本发明涉及一种来源于乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)的酮酸还原酶基因、编码酶、载体、工程菌及在合成手性芳香2-羟酸中的应用。
(二)
背景技术：
手性2-羟酸是一类在羧基(-cooh)侧c1位有羟基(-oh)取代的化合物，其分布广泛、性质活跃，是生产药物和精细化学品的重要手性砌块，在化工、医药等领域具有重要的应用价值。其中，比较具有代表性的是结构中含有苯环的一类衍生物，如(r)-扁桃酸是生产半合成青霉素、头孢菌素、抗肿瘤药和减肥药的关键中间体，同时是重要的手性拆分剂；(r)-邻氯扁桃酸是合成抗血栓药(氯吡格雷)的关键手性砌块，具有很高的市场需求和经济效益；(r)-4-氯扁桃酸是第一个商品化的扁桃酰胺类杀菌剂(双炔酰菌胺)的合成前体；(r)-4-羟基扁桃酸可用于生产左旋对羟基苯甘氨酸，进而合成多种广谱抗生素，如羟氨苄青霉素和羟氨苄头孢等。
正是由于手性2-羟酸在医药和精细化工领域的重要应用，使得如何获取光学纯的手性2-羟酸成为一直以来的研究热点。传统上，制备光学纯手性2-羟酸的方法主要依赖于化学动力学拆分，即选择合适的手性拆分试剂将外消旋混合物转化为非对映体盐，改变两种构型的物理性质，然后再进行后续的分离提取。然而，该方法存在很多的缺陷，如最大收率仅为50％、光学纯度低、拆分试剂昂贵、反应条件苛刻及污染环境等问题。近些年，生物催化法因其具有较高的立体选择性和催化活性、反应条件温和、环境友好等优势而得到越来越多的研究和开发，用于光学纯手性2-羟酸的高效生产。其中，比较具有代表性的包括酶法拆分、腈水解酶法、不对称还原和氧化还原级联去消旋。
①酶法拆分，酶法拆分制备光学纯手性2-羟酸属于动力学拆分，通常是指利用生物酶法选择性降解外消旋2-羟酸中的一种构型而获取另一目标构型。其保留了生物酶反应的优势，但最大的缺点是理论收率仅有50％。另外，还有利用脂肪酶拆分邻氯扁桃酸酯得到单一构型的酯化物，然后通过水解的方法获得光学纯邻氯扁桃酸，但是该方法步骤繁琐，不适用于工业化应用。
②腈水解酶法，腈水解酶是一类重要的水解酶，可以催化腈类底物一步转化为相应的羧酸，具有良好的催化特性，因此利用腈水解酶生物催化2-羟基腈制备光学纯手性2-羟酸得到广泛的研究。然而，由于该方法在催化过程中需用到大量剧毒的氢氰酸(hcn)，从而导致在实际应用时存在一定的危险性和操作难度。
③不对称还原，利用微生物体内具有立体选择性的还原酶将前手性的2-酮酸不对称还原为光学纯2-羟酸。该法的优点是理论产率高，操作简单等；缺点是反应过程一般需要添加辅酶，辅酶价格昂贵，大大增加生产成本，不利于工业化应用。另外，相对于外消旋化合物，前手性的2-酮酸底物不易获取或价格昂贵，限制了其应用。
④氧化还原级联去消旋，利用具有对映体选择性的2-羟酸脱氢酶、酮酸还原酶和葡萄糖脱氢酶级联催化外消旋2-羟酸转化为单一构型产物。该法节约时间，省去中产物的提取或纯化，还有可能降低可逆反应向底物方向进行，因此是最具有价值的手性2-羟酸获取方法。同时，借助多基因共表达技术，可以成功构建三酶共表达体系用于外消旋2-羟酸的高效去消旋化。
在应用氧化还原级联去消旋的策略制备光学纯手性2-羟酸时，发现酮酸还原酶的活性限制了整体的催化效率，导致底物装载量和产率相对较低。因此，寻找具有高活性和底物耐受性的酮酸还原酶用于三酶共表达催化体系，对实现外消旋2-羟酸的高效去消旋化具有显著的意义。
酮酸还原酶是一类重要的氧化还原酶，能够催化前手性酮酸不对称还原为相应的羟基酸，同时需要nadh(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)或nadph(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)作辅因子参与反应。在生物催化领域，生物酶作为催化剂往往具有特定的催化底物，单一酶通常不会对脂肪族和芳香族化合物同时具有催化活性。本研究中所挖掘的酮酸还原酶属于2-脱氢泛解酸-2-还原酶(2-dehydropantoate2-reductase)，已报道的可催化底物均为脂肪族化合物，但实验中却发现其可以高效地催化众多芳香族2-酮酸转化为手性芳香2-羟酸，这对于实现外消旋芳香2-羟酸的高效去消旋化具有重要的应用价值。
(三)
技术实现要素：
本发明目的是提供一种来源于乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)的高效酮酸还原酶基因、编码酶、载体、工程菌及其在合成手性芳香2-羟酸中的应用。所挖掘的酮酸还原酶能够催化广谱芳香族2-酮酸，且具有较高的底物装载量和催化效率。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种酮酸还原酶，所述酮酸还原酶氨基酸序列为seqidno.4、seqidno.8或seqidno.10之一所示，更优选所述酮酸还原酶氨基酸序列为seqidno.4所示。本发明是以来源于肠膜明串珠菌(leuconostocmesenteroides)的酮酸还原酶lekar(氨基酸序列为seqidno.2、核苷酸序列为seqidno.1)为模板，从ncbi数据库中筛选出5种氨基酸序列为seqidno.4、seqidno.6、seqidno.8、seqidno.10或seqidno.12的酮酸还原酶，分别来源于乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)、假肠膜明串珠菌(leuconostocpseudomesenteroides)、肠膜明串珠菌(leuconostocmesenteroides)、产酸克雷伯菌(klebsiellaoxytoca)和肠道沙门氏菌(salmonellaenterica)，氨基酸序列同源性分别在84％、78％、74％、49％和49％，经验证只有seqidno.4、seqidno.8、seqidno.10的酮酸还原酶具有催化活性。
任何对seqidno.4、seqidno.8、seqidno.10所示氨基酸序列进行一个或多个氨基酸的缺失、插入或替换处理获得的多肽片段或其变体，只要其与该氨基酸序列具有95％以上同源性，均属于本发明的保护范围。
本发明还提供一种所述酮酸还原酶的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列为seqidno.3、seqidno.7、seqidno.9之一所示。任何对seqidno.3、seqidno.7、seqidno.9所示核苷酸序列进行一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入处理获得的核苷酸序列，只要其与该核苷酸序列具有90％以上的同源性，均属于本发明的保护范围。
本发明还涉及所述酮酸还原酶的编码基因构建的重组载体及重组基因工程菌，所述重组基因工程菌为下列之一：(1)将酮酸还原酶编码基因导入宿主菌获得的；(2)将酮酸还原酶编码基因、2-羟酸脱氢酶编码基因和葡萄糖脱氢酶编码基因导入宿主菌获得的。
此外，本发明还提供一种所述酮酸还原酶在催化合成手性芳香2-羟酸中的应用。
应用方法一：当重组基因工程菌是将酮酸还原酶编码基因导入宿主菌获得时，所述的应用方法为：以含酮酸还原酶编码基因的工程菌发酵培养获得的湿菌体经超声破碎后的酮酸还原酶上清液和含葡萄糖脱氢酶编码基因(核苷酸序列为seqidno.15所示)的工程发酵培养获得的湿菌体经超声破碎后的葡萄糖脱氢酶上清液为催化剂，以苯乙酮酸为底物，以nad+为辅酶，以葡萄糖为辅助底物，以100mm、ph7.0的kh2po4-k2hpo4缓冲液为反应介质，在35℃、700rpm条件下反应，反应完全后，获得含(r)-扁桃酸的反应液；所述酮酸还原酶上清液用量以酮酸还原酶酶活计为800u/ml缓冲液，所述葡萄糖脱氢酶上清液用量以葡萄糖脱氢酶酶活计为800u/ml缓冲液，所述葡萄糖用量以缓冲液体积计为200～800mm，所述底物用量以缓冲液体积计为100～400mm，nad+用量以缓冲液体积计为0.5mm。
进一步，所述方法一中催化剂按如下方法制备：将含酮酸还原酶编码基因的工程菌接种到含50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，于37℃、150rpm条件下振荡培养8～10h，获得种子液；将种子液按2％(体积浓度)的接种量接入到含50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，于37℃、150rpm条件下振荡培养至od600达到0.4～0.8(优选0.6)，加入iptg至终浓度为0.1mm，于28℃、150rpm条件下振荡培养10～12h，离心收集湿菌体并用生理盐水洗涤两次，即得静息细胞；将静息细胞重悬于kh2po4-k2hpo4缓冲液(100mm，ph7.0)中，冰浴条件下超声破碎20min(破碎功率40w，工作1s，停1s)，破碎液于4℃，12000rpm下离心10min，收集酮酸还原酶上清液。所述葡萄糖脱氢酶上清液制备方法同酮酸还原酶上清液。
本发明应用方法一是利用微生物体内具有立体选择性的还原酶将前手性的2-酮酸不对称还原为光学纯2-羟酸。
应用方法二：当重组基因工程菌是将酮酸还原酶编码基因、2-羟酸脱氢酶编码基因和葡萄糖脱氢酶编码基因共同导入宿主菌获得时，所述的应用方法为：以含酮酸还原酶(优选llkar)、2-羟酸脱氢酶(hadh)和葡萄糖脱氢酶(gdh)编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以外消旋芳香2-羟酸为底物，以葡萄糖为辅底物，以ph6.0～8.0的缓冲液(优选ph7.0的kh2po4-k2hpo4缓冲液)为反应介质构成反应体系，在20～45℃(优选30℃)、700rpm条件下反应完全后，得到含有光学纯芳香(r)-2-羟酸的转化液。
