本发明涉及一种白细胞及血小板增多的自发贫血小鼠模型构建方法。
(二)
背景技术：
贫血属于常见的血液系统疾病，是指患者机体外周血液中含有的红细胞数量明显降低，且血红蛋白细胞值与血红细胞值与正常水平相比都较低的一种疾病。临床上贫血的致病因素较多，如患者存在免疫系统失调、长期营养不良或机体自身出现细胞性病变等。
引起贫血的类型主要有多种因素，根据生理特点主要分为两类，造血系统引起的贫血和非造血系统引起的贫血。造血系统疾病引起的贫血约占比40％-45％，主要以巨幼细胞性贫血为主，其次是急性白血病、再生障碍性贫血、慢性粒细胞白血病、多发性骨髓瘤和纯红再生障碍性贫血等。非造血系统疾病引起的，占45％-50％，以缺铁性贫血多见，其次是感染性贫血、肝肾性贫血、脾功能亢进等贫血(张立营等.500例贫血患者骨髓细胞学检查结果回顾性分析.检验医学与临床，2011,8(22):2742-2743，2745.)。另外还有一类因为β珠蛋白基因突变引起的蛋白功能异常导致的β-地中海型贫血(singerk,etal.studiesonabnormalhemoglobins.i.theirdemonstrationinsicklecellanemiaandotherhematologicdisordersbymeansofalkalidenaturation.blood,1951,6(5):413-428)。针对引起贫血原因的多样性特点，获得诱因明确的贫血模型小鼠对于药物开发具有重要意义。
借助于动物模型的间接研究，可以有意识地改变那些在自然条件下不可能或不易排除的因素，可以更准确地观察模型的实验结果并与人类疾病进行比较研究，有助于更方便、更有效地认识人类疾病的发生发展规律，研究防治措施。目前报道的贫血的模型鼠有β-地中海贫血小鼠、再生障碍型贫血和缺铁性贫血。在1983年，skow等研究人员对dba/2j雄性小鼠行腹腔注射200mg/kg的乙烷亚硝基脲(enu)进行化学诱变得到贫血型小鼠，通过分子特征经酶切提示小鼠缺失约3.3kb的dna，这段序列为β珠蛋白的调控序列和所编码序列(skowlc,etal.amousemodelforbeta-thalassemia.cell,1983,34(3):1043-052.)。后期一系列针对β珠蛋白基因改造的β-地中海贫血模型小鼠被制备出来(ciavattadj,etal.mousemodelofhumanbetazerothalassemia:targeteddeletionofthemousebetamaj-andbetamin-globingenesinembryonicstemcells.procnatlacadsciusa，1995，92(20):9259-9263.yangb,etal.amousemodelforbeta-thalassemia.procnatlacadsciusa,1995,92(25):11608-11612.)。β-地中海贫血小鼠小鼠的特点是红细胞大小不等，呈小细胞低色素性贫血，白细胞及血小板数增加，并发脾功能亢进。除了使用改造β珠蛋白基因的方法获得β-地中海贫血模型鼠外，另有学者通过各种化学试剂或者其它外界因素诱导的方法来制备其它类型的贫血模型鼠。如通过免疫介导法制备再生障碍贫血的模型，它通过对小鼠进行60co-γ射线进行照射后，尾静脉输入小鼠胸腺与淋巴结混合细胞悬液获得(赵忻等.免疫介导小鼠再障模型办法的改进.中国病理生理杂志,2002,18(6):716-717)。该模型小鼠的特点是外周血各项指标包括白细胞和红细胞均显著降低。中国协和医科大学血液学研究所赵钧铭等采用腹腔注射5-氟尿嘧啶并利用白消安蒸馏水悬液灌胃获得大鼠急性再生障碍性贫血模型(赵均铭等.5-氟尿嘧啶与白消安合用诱导建立大鼠再生障碍性贫血模型.中华血液学杂志，2011，22(4):202-204.)。此种造模小鼠各项血液学指标(白细胞、红细胞、血小板)均呈持续性减低，脾脏、淋巴结和胸腺等淋巴器官组织明显萎缩。苯肼是一种氧化损伤性溶血剂，其溶血作用起效快、作用强、重复性好、作用强度随注射剂量的加大而增强，常用于建立溶血性贫血动物模型(巩萌等.苯肼诱发昆明种小鼠溶血性贫血模型的建立.毒理学杂志,2017,31(03):172-176.)。苯肼对造血系统直接损害较小，而其引起的急性溶血性贫血又会刺激造血系统的红系造血功能，以使外周血红细胞水平恢复正常。缺铁性贫血与消化性溃疡、肿瘤、痔疮等多种疾病有关，缺铁性贫血模型被越来越多的应用于与缺铁有关疾病的研究，采用低铁饲料喂养建立缺铁性贫血模型是比较常见的方法(魏华英,等.雌性sd大鼠缺铁性贫血模型的建立.四川动物，2007(01)190-191；田婷,等.wistar大鼠缺铁性性贫血模型的建立.当代医学，2011,17(35):41-42.)。
