包裹固定，一方面起到固定，另一方面防止水分挥发，再在距离接种部位上方约5cm处的茎干上，围绕茎干用胶带将厚纸包裹呈伞形遮盖住接种菌棒，起到遮阳作用，营造一个适合木腐菌生长的环境。
4、致病性测定
接种1个月后，解开包裹接种体的厚纸及塑料条，接种成功的接种菌棒牢固地附着在幼树茎干上，菌棒颜色与接种时无太大变化，接种部位长满菌丝和菌膜，摘下接种菌棒，可见原接种的茎干伤口处粘附有长满菌丝的菌棒碎木屑，削去表皮组织，可见内部组织变色并发生白腐，证明接种成功，继续观察，若幼树出现与田间槟榔茎基腐病自然发病相同的症状，则成功验证了槟榔茎基腐病的致病性，而未接种成功的接种菌棒则变褐，菌丝坏死，幼树茎干上的伤口已长出愈伤组织或愈合。槟榔茎基腐病病菌接种后的效果如图1和图2。
实施例二：一种利用活立木茎干测定柳树白腐病病菌[funaliatrogii(berk.)bondartsev&singer]致病性的方法，包括以下步骤：
1、制作培养基
木屑培养基：按重量百分比将木屑82％、麦麸15％、葡萄糖2％和石膏1％配好，加水润湿后混匀并分装到直径6cm、高约10cm的小塑料袋中，封口，在121℃下湿热灭菌2h。
2、制作接种菌棒
从纯化培养的柳树白腐病病菌用液体5ml，接种到灭菌好的木屑培养基中，置于28℃下培养40天制作接种体，待接种体内的菌丝长满菌袋后作为接种菌棒备用。
3、接种
在适宜病菌侵染的季节(9月)，选择生长3年生的健康柳树，先用70％的酒精对幼树地上30cm内的茎干喷雾进行表面消毒，待酒精风干后，用消毒好的小刀在近地面约30cm处的茎干上削出一个长5cm、深5mm的平面切口，然后在接种菌棒的一侧剪开一个与切出的平面伤口相匹配的剪口，将接种菌棒紧贴在伤口上，接种部位下端附上湿棉花保湿，用5cm宽的塑料条包裹固定，再在距离接种部位上方约10cm处的茎干上，围绕茎干用胶带将厚纸包裹呈伞形遮盖住接种菌棒。幼树每株接1-2个接种菌棒，若茎干较粗每株接3个接种菌棒。
4、致病性观察
接种2个月后，解开包裹接种体的厚纸及塑料条，接种成功的接种菌棒牢固地附着在幼树茎干上，菌棒颜色与接种时无太大变化，有的可见接种菌棒附近的茎干上均长满菌丝和菌膜，摘下接种菌棒，可见原接种的茎干伤口处粘附有长满菌丝的菌棒碎木屑，削去表皮组织，可见内部组织变色并发生白腐，证明接种成功，继续观察幼树是否出现与田间柳树白腐病病菌病害相同的症状，未接种成功的接种菌棒则变褐，菌丝坏死，幼树茎干上的伤口已长出愈伤组织或愈合。柳树接种白腐病病菌的致病性测定效果如图3。
实施例三：一种利用活立木茎干测定橡胶树红根病菌致病性的方法，包括以下步骤：
1、制作培养基
木屑培养基：按重量百分比将木屑82％、麦麸15％、葡萄糖2％和石膏1％配好，加水润湿后混匀并分装到直径6cm、高约10cm的小塑料袋中，封口，在121℃下湿热灭菌2h。
2、制作接种菌棒
从纯化培养的橡胶树红根病菌用液体5ml，接种到灭菌好的木屑培养基中，置于28℃下培养40天制作接种体，待接种体内的菌丝长满菌袋后作为接种菌棒备用。
3、接种
在适宜病菌侵染的季节(9月)，选择生长3年生的健康橡胶树，先用70％的酒精对幼树地上30cm内的茎干喷雾进行表面消毒，待酒精风干后，用消毒好的小刀在近地面约15cm处的茎干上削出一个长5cm、深5mm的平面切口，然后在接种菌棒的一侧剪开一个与切出的平面伤口相匹配的剪口，将接种菌棒紧贴在伤口上，接种部位下端附上湿棉花保湿，用5cm宽的塑料条包裹固定，再在距离接种部位上方约10cm处的茎干上，围绕茎干用胶带将厚纸包裹呈伞形遮盖住接种菌棒，每株接2个接种菌棒。
4、致病性观察
接种1个月后，解开包裹接种体的厚纸及塑料条，接种成功的接种菌棒牢固地附着在幼树茎干上，菌棒颜色与接种时无太大变化，有的可见接种菌棒附近的茎干上均长满菌丝和菌膜，摘下接种菌棒，可见原接种的茎干伤口处粘附有长满菌丝的菌棒碎木屑，削去表皮组织，可见内部组织变色并发生白腐，证明接种成功，未接种成功的接种菌棒则变褐，菌丝坏死，幼树茎干上的伤口已长出愈伤组织或愈合，如图4。
说明本发明提供一种利用活立木茎干测定担子菌中病原木腐菌致病性的方法，可用于引起如橡胶树红根病、褐根病等树木根腐病的病原木腐菌的致病性测定。
对比例一：在槟榔幼树接种无菌的木屑棒作为对照，木屑棒颜色无变化，幼树茎干上的伤口已长出愈伤组织或愈合。
对比例二：对比例二和实施例一的区别在于：接种步骤中不经过保湿处理，即不用湿棉花保湿，用5cm宽的塑料条包裹固定。
对比例三：对比例三和实施例一的区别在于：不经过遮阳处理，即茎干不用胶带将厚纸包裹呈伞形遮盖住接种菌棒。
对比例四：在橡胶幼树上接种无菌的木屑棒作为对照，木屑棒颜色无变化，幼树茎干上的伤口已长出愈伤组织或愈合。
对比例五：对比例五和实施例三的区别在于：接种步骤中不经过保湿处理，即不用湿棉花保湿和塑料条包裹固定。
对比例六：对比例六和实施例三的区别在于：不经过遮阳处理，即茎干不用胶带将厚纸包裹呈伞形遮盖住接种菌棒。
验证实验测试：分别分为八组实验，1-4组，每组20棵槟榔幼树，分别采用实施例一、对比例一至三的方法进行接种后观察其发病症状，其结果如表一；5-8组，每组20棵橡胶幼树，分别采用实施例三、对比例四至六的方法进行接种后观察其发病症状，其结果表二。
表一不同条件下槟榔茎基腐病病菌致病性测定结果
表二不同条件下橡胶树红根病菌致病性测定结果
说明采用本发明的方法接种病菌成功率可达到100％，从而验证病害木腐菌的致病性，经过保湿和遮阳处理可明显提供接种成功率。
综上所述，采用本发明提供一种利用活立木茎干测定担子菌中病原木腐菌致病性的方法，不仅可解决引起树木茎腐病的病原木腐菌的致病性测定，完成柯赫法则验证；而且首次证明了树木根腐病的病原木腐菌的致病性测定，仅需活立木茎干接种即可验证其致病性，无需根系接种，解决了挖根费时费力问题。
另外采用自制的木屑培养基，自制的接菌棒以及保湿遮阳的接种方法，提高接种成功率，缩短侵染时间，在活立木上在线进行致病性验证结果更可靠。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明保护的范围之内。