进一步，所述外消旋芳香2-羟酸为下列之一：扁桃酸1a；2-氟扁桃酸1b；4-氟扁桃酸1c；2,4-二氟扁桃酸1d；3,5-二氟扁桃酸1e；2-氯扁桃酸1f；3-氯扁桃酸1g；4-氯扁桃酸1h；2-溴扁桃酸1i；3-溴扁桃酸1j；4-溴扁桃酸1k；4-甲基扁桃酸1l；4-三氟甲基扁桃酸1m；3-羟基扁桃酸1n；4-羟基扁桃酸1o；4-甲氧基扁桃酸1p；3-甲氧基-4-羟基扁桃酸1q；3-羟基-4-甲基扁桃酸1r；3-羟基-4-三氟甲基扁桃酸1s；3-甲基-4-甲氧基扁桃酸1t，优选1a-1m，字母只是编号，没有含义。
进一步，所述应用方法二反应体系中，底物终浓度为20-300mm，所述辅底物浓度为10-300mm，所述催化剂用量以湿菌体干重计为4-20g/l。
进一步，本发明应用方法二所述工程菌是将酮酸还原酶(优选llkar)、2-羟酸脱氢酶(hadh)和葡萄糖脱氢酶(gdh)的编码基因共同导入宿主菌e.colibl21(de3)中构建而成；所述2-羟酸脱氢酶的编码基因核苷酸序列为seqidno.13所示，所述葡萄糖脱氢酶的编码基因核苷酸序列为seqidno.15所示。
具体的，本发明所述含酮酸还原酶(llkar)、2-羟酸脱氢酶(hadh)和葡萄糖脱氢酶(gdh)编码基因的工程菌按如下步骤构建：
(1)构建e.colibl21(de3)/pet28b-llkar菌株
将酮酸还原酶llkar核苷酸序列连入到表达质粒pet28b中，得到重组质粒pet28b-llkar，转化到e.colibl21(de3)中，构建重组菌e.colibl21(de3)/pet28b-llkar。
(2)构建e.colibl21(de3)/pcdfduet-llkar-gdh菌株
将来源于exiguobacteriumsibiricum的葡萄糖脱氢酶(gdh)基因(核苷酸序列seqidno.15)和llkar基因先后与表达载体pcdfduet-1连接，得到重组质粒pcdfduet-llkar-gdh，转化到e.colibl21(de3)中，构建重组菌e.colibl21(de3)/pcdfduet-llkar-gdh。
(3)构建e.colibl21(de3)/pet28b-hadh菌株
将来源于pseudomonasaeruginosa的2-羟酸脱氢酶(hadh)基因(核苷酸序列seqidno.13)经体外合成相应的核苷酸序列并连入到表达质粒pet28b中，得到重组质粒pet28b-hadh，转化到e.colibl21(de3)中，构建重组菌e.colibl21(de3)/pet28b-hadh。
(4)构建e.colibl21(de3)/pet28b-hadh/pcdfduet-llkar-gdh菌株
分别从重组菌e.colibl21(de3)/pet28b-hadh和e.colibl21(de3)/pcdfduet-llkar-gdh中提取质粒pet28b-hadh和pcdfduet-llkar-gdh，按1:1的摩尔浓度比混匀后，共同转化到e.colibl21(de3)中，涂布在含50μg/ml卡那霉素和50μg/ml链霉素的双抗lb平板上，筛选到同时含hadh、llkar和gdh基因的重组菌e.colibl21(de3)/pet28b-hadh/pcdfduet-llkar-gdh，缩写为e.coli(hadh-llkar-gdh)，从而构建单菌双质粒三酶串联氧化还原级联体系。
所述单菌双质粒三酶串联氧化还原级联体系的反应机制为：以外消旋芳香2-羟酸为底物，利用具有s-立体选择性的hahd不对称氧化底物中的(s)-2-羟酸为2-酮酸，消耗的辅因子fmn可自我再生；再利用具有r-立体选择性的酮酸还原酶(优选llkar)将生成的2-酮酸不对称还原为(r)-2-羟酸，最终得到光学纯(r)-2-羟酸，其中的gdh可以实现辅酶nadh有效的循环再生，无需添加外源性辅酶。具体反应机制如图1所示，图中列出了具有代表性的20种外消旋芳香2-羟酸，本发明三酶共表达系统催化的底物包括但不限于这20种外消旋芳香2-羟酸。
进一步，所述方法二中催化剂按如下方法制备：将含酮酸还原酶、2-羟酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶编码基因的工程菌接种到含50μg/ml卡那霉素和50μg/ml链霉素的lb液体培养基中，于37℃、150rpm条件下振荡培养8～10h，获得种子液；将种子液按2％(体积浓度)的接种量接入到含50μg/ml卡那霉素和50μg/ml链霉素的lb液体培养基中，于37℃、150rpm条件下振荡培养至od600达到0.4～0.8(优选0.6)，加入iptg至终浓度为0.1mm，于28℃、150rpm条件下振荡培养10～12h，离心收集湿菌体并用生理盐水洗涤两次，即得湿菌体。
所述重组菌e.coli(hadh-llkar-gdh)最终被进一步用于催化高浓度邻氯扁桃酸的去消旋化。反应以重组菌e.coli(hadh-llkar-gdh)的静息细胞为催化剂，以外消旋邻氯扁桃酸为底物，以葡萄糖为辅底物，以kh2po4-k2hpo4缓冲液为反应介质。反应过程中用3.0m的naoh自动控制ph在7.0，反应完全后得到含有(r)-邻氯扁桃酸的转化液。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：
(1)本发明提供一种来源于乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)的高效酮酸还原酶(优选llkar)，其能够催化广谱芳香族2-酮酸，且以苯乙酮酸为底物的底物装载量由100mm提升至400mm。利用酮酸还原酶(优选llkar)、2-羟酸脱氢酶(hadh)和葡萄糖脱氢酶(gdh)建立的单菌双质粒三酶串联氧化还原级联体系，能够催化大多数外消旋芳香2-羟酸高效去消旋化为手性芳香(r)-2-羟酸，收率和e.e.值均大于99％。最终应用于去消旋300mm邻氯扁桃酸制备光学纯(r)-邻氯扁桃酸，收率高达83.8g/(l·d)。
(2)利用酮酸还原酶(优选llkar)、hadh和gdh构建的单菌双质粒三酶串联氧化还原级联体系，可用于外消旋手性芳香2-羟酸的高效去消旋化，制备具有较高利用价值的光学纯芳香(r)-2-羟酸。该反应具有成本低、绿色环保、工艺简单、催化效率高、无需添加外源性辅酶等优势，工业化前景广阔。
(四)附图说明
图1为单菌双质粒三酶串联氧化还原级联体系的反应机制。
图2为酮酸还原酶lekar、llkar、lmkar和kokar底物装载量比较分析。
图3为重组菌e.colibl21(de3)/pet28b-hadh/pcdfduet-llkar-gdh构建示意图。
图4为hadh、llkar和gdh共表达的蛋白电泳分析，泳道m为标准蛋白分子量marker，泳道1为未诱导的重组菌e.colibl21(de3)/pcdfduet-llkar-gdh，泳道2为经iptg诱导的重组菌e.colibl21(de3)/pcdfduet-llkar-gdh，泳道3为未诱导的重组菌e.colibl21(de3)/pet28b-hadh/pcdfduet-llkar-gdh，泳道4为经iptg诱导的重组菌e.colibl21(de3)/pet28b-hadh/pcdfduet-llkar-gdh。
图5为e.coli(hadh-lekar-gdh)催化200mm邻氯扁桃酸去消旋反应进程。
图6为e.coli(hadh-llkar-gdh)催化200mm邻氯扁桃酸去消旋反应进程。
图7为e.coli(hadh-llkar-gdh)催化300mm邻氯扁桃酸去消旋反应进程。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：筛选高效的酮酸还原酶llkar
以已知酮酸还原酶lekar的氨基酸序列(seqidno.2所示，对应核苷酸序列为seqidno.1所示)为模板经ncbi-blastp在线比对得到5种潜在的酮酸还原酶序列，分别为llkar(氨基酸序列seqidno.4所示，核苷酸序列为seqidno.3所示)、lpkar(氨基酸序列seqidno.6所示，核苷酸序列为seqidno.5所示)、lmkar(氨基酸序列seqidno.8所示，核苷酸序列为seqidno.7所示)、kokar(氨基酸序列seqidno.10所示，核苷酸序列为seqidno.9所示)和snkar(氨基酸序列seqidno.12所示，核苷酸序列为seqidno.11所示)，氨基酸序列同源性分别在84％、78％、74％、49％和49％。后续经体外合成相应的核苷酸序列并连入到表达质粒pet28b中，得到6种重组质粒pet28b-lekar、pet28b-llkar、pet28b-lpkar、pet28b-lmkar、pet28b-kokar和pet28b-snkar，分别转化到e.colibl21(de3)中，涂布在含50μg/ml卡那霉素的lb平板上，筛选得到6种重组菌e.colibl21(de3)/pet28b-lekar、e.colibl21(de3)/pet28b-llkar、e.colibl21(de3)/pet28b-lpkar、e.colibl21(de3)/pet28b-lmkar、e.colibl21(de3)/pet28b-kokar和e.colibl21(de3)/pet28b-snkar。