stat3为信号转导与转录激活因子(signaltransducersandactivatorsoftranscription，stat)蛋白家族的成员，在维持胚胎干细胞的全能性及调节免疫中发挥重要作用。stat3基因敲除的小鼠可引起胚胎致死，其异常表达与多种疾病密切相关(季巾君等.stat3的功能多样性.生命科学,2014,26(07):717-724)。临床报道的贫血合并白细胞增生占很大比重，通过对stat3进行定点突变获得的白细胞及血小板增多的贫血疾病小鼠模型目前未见报道。贫血合并白细胞及血小板增多是临床比较多见的一种贫血类型，本发明中此类贫血小鼠模型的获得为此类型贫血疾病的机制研究和药物开发奠定了基础。
(三)
技术实现要素：
本发明目的是提供一种利用crispr/cas9技术，将小鼠stat3蛋白第177位和180位赖氨酸定点突变的基因修饰鼠，构建自发贫血合并白细胞及血小板升高的生理特征的小鼠模型。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种白细胞及血小板增多的自发贫血小鼠模型构建方法，所述方法是将小鼠stat3蛋白的第177位和第180位赖氨酸定点突变成精氨酸。
进一步，所述方法为：将guide-rna、cas9mrna和用于重组的oligodonordna注射到野生型小鼠受精卵中，筛选获得将小鼠stat3蛋白的第177位和第180位赖氨酸定点突变成精氨酸的阳性小鼠，通过对阳性小鼠的生理指标检测，获得白细胞及血小板增多的自发贫血小鼠模型；所述guide-rna核苷酸序列为seqidno.1、seqidno.2所示，所述oligodonordna核苷酸序列为seqidno.3所示。
本发明利用crispr/cas9技术，针对stat3基因结构寻找可以对stat3蛋白的177位和180位赖氨酸定点突变成精氨酸靶序列，根据靶序列信息设计针对该位点的guide-rna，经活性检测后，将具有活性的guide-rna和cas9体外转录成rna。通过显微注射将guide-rna、cas9mrna和用于重组的oligodonordna注射到受精卵雄原核中，供体受精卵取自c57bl/6j。选取阳性f0代小鼠与野生型c57bl/6j交配，并进一步筛选。对扩繁的小鼠进行pcr扩增和测序鉴定。对stat3-k177/180r定点突变的纯合子小鼠进行生理指标的检测。结果发现纯合子小鼠外周血白细胞数量出现显著升高，包括中性粒细胞，淋巴细胞和单核细胞均显著升高。红细胞数量显著降低，血红蛋白和红细胞平均血红蛋白含量显著降低，另外血小板表现为升高，进一步解剖发现小鼠脾脏肿大明显，红细胞染色显示纯合子小鼠红细胞形态出现异常。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
本发明通过对stat3基因进行定点突变，把stat3的177位和180位赖氨酸定点突变成精氨酸，发现小鼠表现为白细胞包括淋巴细胞、粒细胞、单核细胞均升高，血小板也表现升高，但是红细胞及血红蛋白显著降低的贫血模型。本发明中建立的该疾病小鼠模型对于研究贫血伴随白细胞及血小板升高的发生、发展机制以及开发对抗药物具有重要意义。
(四)附图说明
图1：f0代小鼠基因型鉴定，a为pcr扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后割胶回收的条带，b为阳性小鼠的测序鉴定。(wt表示野生型小鼠，mut表示突变型小鼠)。
图2：f1代小鼠基因型鉴定。(mut/mut表示突变的纯合子小鼠，mut/wt表示突变的杂合子小鼠，wt/wt表示野生型小鼠)。
图3：为子宫内发育终止的12.5天纯合子胚胎，mut/mut表示突变的纯合子小鼠，mut/wt表示突变的杂合子小鼠，wt/wt表示野生型小鼠。
图4:突变小鼠的表型观察，a为体积表型照片，b为小鼠体重统计学分析，c为小鼠表型照片，mut/mut表示突变的纯合子小鼠，mut/wt表示突变的杂合子小鼠，wt/wt表示野生型小鼠。
图5：小鼠脾脏照片(a)和脾脏指数的统计学结果(b)，mut/mut表示突变的纯合子小鼠，mut/wt表示突变的杂合子小鼠，wt/wt表示野生型小鼠。