将6种酮酸还原酶重组菌及葡糖糖脱氢酶重组菌e.colibl21(de3)/pet28b-gdh(gdh基因核苷酸序列为seqidno.15所示，氨基酸序列seqidno.16所示)分别接种到含50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，于37℃、150rpm条件下振荡培养8～10h，获得种子液；将种子液按2％(体积浓度)的接种量接入含50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，于37℃、150rpm条件下振荡培养至od600达到0.4～0.8(优选0.6)，加入iptg至终浓度为0.1mm，于28℃、150rpm条件下振荡培养10～12h，离心收集湿菌体并用生理盐水洗涤两次，即分别得到4种酮酸还原酶重组菌和葡糖糖脱氢酶重组菌的静息细胞。将静息细胞重悬于kh2po4-k2hpo4缓冲液(100mm，ph7.0)中，冰浴条件下超声破碎20min(破碎功率40w，工作1s，停1s)，破碎液于4℃，12000rpm下离心10min，收集上清液即为相应的粗酶液。
6种酮酸还原酶的酶活测定在1ml反应体系中进行，体系包含kh2po4-k2hpo4缓冲液(100mm，ph7.0)、苯乙酮酸(10mm)、nadh(5mm)和适量的粗酶(0.2μg)。反应体系和粗酶液分别在35℃下温育5min后，在35℃、700rpm条件下反应2min，用hcl(6.0m)终止反应。样品经离心(12000rpm、2min)、超纯水稀释2倍、0.22μm膜过滤后进行手性hplc分析。单位酶活定义(1u)：标准条件下，每min催化苯乙酮酸生成1μmol产物所需的酶量为一个单位酶活。比酶活单位：ku/mg粗酶。结果显示，6种酮酸还原酶lekar、llkar、lpkar、lmkar、kokar和snkar的比酶活分别为1.11ku/mg、3.71ku/mg、0ku/mg、3.37ku/mg、2.89ku/mg和0ku/mg，其中只有4种酮酸还原酶lekar、llkar、lmkar和kokar具有催化活性，且llkar具有最高的比酶活。
对映体过量值(e.e.)的检测在1ml反应体系中进行，体系包含kh2po4-k2hpo4缓冲液(100mm，ph7.0)、苯乙酮酸(10mm)、nadh(15mm)和合适浓度的粗酶。在35℃、700rpm条件下反应10h后用hcl(6.0m)终止反应。样品经离心(12000rpm、2min)、超纯水稀释2倍、0.22μm膜过滤后进行手性hplc分析。结果显示，4种酮酸还原酶lekar、llkar、lmkar和kokar催化苯乙酮酸生成(r)-扁桃酸的e.e.值均大于99％。
4种酮酸还原酶lekar、llkar、lmkar和kokar在高底物浓度下的进一步比较分析在10ml反应体系中进行，体系包含kh2po4-k2hpo4缓冲液(100mm，ph7.0)、苯乙酮酸(选择100mm和400mm两种浓度)、葡萄糖(浓度是苯乙酮酸的2倍，即分别为200mm和800mm)、nad+(0.5mm)、kar(酮酸还原酶，800u/ml)和gdh(葡萄糖脱氢酶，800u/ml)。在35℃、700rpm条件下反应3h后用hcl(6.0m)终止反应。样品经离心(12000rpm、2min)、超纯水稀释2倍、0.22μm膜过滤后进行手性hplc分析。反应过程中用3.0m的naoh自动控制ph在7.0。结果如图2所示，4种酮酸还原酶lekar、llkar、lmkar和kokar在催化100mm苯乙酮酸不对称还原时的转化率和e.e.值均大于99％；在催化400m苯乙酮酸不对称还原时的e.e.值均大于99％，但转化率分别为65.8％、99.2％、75.5％和86.4％。只有llkar能够同时催化100mm和400mm的苯乙酮酸完全转化为(r)-扁桃酸，转化率和e.e.值均大于99％，故选择比酶活和底物装载量最高的llkar用于构建三酶共表达重组菌e.colibl21(de3)/pet28b-hadh/pcdfduet-llkar-gdh。
手性hplc分析方法如下：反相手性柱(型号chirobiotictmr250×4.6mm，sigma，usa)，流动相为0.5％氨水:ch3oh(10:90，v/v)，检测波长为215nm，进样量3μl。
e.e.值的计算方法：ee(％)＝(r-s)/(r+s)×100％。式中r表示反应结束后(r)-2-羟酸的浓度，s表示反应结束后(s)-2-羟酸的浓度。
实施例2：构建重组菌e.colibl21(de3)/pet28b-hadh/pcdfduet-llkar-gdh
将来源于exiguobacteriumsibiricum(wp_012369122.1)的葡萄糖脱氢酶(gdh)基因(核苷酸序列为seqidno.15所示，氨基酸序列seqidno.16所示)经体外合成相应的核苷酸序列并连入到表达质粒pet28b中，得到重组质粒pet28b-gdh，转化到e.colibl21(de3)中，涂布在含50μg/ml卡那霉素的lb平板上，筛选重组菌e.colibl21(de3)/pet28b-gdh。
借助无缝克隆试剂盒(
将来源于pseudomonasaeruginosa(agm49308.1)的2-羟酸脱氢酶(hadh)基因(核苷酸序列为seqidno.13所示，氨基酸序列seqidno.14所示)经体外合成相应的核苷酸序列并连入到表达质粒pet28b中，得到重组质粒pet28b-hadh，转化到e.colibl21(de3)中，涂布在含50μg/ml卡那霉素的lb平板上，筛选重组菌e.colibl21(de3)/pet28b-hadh。
分别从重组菌e.colibl21(de3)/pet28b-hadh和e.colibl21(de3)/pcdfduet-llkar-gdh中提取质粒pet28b-hadh和pcdfduet-llkar-gdh，按1:1的摩尔浓度比混匀后，共同转化到e.colibl21(de3)中，涂布在含50μg/ml卡那霉素和50μg/ml链霉素的双抗lb平板上，筛选到同时含hadh、llkar和gdh基因的重组菌e.colibl21(de3)/pet28b-hadh/pcdfduet-llkar-gdh，缩写为e.coli(hadh-llkar-gdh)。同样方法构建重组菌e.coli(hadh-lekar-gdh)。
重组质粒和重组菌的构建如图3所示。
实施例3：诱导重组菌e.colibl21(de3)/pcdfduet-llkar-gdh双酶共表达
将重组大肠杆菌e.colibl21(de3)/pcdfduet-llkar-gdh接种到含50μg/ml链霉素的lb液体培养基中，于37℃、150rpm条件下振荡培养8～10h，获得种子液；将种子液按2％(体积浓度)的接种量接入含50μg/ml链霉素的lb液体培养基中，于37℃、150rpm条件下振荡培养至od600达到0.6，加入iptg至终浓度为0.1mm，于28℃、150rpm条件下振荡培养10～12h，离心收集湿菌体并用生理盐水洗涤两次，即得e.colibl21(de3)/pcdfduet-llkar-gdh的静息细胞。以未诱导的e.colibl21(de3)/pcdfduet-llkar-gdh作为对照，进行sds-page蛋白电泳分析，结果如图4所示，可以看出经iptg诱导后在32kda和28kda附近各出现一条明显的条带，与llkar和gdh的理论蛋白分子量大小一致，证明重组菌e.colibl21(de3)/pcdfduet-llkar-gdh构建成功。
实施例4：诱导重组菌e.coli(hadh-llkar-gdh)三酶共表达
将重组大肠杆菌e.coli(hadh-llkar-gdh)接种到含50μg/ml卡那霉素和50μg/ml链霉素的lb液体培养基中，于37℃、150rpm条件下振荡培养8～10h，获得种子液；将种子液按2％(体积浓度)的接种量接入含50μg/ml卡那霉素和50μg/ml链霉素的lb液体培养基中，于37℃、150rpm条件下振荡培养至od600达到0.6，加入iptg至终浓度为0.1mm，于28℃、150rpm条件下振荡培养10～12h，离心收集湿菌体并用生理盐水洗涤两次，即得e.coli(hadh-llkar-gdh)的静息细胞。以未诱导的e.coli(hadh-llkar-gdh)作为对照，进行sds-page蛋白电泳分析，结果如图4所示，可以看出经iptg诱导后在41kda、32kda和28kda附近分别出现一条明显的条带，与hadh、llkar和gdh的理论蛋白分子量大小一致，证明重组菌e.coli(hadh-llkar-gdh)构建成功。同样方法制备重组菌e.coli(hadh-lekar-gdh)静息细胞。
实施例5：重组菌e.coli(hadh-llkar-gdh)催化条件优化
通过实施例4的方法，获得重组菌e.coli(hadh-llkar-gdh)的静息细胞，设计优化反应体系为10ml：选择终浓度为20mm的外消旋邻氯扁桃酸为底物，考察菌体浓度4g/l、8g/l、12g/l(以干菌重计)，辅底物葡萄糖浓度10mm、20mm、30mm，反应介质kh2po4-k2hpo4缓冲液ph6.0、7.0、8.0，温度25℃、30℃、35℃等因素对反应的影响。700rpm下反应2h后用hcl(6.0m)终止反应，样品采用实施例1中的手性hplc方法进行检测分析，以目标产物收率为评价指标，结果如下表：
表1