图6:突变小鼠的血常规分析，a为外周血白细胞，中性粒细胞，淋巴细胞和单核细胞；b为红细胞，血红蛋白和红细胞，c为血小板，mut/mut表示突变的纯合子小鼠，mut/wt表示突变的杂合子小鼠，wt/wt表示野生型小鼠。
图7：突变小鼠的红细胞染色图，mut/mut表示突变的纯合子小鼠，wt/wt表示野生型小鼠。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
如未特别指明之处，可根据本领域技术人员所熟悉的《分子克隆实验指南》
((美)m.r.格林//j.萨姆布鲁克科学出版社)、(卡特莱特,e.j.转基因技术:原理与实验方案＝transgenesistechiques:principlesandprotocols:第3版:英文[m].科学出版社,2012.)等手册以及本发明所引用的参考文献中所列的方法来实施。另外，实施例中所使用的材料除有特别说明外，均可通过商业途径从市场上购买。
实施例1伴随白细胞及血小板增多的自发贫血模型小鼠(即stat3-k177/180r突变小鼠)的构建
1.crispr/cas9位点设计：利用crispr/cas9技术，针对目的基因的基因结构寻找靶序列，根据靶序列信息设计针对该位点的guide-rna，经活性检测后，将具有活性的guide-rna和cas9体外转录成rna，通过显微注射将guide-rna、cas9mrna和用于重组的oligodonordna注射到受精卵中，从后代中筛选获得基因敲除的阳性小鼠。
根据上述分析，针对小鼠突变位点所在的外显子，第6号外显子(82bp)上下游序列设计guide-rna(seqidno.1)。site1：exon6靶序列如下：(seqidno.4，下划线为突变位点，大写为exon，小写为intron)
seqidno.4：
gtaatcgggcctcacccagggagccgcgctgtgctgtgcggctgcagagtgtggtcctgcgtgcacgctttcattatcttcaaaactttcttttccctttttcccaaaggtaacctgtgttttacttctgtttttggttggtttgtttgtttaaacaggatctagaacagaaaatgaaggtggtggagaacctccaggacgactttgatttcaactacaaaaccctcaagagccaaggaggcaagcgagctgtggggacggggcagtctgtgcaaggctacgccgtgtcactgagtctcagggcctgccttccatggtaggaggaggagctgctggcccttcacgggacaatttttgcattgtttgtttttgagatgggatttgaccatgtagctctggctgaccgtgagcctacaaccatcttacttcagctctctgagtagccgggactgcaggcgcacagatggtgtagagccttgttaagaaggctgtggtgagtccctctgctcaaggagtctttcctccttcccttag
guide-rna设计如下：
guiderna#1:gcttgcctccttggctcttgagg(seqidno.1)
guiderna#2:tacaaaaccctcaagagccaagg(seqidno.2)
合成oligodonordna(seqidno.3)信息如下：
gatctagaacagaaaatgaaggtggtggagaacctccaggacgactttgatttcaactacagaaccctcaggagccaaggaggcaagcgagctgtggggacggggcagtctgtgcaagg。
2.cas9mrna和guiderna的体外转录：cas9mrna(上海吉莹生物技术有限公司，jysj-015)；guiderna使用megashortscripttmkit(invitrogentm货号am1354)进行体外转录，产物均使用megacleartmkit(invitrogentm货号am1908)纯化，相关操作步骤详见相关产品说明书。
3.cas9mrna受精卵注射：将体外转录好的guide-rna、cas9mrna和用于重组的oligodonordna混合：取25ng/μlguide-rna20μl，100ng/μlcas9mrna10μl和50ng/μloligodonordna10μl混匀，加入3mol/l乙酸钠3μl，ph值调至5.2，用无水乙醇沉淀后再用无酶水重悬成100μl体系。样品注射到受精卵雄原核中，供体受精卵取自c57bl/6j。通过受精卵雄原核注射和移植，受体个数为8，怀孕数1，怀孕率12.50％；移植卵数160，出生小鼠数47，出生率29.38％。其中阳性5只。阳性率为10.6％。