结果表明重组菌e.coli(hadh-llkar-gdh)催化20mm外消旋芳香2-羟酸去消旋化时，菌体浓度以干菌重计优选8g/l，辅底物浓度优选20mm，反应介质优选ph7.0的kh2po4-k2hpo4缓冲液，温度优选30℃。
实施例6：重组菌e.coli(hadh-llkar-gdh)催化外消旋芳香2-羟酸的去消旋化
反应在10ml的转化体系中进行，体系包含kh2po4-k2hpo4缓冲液(100mm，ph7.0)、外消旋芳香2-羟酸(终浓度20mm，结构见图1和表2)、葡萄糖(终浓度20mm)、通过实施例4获取的三酶共表达重组菌(用量以菌体干重计为8g/l)。反应在30℃、700rpm条件下反应4h，每隔1h定时取样，样品用hcl(6.0m)终止反应，经离心(12000rpm、2min)、超纯水稀释4倍、0.22μm膜过滤后采用实施例1中的手性hplc方法进行检测分析。结果如下表：
表2
催化结果显示，大多数外消旋芳香2-羟酸(1a-1m)经过2h的反应，均被高效地转化为相应的芳香(r)-2-羟酸，收率大于98％，e.e.值大于99％。即使外消旋芳香2-羟酸(1f-1h,1i-1k)在苯环上存在邻位、间位或对位取代，产生的立体效应却并未影响整体的催化效率。对于外消旋芳香2-羟酸(1n-1q)，由于反应结束后有少量(s)-2-羟酸未转化完全或有少量中间体酮酸积累，导致收率相对偏低，但也均达到80％以上。而对于外消旋芳香2-羟酸(1r-1t)，该三酶共表达体系基本上不具有催化活性。整体而言，由于挖掘到了一种高效的酮酸还原酶llkar，并发现其能够有效地催化芳香族2-酮酸转化为手性芳香2-羟酸，将其与hadh和gdh偶联构建单菌双质粒三酶共表达氧化还原级联体系，从而实现了对大多数外消旋芳香2-羟酸的高效去消旋化，在实际生产中具有重要的应用价值。
实施例7：重组菌e.coli(hadh-llkar-gdh)催化200mm邻氯扁桃酸去消旋化
反应在20ml的转化体系中进行，体系包含kh2po4-k2hpo4缓冲液(100mm，ph7.0)、外消旋邻氯扁桃酸(终浓度200mm)、葡萄糖(终浓度200mm)、通过实施例4获取的三酶共表达重组菌(用量以菌体干重计为20g/l)。反应在30℃、700rpm条件下反应20h，每隔2h定时取样，样品用hci(6.0m)终止反应，经离心(12000rpm、2min)、稀释、过膜后采用实施例1中的hplc方法进行检测分析。反应过程中用3.0m的naoh自动控制ph在7.0，反应完全后得到含有(r)-邻氯扁桃酸的转化液。催化反应进程如图6所示，200mm的外消旋邻氯扁桃酸在16h时被完全转化为光学纯(r)-邻氯扁桃酸，收率和e.e.值均大于99％，空时得率高达55.9g/(l·d)。
同样条件下，以实施例4方法获得的重组菌e.coli(hadh-lekar-gdh)为催化剂，结果为：e.coli(hadh-lekar-gdh)在催200mm外消旋邻氯扁桃酸去消旋时，因中间体酮酸大量积累，反应直至22h，外消旋邻氯扁桃酸仍不能完全转化为(r)-邻氯扁桃酸，结果如图5所示。
实施例8：重组菌e.coli(hadh-llkar-gdh)催化300mm邻氯扁桃酸去消旋化
反应在20ml的转化体系中进行，体系包含kh2po4-k2hpo4缓冲液(100mm，ph7.0)、外消旋邻氯扁桃酸(100mm)、葡萄糖(100mm)、通过实施例4获取的三酶共表达重组菌(用量以菌体干重计为20g/l)。反应在30℃、700rpm条件下开始后，每隔4h补加一次外消旋邻氯扁桃酸(100mm)和葡萄糖(100mm)，共补加2次。反应每隔1h定时取样，样品用hci(6.0m)终止反应，经离心(12000rpm、2min)、稀释、过膜后采用实施例1中的hplc方法进行检测分析。反应过程中用3.0m的naoh自动控制ph在7.0，反应完全后得到含有(r)-邻氯扁桃酸的转化液。催化反应进程如图7所示，最终300mm的外消旋邻氯扁桃酸在16h时被完全转化为光学纯(r)-邻氯扁桃酸，收率和e.e.值均大于99％，空时得率高达83.8g/(l·d)。(r)-邻氯扁桃酸是抗血栓药(氯吡格雷)合成的重要手性砌块，因此该催化反应具有重大的应用价值。
序列表
<110>浙江工业大学
<120>酮酸还原酶、基因、工程菌及在合成手性芳香2-羟酸中的应用
<160>16
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>954
<212>dna
<213>肠膜明串珠菌(leuconostocmesenteroides)
<400>1
atgaaaatcgcaattgccggtttcggtgctctgggcgcacgtctgggcgtgatgctgcaa60
gccggtggtcatgaagtcaccggtattgacggttggccggcacacatcgctgctatcaac120
accaaaggcctgaccgttgttaaagacaacgatgcaccgcagaaatacttcgtacctgta180
atgccagcttctgaggttactggcactttcgatctgatcatcctgctgaccaaaacccct240
caactggaccgcatgctgactgatatccagccaatcattactgatactactaaactgctg300
gttctgtctaacggtctgggtaacatcgaagtgatggctaaacacgtgtcccgccaccag360
atcctggccggcgttacgctgtggacctcttctctgatcaaaccgggtgaaatccacgta420
accggttctggctctatcaaactgcaggctatcggtgacgcagacgtacagtctattgct480
gacgccctgaaccaggcaggtctgaacgctgaaatcactcctgacgtcatgacggctatc540
tggcataaagcgggcatcaacgcggtactgaacccgctgtccgtactgctgaatgcgaac600
attgctgaattcggcaccgcgggtaacgcgatggatctggctctgaacatcctggacgaa660
atgaaacaggtaggcgcttctcagggtatcaaagtcgacgtaagcggtatcatgacggac720
ctgtcccagctgctgaagccggaaaatgctggcaaccactttccgtctatgtatcaagac780
attcagaacggtaaacgtaccgagatcgacttcctgaacggctacttcgcgaagattggc840
cacgaatccggtatcccgactccgttcaacgcactggttacgcgtctgatccacgctaaa900
gaggacatcgaacgcgttaaactggcgaaacagcaagagaacttcgagatctga954
<210>2
<211>317
<212>prt
<213>肠膜明串珠菌(leuconostocmesenteroides)
<400>2
metlysilealailealaglypheglyalaleuglyalaargleugly
151015
valmetleuglnalaglyglyhisgluvalthrglyileaspglytrp
202530
proalahisilealaalaileasnthrlysglyleuthrvalvallys
354045
aspasnaspalaproglnlystyrphevalprovalmetproalaser
505560
gluvalthrglythrpheaspleuileileleuleuthrlysthrpro
65707580
glnleuaspargmetleuthraspileglnproileilethraspthr
859095
thrlysleuleuvalleuserasnglyleuglyasnilegluvalmet
100105110
alalyshisvalserarghisglnileleualaglyvalthrleutrp
115120125
thrserserleuilelysproglygluilehisvalthrglysergly
130135140
serilelysleuglnalaileglyaspalaaspvalglnserileala
145150155160
aspalaleuasnglnalaglyleuasnalagluilethrproaspval
165170175
metthralailetrphislysalaglyileasnalavalleuasnpro
180185190
leuservalleuleuasnalaasnilealaglupheglythralagly
195200205
asnalametaspleualaleuasnileleuaspglumetlysglnval
210215220
glyalaserglnglyilelysvalaspvalserglyilemetthrasp
225230235240
leuserglnleuleulysprogluasnalaglyasnhispheproser
245250255
mettyrglnaspileglnasnglylysargthrgluileasppheleu
260265270
asnglytyrphealalysileglyhisgluserglyileprothrpro
275280285
pheasnalaleuvalthrargleuilehisalalysgluaspileglu
290295300
argvallysleualalysglnglngluasnphegluile
305310315
<210>3
<211>954
<212>dna
<213>乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)
<400>3
atgaaaatcgctatcgctggtttcggtgctctgggtgctcgtctgggtatcatgctgcag60
gctgctggtcacgacgttaccggtatcgacggttggccggctcacatcgctgctatcaac120
accaaaggtctgaccgttgttcacgacgaccaggacccgaaagtttactacctgccggtt180
atgaccccgcaggaagttaccggtaccttcgacctgatcatcctgctgaccaaaaccccg240
cagctggaccgtatgctgaccgacatcgctccgatcatcaccgaccagacccagctgctg300
atcctgtctaacggtctgggtaacatcgaagttatggctaaacacgttgctaaatctcag360
atcgttgctggtgttaccctgtggacctcttctctggttaaaccgggtgaaatccacacc420
accggttctggttctatcaaactgcaggctctggctggtggtgacgctcagccgatcgtt480
gaagctctgaacgaagctggtctgaacgctgaactggttccggacgttatgaccgctatc540
tggcacaaagctggtatcaacgctgttctgaacccgctgtctgttctgctggacgctaac600
atcgctgaattcggtaccgctggtaacgctatggacatggctctgaacatcctggacgaa660
atgaaacaggttggtgcttctcagggtatcaaagttgacgttgctggtatcatcgctgac720
ctgtctcgtctgctgaaaccggaaaacgctggtaaccactacccgtctatgtaccaggac780
atccagaacggtaaacgtaccgaaatcgacttcctgaacggttacttcgctcgtctgggt840
cagcaggaaggtatcccgaccccgttcaacgctctggttacccgtctgatccacgctaaa900
gaagacatcgttcgtaccaaactggctaaagaaaaagaaaacttcgaaatctaa954
<210>4
<211>317
<212>prt
<213>乳酸明串珠菌(leuconostoclactis)
<400>4
metlysilealailealaglypheglyalaleuglyalaargleugly
151015
ilemetleuglnalaalaglyhisaspvalthrglyileaspglytrp
202530
proalahisilealaalaileasnthrlysglyleuthrvalvalhis
354045
aspaspglnaspprolysvaltyrtyrleuprovalmetthrprogln
505560
gluvalthrglythrpheaspleuileileleuleuthrlysthrpro
65707580
glnleuaspargmetleuthraspilealaproileilethraspgln
859095
thrglnleuleuileleuserasnglyleuglyasnilegluvalmet
100105110
alalyshisvalalalysserglnilevalalaglyvalthrleutrp
115120125
thrserserleuvallysproglygluilehisthrthrglysergly
130135140
serilelysleuglnalaleualaglyglyaspalaglnproileval
145150155160
glualaleuasnglualaglyleuasnalagluleuvalproaspval
165170175
metthralailetrphislysalaglyileasnalavalleuasnpro
180185190
leuservalleuleuaspalaasnilealaglupheglythralagly
195200205
asnalametaspmetalaleuasnileleuaspglumetlysglnval
210215220
glyalaserglnglyilelysvalaspvalalaglyileilealaasp
225230235240
leuserargleuleulysprogluasnalaglyasnhistyrproser
245250255
mettyrglnaspileglnasnglylysargthrgluileasppheleu
260265270
asnglytyrphealaargleuglyglnglngluglyileprothrpro
275280285
pheasnalaleuvalthrargleuilehisalalysgluaspileval
290295300
argthrlysleualalysglulysgluasnphegluile
305310315
<210>5
<211>954
<212>dna
<213>假肠膜明串珠菌(leuconostocpseudomesenteroides)
<400>5
atgaaaattgcaattgcgggttttggtgcattgggtgcgcgagttggtgtaatgttgcaa60
cgcgctggtcatgatgtaactggtatagatggctgggcagaacacattgcagcaatcaac120
actaagggattgactgtgacagaggatgacgggtcatctaaaaaatattttattccagtc180
atgacatccaaagaagttactggtgaatttgatttggtgattttattgacgaaaacgcca240
caattggatcgtatgttaactgatattcaaccgcttatcacaaaacaaacgcagttatta300
gtcttgtcaaatggactaggtaatgttgaagtaatggcaaagcatgtgtcatcacaacaa360
attattgctggggtaactttgtggacatctgatttggttcaacctggtgaaattcatgtg420
accggtacaggctccatcaagttgcaagcgattgatcacgcagatattaccgctgttgtc480
actgctttgaatgaagcagggcttaatgctgaggtatccgataatgttgtagaagctatt540
tggcataaagcgggcattaattctgtccttaacccattgacagtcttacttgatgctaat600
attgctgaatttggcacagcagggaatggtatggatcttgcattgaacattttagatgag660
attaagcaagttggtgacgtggctggcgttaatgtcgatgtgaatagtattttaagcgat720
ttgtcgaatttgctaaaaccagaaaacgcgggtaatcactacccatcaatgtaccaagat780
attcaagctggtaaacgaactgaaatcgactttttgaatggctattttgctaaattggga840
cgtgaaaatcatatcgccacaccttttaatgcacttgtaacacgattaattcatgcaaaa900
gaagatattgaacgtgttaaattggccaaacaacaagaaacctttgaaatttga954
<210>6
<211>317
<212>prt
<213>假肠膜明串珠菌(leuconostocpseudomesenteroides)
<400>6
metlysilealailealaglypheglyalaleuglyalaargvalgly
151015
valmetleuglnargalaglyhisaspvalthrglyileaspglytrp
202530
alagluhisilealaalaileasnthrlysglyleuthrvalthrglu
354045
aspaspglyserserlyslystyrpheileprovalmetthrserlys
505560
gluvalthrglyglupheaspleuvalileleuleuthrlysthrpro
65707580
glnleuaspargmetleuthraspileglnproleuilethrlysgln
859095
thrglnleuleuvalleuserasnglyleuglyasnvalgluvalmet
100105110
alalyshisvalserserglnglnileilealaglyvalthrleutrp
115120125
thrseraspleuvalglnproglygluilehisvalthrglythrgly