4.f0代小鼠基因组制备：f0代小鼠出生14天剪取鼠尾0.3cm，加400μl裂解液及40μl蛋白酶k(10mg/ml)，56℃消化过夜。离心取上清，两倍体积无水乙醇沉淀，75％乙醇洗涤，稍晾干后溶解于100μl纯水中，50℃烘箱帮助溶解1小时。
5.f0代小鼠基因型鉴定：以各个实验小鼠的基因组为模板使用
stat3-k177r-112：cagagaagcagcagatgttggag(seqidno.5)；
stat3-k177r-212：atggttgtaggctcacggtcag(seqidno.6)。
阳性可扩增出477bp条带，反应条件均为98℃2min变性后，98℃20s，60℃20s68℃30min，进行34个循环，68℃延伸2min，pcr体系参见takara说明书(酶加倍反应体系)。1％琼脂糖凝胶电泳后割胶回收突变体条带(图1中a)，测序鉴定突变小鼠的基因组序列中有两个a碱基突变成g碱基，则表明后期转录翻译时stat3的第177和180位的氨基酸翻译成了精氨酸(表达170位赖氨酸的三个碱基aaa突变成了aga，表达180位赖氨酸的aag突变成了agg，这样这两个位点的赖氨酸后期就变成了精氨酸)。(图1中b)。选取阳性小鼠(mut)与野生型(wt)c57bl/6j交配。
6.f1代小鼠基因组制备：f1代小鼠出生14天剪取鼠尾0.3cm，加400μl裂解液及40μl蛋白酶k(10mg/ml)，56℃消化过夜。离心取上清，两倍体积无水乙醇沉淀，75％乙醇洗涤，稍晾干后溶解于100μl纯水中，50℃烘箱帮助溶解1小时。
7.f1代小鼠基因型鉴定：以各个实验小鼠的基因组为模板使用
8.f2-f6代小鼠的扩大繁种、基因型鉴定及统计：经过f2-f6代的扩大繁种，合计统计出生小鼠178只，结果表明遗传分配不符合1:2:1的比例，纯合子小鼠比例偏少(表1)，推测有部分纯合子小鼠为胚胎致死。取怀孕12.5天的母鼠，解剖发现有孕鼠子宫内有发育缺陷的胚胎(图3)，取该孕鼠子宫内所有胚胎均提取基因组dna，经测序鉴定表明发育缺陷的胚胎为纯合子。
表1stat3-k177/180杂合小鼠后代的基因型
实施例2：stat3-k177/180r突变小鼠的的指标检测
1、突变小鼠的表型观察：对存活的发生stat3-k177/180r突变的纯合子小鼠进行观察，发现纯合子小鼠生长缓慢，体积变小(图4中a)，抽取12周龄的纯合子，杂合子和野生型小鼠各12只，并进行称重统计，表明纯合子小鼠的体重减少具有统计学意义(图4中b)，经持续观察纯合子小鼠和野生型小鼠的生长差异，发现纯合子生长到后期开始出现毛发枯黄，脱落，有的出现了毛发变白，部分甚至出现了皮肤溃烂(图4中c)。
2、突变小鼠的脾脏指数统计：随机抽取12周龄的的纯合子(mut/mut)小鼠和野生型(wt/wt)小鼠各7只进行解剖，发现纯合子小鼠脾脏肿大明显(图5中a)，脾脏指数升高并具有统计学意义(图5中b)。
3、突变小鼠的血液学指标检测：随机抽取12周龄的纯合子(mut/mut)，杂合子(mut/wt)和野生型(wt/wt)小鼠各11只进行眼底取血200ul，上13g02全自动生化分析仪(日立7020713-0002)检测小鼠外周血常规各项指标，统计发现纯合子小鼠外周血白细胞数量出现显著升高，中性粒细胞，淋巴细胞和单核细胞均显著升高(图6中a)。红细胞数量显著降低，血红蛋白和红细胞平均血红蛋白含量显著降低(图6中b)，另外血小板表现为升高(图6中c)。
4、突变小鼠的红细胞染色：抽取12周龄纯合子(mut/mut)和野生型(wt/wt)小鼠外周血，参照南京建成生物工程研究所的红细胞染色试剂盒进行wright's染色(货号d007)。结果显示纯合子小鼠红细胞形态出现异常(图7)。
序列表
<110>浙江中医药大学
<120>一种白细胞及血小板增多的自发贫血小鼠模型构建方法
<160>6
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>23
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gcttgcctccttggctcttgagg23
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