130135140
serilelysleuglnalaileasphisalaaspilethralavalval
145150155160
thralaleuasnglualaglyleuasnalagluvalseraspasnval
165170175
valglualailetrphislysalaglyileasnservalleuasnpro
180185190
leuthrvalleuleuaspalaasnilealaglupheglythralagly
195200205
asnglymetaspleualaleuasnileleuaspgluilelysglnval
210215220
glyaspvalalaglyvalasnvalaspvalasnserileleuserasp
225230235240
leuserasnleuleulysprogluasnalaglyasnhistyrproser
245250255
mettyrglnaspileglnalaglylysargthrgluileasppheleu
260265270
asnglytyrphealalysleuglyarggluasnhisilealathrpro
275280285
pheasnalaleuvalthrargleuilehisalalysgluaspileglu
290295300
argvallysleualalysglnglngluthrphegluile
305310315
<210>7
<211>954
<212>dna
<213>肠膜明串珠菌(leuconostocmesenteroides)
<400>7
atgaaaatcgctatcgctggtttcggtgctctgggtgctcgtgttggtgttatgctgcag60
caggctggtcacgaagttaccggtatcgacggttgggctgctcacatcgctgctatctct120
accgacggtctgaccgttcaccaggacgacggtgctaccaaaaaatactacatcccggtt180
atgaccgctaaagaaatcgacggtaaattcgacctgatcatcctgctgaccaaaaccccg240
cagctggacatgatgctgaccgacatcaaacacatcatcaccaaaaacaccaaactgctg300
gttctgtctaacggtctgggtaacatcgaagttatggaaaaacacgttaaccgtaaccag360
atcctggctggtgttaccctgtggacctctgaactgatcaacccgggtgaaatccgtgtt420
accggtaccggttctatcaaactgcaggctatcggtgaagctaacgctaagccaatcgta480
agcgctctgaacaaagctggtctgaacgttaccctgtctcagaacgttatcgaagctatc540
tggcacaaagctggtatcaactctgttctgaacccgctgaccgttctgctggacgctaac600
atcgctgaattcggtatggctggtaacggtatggacctgtctctgaacatcctggacgaa660
atcaaaaaaatcggtgaactggaaggtatcaacgttgacgttaacgctatcatgaaagac720
ctggctctgctgatccgtccggaaaacgctggtaaccactacccgtctatgtaccaggac780
atcaaagctggtaaacacaccgaaatcgacttcctgaacggttacttcgctaaactgggt840
tctgaacacgacgttgctatgccgttcaacgctctggttacccgtctgatccacgctaaa900
gaagacatcgaacgtaccaaactggctaaaaaacaggaaaccttcgaaatctaa954
<210>8
<211>317
<212>prt
<213>肠膜明串珠菌(leuconostocmesenteroides)
<400>8
metlysilealailealaglypheglyalaleuglyalaargvalgly
151015
valmetleuglnglnalaglyhisgluvalthrglyileaspglytrp
202530
alaalahisilealaalaileserthraspglyleuthrvalhisgln
354045
aspaspglyalathrlyslystyrtyrileprovalmetthralalys
505560
gluileaspglylyspheaspleuileileleuleuthrlysthrpro
65707580
glnleuaspmetmetleuthraspilelyshisileilethrlysasn
859095
thrlysleuleuvalleuserasnglyleuglyasnilegluvalmet
100105110
glulyshisvalasnargasnglnileleualaglyvalthrleutrp
115120125
thrsergluleuileasnproglygluileargvalthrglythrgly
130135140
serilelysleuglnalaileglyglualaasnalalysproileval
145150155160
seralaleuasnlysalaglyleuasnvalthrleuserglnasnval
165170175
ileglualailetrphislysalaglyileasnservalleuasnpro
180185190
leuthrvalleuleuaspalaasnilealaglupheglymetalagly
195200205
asnglymetaspleuserleuasnileleuaspgluilelyslysile
210215220
glygluleugluglyileasnvalaspvalasnalailemetlysasp
225230235240
leualaleuleuileargprogluasnalaglyasnhistyrproser
245250255
mettyrglnaspilelysalaglylyshisthrgluileasppheleu
260265270
asnglytyrphealalysleuglysergluhisaspvalalametpro
275280285
pheasnalaleuvalthrargleuilehisalalysgluaspileglu
290295300
argthrlysleualalyslysglngluthrphegluile
305310315
<210>9
<211>918
<212>dna
<213>产酸克雷伯菌(klebsiellaoxytoca)
<400>9
atgaaaatcgctatcgctggtgctggtgctatgggttgccgtttcggttacatgctgctg60
ggtgctggtcacgacgttaccctgatcgacggttggcacgaacacgttaacgctatctgc120
tctaacggtctgttcgttgaaaccgaagtttctcagcagtactacccgatcccggctatg180
ctggctgacgaatctcagggtgaattcgaactgatcatcctgttcaccaaagctatgcag240
ctggaccgtatgctgcagcacatcaaaccgctgctgccggctgctaaagttgttatgatc300
ctgtctaacggtctgggtaacatcgaaaccctggaaaaatacgttgaccgtcagaaaatc360
tacgctggtgttaccctgtggtcttctgaactggaaggtccgggtcacatcatggctacc420
ggtaccggtaccatcgaactgcagccggttgcttctcaggacgctgctctggaagaaaac480
atcgttgctgttctgaactctgctggtctgaacgctgaaatctctccggacgttctgctg540
tctatctggaaaaaagctgctttcaactctgttatgaacacctactgcgctctgctggac600
tgcaacgttggtggtttcggtcagctgccgggtgctctggacctggctcaggctgttgtt660
gacgaattcgttctggttgctgcttctcagaacatcccgctgtctggtgaacgtgttatg720
aacaccgttaaaaaagttttcgacccgcgtgaatctggtcaccactacccgtctatgtac780
caggacctgcagaaaggtcgtctgaccgaaatcgactacctgaacggtgctatcgctcgt840
atcggtatgcagaacaacatcccggttccggttaacaccctgctgacccagctgatccac900
gctaaagaagctcagtaa918
<210>10
<211>305
<212>prt
<213>产酸克雷伯菌(klebsiellaoxytoca)
<400>10
metlysilealailealaglyalaglyalametglycysargphegly
151015
tyrmetleuleuglyalaglyhisaspvalthrleuileaspglytrp
202530
hisgluhisvalasnalailecysserasnglyleuphevalgluthr
354045
gluvalserglnglntyrtyrproileproalametleualaaspglu
505560
serglnglygluphegluleuileileleuphethrlysalametgln
65707580
leuaspargmetleuglnhisilelysproleuleuproalaalalys
859095
valvalmetileleuserasnglyleuglyasnilegluthrleuglu
100105110
lystyrvalaspargglnlysiletyralaglyvalthrleutrpser
115120125
sergluleugluglyproglyhisilemetalathrglythrglythr
130135140
ilegluleuglnprovalalaserglnaspalaalaleuglugluasn
145150155160
ilevalalavalleuasnseralaglyleuasnalagluileserpro
165170175
aspvalleuleuseriletrplyslysalaalapheasnservalmet
180185190
asnthrtyrcysalaleuleuaspcysasnvalglyglypheglygln
195200205
leuproglyalaleuaspleualaglnalavalvalaspglupheval
210215220
leuvalalaalaserglnasnileproleuserglygluargvalmet
225230235240
asnthrvallyslysvalpheaspproarggluserglyhishistyr
245250255
prosermettyrglnaspleuglnlysglyargleuthrgluileasp
260265270
tyrleuasnglyalailealaargileglymetglnasnasnilepro
275280285
valprovalasnthrleuleuthrglnleuilehisalalysgluala
290295300
gln
305
<210>11
<211>918
<212>dna
<213>肠道沙门氏菌(salmonellaenterica)
<400>11
atgaaaattgcaatcgcaggtgcaggcgctatggggtgtcgttttggctatatgctgctg60
gaggccgggcacgacgtgacgcttatcgatagctggcaggagcatgtcgacgctattcgt120
agcaaggggttgtttgtcgaaacggaaacgacgcagaagtattaccccatccctgctatg180
ttggctgatgaatcccagggggagtttgagctggttattctgtttaccaaagccatgcag240
ttggatagcatgttacagcgtatcaagccattactgccagccgcgaaagtcgtgatgatt300
ctatctaacggtctgggaaatattgaaacgctggagaaatatgtcgatcggcataaaatc360
tatgcgggtgtgacgttatggtccagcgaactggagggggctgggcatattatggccacc420
ggtaccggaacgattgaactgcagccgattgccagccaggattcggctcaagaggctaag480
gtcattgccacccttaatagcgctggattgaatgctgaaataagccctgacgtattatta540
tcgatctggaagaaagcagcctttaatagcgtaatgaacacctattgcgcgctactggat600
tgtaatatcggcggatttggtcagcggcctggtgctttagatttagcgcaagccgtagtt660
gatgagtttgtgttagttgctgccagccagaatatttcgttgactgagcaaatggtgatg720
aatacggtgaagaaagtgttcgatccgcgtgagagcggccaccactatccttctatgcat780
caggatttacataaaggccgactgactgaaatcgactatttaaatggtgcgattgcgcga840
atcggcgttcagaacaatattgccgtaccggttaacacactcctgacgcaattgattcac900
gctaaagaagcgcaataa918
<210>12
<211>305
<212>prt
<213>肠道沙门氏菌(salmonellaenterica)
<400>12
metlysilealailealaglyalaglyalametglycysargphegly
151015
tyrmetleuleuglualaglyhisaspvalthrleuileaspsertrp
202530
glngluhisvalaspalaileargserlysglyleuphevalgluthr
354045
gluthrthrglnlystyrtyrproileproalametleualaaspglu
505560
serglnglygluphegluleuvalileleuphethrlysalametgln
65707580
leuaspsermetleuglnargilelysproleuleuproalaalalys
859095
valvalmetileleuserasnglyleuglyasnilegluthrleuglu
100105110
lystyrvalasparghislysiletyralaglyvalthrleutrpser
115120125
sergluleugluglyalaglyhisilemetalathrglythrglythr
130135140
ilegluleuglnproilealaserglnaspseralaglnglualalys
145150155160
valilealathrleuasnseralaglyleuasnalagluileserpro
165170175
aspvalleuleuseriletrplyslysalaalapheasnservalmet
180185190
asnthrtyrcysalaleuleuaspcysasnileglyglypheglygln
195200205
argproglyalaleuaspleualaglnalavalvalaspglupheval
210215220
leuvalalaalaserglnasnileserleuthrgluglnmetvalmet
225230235240
asnthrvallyslysvalpheaspproarggluserglyhishistyr
245250255
prosermethisglnaspleuhislysglyargleuthrgluileasp
260265270
tyrleuasnglyalailealaargileglyvalglnasnasnileala
275280285
valprovalasnthrleuleuthrglnleuilehisalalysgluala
290295300
gln
305
<210>13
<211>1188
<212>dna
<213>铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)
<400>13
atgtctcagaacctgttcaacgttgaagactaccgtaaactggctcagaaacgtctgccg60
aaaatggtttacgactacctggaaggtggtgctgaagacgaatacggtgttaaacacaac120
cgtgacgttttccagcagtggcgtttcaaaccaaagaggttagttgacgtatcgcgtcgt180
tctctgcaggctgaagttctgggtaaacgtcagtctatgccgctgctgatcggtccgacc240
ggtctgaacggtgctctgtggccgaaaggtgacctggctctggctcaggctgctaccaaa300
gctggtatcccgttcgttctgtctaccgcttctaacatgtctatcgaagacctggctcgt360
cagtgcgacggtgacctgtggttccagctgtacgttatccaccgtgaaatcgctcagggt420
atggttctgaaagctctgcactctggttacaccaccctggttctgaccaccgacgttgct480
gttaacggttaccgtgaacgtgacctgcacaaccgtttcaaaatgccgatgtcttacacc540
ccgaaagttatgctggacggttgcctgcacccgcgttggtctctggacctggttcgtcac600
ggtatgccgcagctggctaacttcgtttcttctcagacctcttctctggaaatgcaggct660
gctctgatgtctaggcagatggacgctagcttcaactgggaagcgctgcgttggctgcgt720
gacctgtggccgcacaaactgctggttaaaggtctgctgtctgctgaagacgctgaccac780
tgcatcgctgaaggtgctgacggtgttatcctgtctaaccacggtggtcgtcagctggac840
tgcgctgtttctccgatggaagttctggctcagtctgttgctaaaaccggtaaaccggtt900
ctgatcgactctggtttccgtcgtggttctgacatcgttaaagctctggctctgggtgct960
gaagctgttctgctgggtcgtgctaccctgtacggtctggctgctcgtggtgaaaccggt1020
gttgacgaagttctgaccctgctgaaagctgacatcgaccgtaccctggctcagatcggt1080
tgcccggacatcacctctctgtctccggactacctgcagtctgaaggtgttacctctacc1140
gctccggttgaccacctgatcggtaaaggtacccacgctctcgagtga1188
<210>14
<211>395
<212>prt
<213>铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)
<400>14
metserglnasnleupheasnvalgluasptyrarglysleualagln
151015
lysargleuprolysmetvaltyrasptyrleugluglyglyalaglu
202530
aspglutyrglyvallyshisasnargaspvalpheglnglntrparg
354045
phelysprolysargleuvalaspvalserargargserleuglnala
505560
gluvalleuglylysargglnsermetproleuleuileglyprothr
65707580
glyleuasnglyalaleutrpprolysglyaspleualaleualagln
859095
alaalathrlysalaglyileprophevalleuserthralaserasn
100105110
metserilegluaspleualaargglncysaspglyaspleutrpphe
115120125
glnleutyrvalilehisarggluilealaglnglymetvalleulys
130135140
alaleuhisserglytyrthrthrleuvalleuthrthraspvalala
145150155160
valasnglytyrarggluargaspleuhisasnargphelysmetpro
165170175
metsertyrthrprolysvalmetleuaspglycysleuhisproarg
180185190
trpserleuaspleuvalarghisglymetproglnleualaasnphe
195200205
valserserglnthrserserleuglumetglnalaalaleumetser
210215220
argglnmetaspalaserpheasntrpglualaleuargtrpleuarg
225230235240
aspleutrpprohislysleuleuvallysglyleuleuseralaglu
245250255
aspalaasphiscysilealagluglyalaaspglyvalileleuser
260265270
asnhisglyglyargglnleuaspcysalavalserprometgluval
275280285
leualaglnservalalalysthrglylysprovalleuileaspser
290295300
glypheargargglyseraspilevallysalaleualaleuglyala
305310315320
glualavalleuleuglyargalathrleutyrglyleualaalaarg
325330335
glygluthrglyvalaspgluvalleuthrleuleulysalaaspile
340345350
aspargthrleualaglnileglycysproaspilethrserleuser
355360365
proasptyrleuglnsergluglyvalthrserthralaprovalasp
370375380
hisleuileglylysglythrhisalaleuglu
385390395
<210>15
<211>786
<212>dna
<213>西伯利亚微杆菌(exiguobacteriumsibiricum)
<400>15
atgtataattctctgaaaggcaaagtcgcgattgttactggtggtagcatgggcattggc60
gaagcgatcatccgtcgctatgcagaagaaggcatgcgcgttgttatcaactatcgtagc120
catccggaggaagccaaaaagatcgccgaagatattaaacaggcaggtggtgaagccctg180
accgtccagggtgacgtttctaaagaggaagacatgatcaacctggtgaaacagactgtt240
gatcacttcggtcagctggacgtctttgtgaacaacgctggcgttgagatgccttctccg300
tcccacgaaatgtccctggaagactggcagaaagtgatcgatgttaatctgacgggtgcg360
ttcctgggcgctcgtgaagctctgaaatacttcgttgaacataacgtgaaaggcaacatt420
atcaatatgtctagcgtccacgaaatcatcccgtggcctactttcgtacattacgctgct480
tctaagggtggcgttaaactgatgacccagactctggctatggaatatgcaccgaaaggt540
atccgcattaacgctatcggtccaggcgcgatcaacactccaattaatgcagaaaaattc600
gaggatccgaaacagcgtgcagacgtggaaagcatgatcccgatgggcaacatcggcaag660
ccagaggagatttccgctgtcgcggcatggctggcttctgacgaagcgtcttacgttacc720
ggcatcaccctgttcgcagatggtggcatgaccctgtacccgagctttcaggctggccgt780
ggttga786
<210>16
<211>261
<212>prt
<213>西伯利亚微杆菌(exiguobacteriumsibiricum)
<400>16
mettyrasnserleulysglylysvalalailevalthrglyglyser
151015
metglyileglyglualaileileargargtyralaglugluglymet
202530
argvalvalileasntyrargserhisprogluglualalyslysile
354045
alagluaspilelysglnalaglyglyglualaleuthrvalglngly
505560
aspvalserlysglugluaspmetileasnleuvallysglnthrval
65707580
asphispheglyglnleuaspvalphevalasnasnalaglyvalglu
859095
metproserproserhisglumetserleugluasptrpglnlysval
100105110
ileaspvalasnleuthrglyalapheleuglyalaargglualaleu
115120125
lystyrphevalgluhisasnvallysglyasnileileasnmetser
130135140
servalhisgluileileprotrpprothrphevalhistyralaala
145150155160
serlysglyglyvallysleumetthrglnthrleualametglutyr
165170175
alaprolysglyileargileasnalaileglyproglyalaileasn
180185190
thrproileasnalaglulysphegluaspprolysglnargalaasp
195200205
valglusermetileprometglyasnileglylysproglugluile
210215220
seralavalalaalatrpleualaseraspglualasertyrvalthr
225230235240
glyilethrleuphealaaspglyglymetthrleutyrproserphe
245250255
glnalaglyarggly
260