本发明涉及分子生物学及基因工程相关技术领域，涉及一种丹波黑大豆柠檬酸转运蛋白基因gmmate75及其在提高植物耐铝性中的应用。
背景技术：
铝胁迫是酸性土壤上影响作物生长的最主要的因素之一。铝作为地壳中含量最为丰富的矿质元素之一广泛分布于土壤之中。一般情况下，铝对作物的生长不会有较大的影响，但是随着ph的降低，铝会以有毒害的离子形态存在于土壤当中。当酸性土壤中al3+的浓度达到微摩尔浓度时，便会通过抑制作物根部生长的方式影响作物对水分和矿质养分的吸收，从而抑制作物的生长，导致酸性土壤上作物的大面积减产。
传统施用石灰中和酸性土壤的方法在一定程度上可以缓解土壤的酸性，从而降低铝毒毒害。但这种方法成本较高，无法大范围实施，并且只能中和表面土壤的酸性起到暂时的成效，而不能从根本上解决铝毒问题。因此，从分子水平分析酸性土壤上铝毒毒害的机理，运用基因工程相关技术培育抗铝毒农作物具有重要的理论价值和实践意义。
大部分耐铝的单子叶和双子叶植物都可以通过根系释放有机酸应对铝胁迫；植物根部分泌的有机酸能与质外体中的al3+结合为螯合态，并将其排出，从而降低或排除al的毒性；同一物种的耐铝毒品系通常比铝毒敏感品系分泌更多的有机酸。
柠檬酸转运蛋白即mate蛋白在原核生物和真核生物中都属于一个大的基因家族，通过离子电化学梯度运输次生代谢产物和毒素。高粱的sbmate基因对应于抗铝毒的主要qtl位点altsb，是经图位克隆获得的第一个mate家族的抗铝毒基因，在拟南芥中过量表达时能引起al3+激活的柠檬酸外排，同时伴随抗铝毒能力的增加。此外，hvaact1也编码mate类蛋白，在抗铝毒基因型大麦的根尖部位组成型表达，al3+能激活hvaact1外排柠檬酸，另外有10个不同的大麦品系抗铝毒的能力与其根系柠檬酸的分泌量正相关，说明hvaact1作为al3+激活的柠檬酸转运蛋白在大麦抗铝毒方面起着重要作用。小麦中一个mate基因的序列表达标签的表达与这个分离群体柠檬酸分泌的表现型相关，说明小麦中也存在类似的通过分泌柠檬酸对抗铝毒胁迫的机制。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种丹波黑大豆柠檬酸转运蛋白基因gmmate75，其核苷酸序列如seqidno:1所示，基因全长为1288bp，编码如seqidno:2所示的氨基酸序列。
本发明从耐铝性丹波黑大豆中获取柠檬酸转运蛋白基因gmmate75，通过pcr特异扩增出了该基因的完整片段；回收纯化gmmate75基因片段，将其连接至pmd18-t载体上，转化大肠杆菌dh5α，提取质粒经酶切检测后获得重组载体pmd18-t-gmmate75；通过酶切pmd18-t-gmmate75载体并与载体pentr-2b进行连接，转化大肠杆菌dh5α，并提取质粒获得入门克隆载体pentr-2b-gmmate75；通过gateway技术的lr反应把gmmate75基因亚克隆到植物表达载体pk2gw7中，获得植物表达载体pk2-35s-gmmate75，该载体含有增强型启动子，可在受体植物中过量表达目的基因。
利用根癌农杆菌介导法，首先将pk2-35s-gmmate75载体转入农杆菌感受态细胞，之后用浸染法将目的基因转入到受体烟草植株中，利用植物组织培养的方法获得过量表达该基因的转基因型植株，并通过进一步实验验证该基因是否具有提高植物抗铝毒能力的特性；结果表明过量表达该基因的烟草相对于野生型烟草有更强的耐铝毒特性。
本发明所提供的基因可提高植物对铝胁迫的抗性，同时该发明可用于植物抗铝胁迫分子机理的研究以及抗铝胁迫植物的分子育种领域。
附图说明
图1为从铝处理后的丹波黑大豆中扩增gmmate75基因片段的电泳图，图中m为dnamarker，1为gmmate75基因片段；
图2为gmmate75型烟草在铝胁迫下的根相对伸长率测定结果示意图；
图3为gmmate75型烟草经铝处理后细胞中可溶性糖含量测定结果示意图，其中a图为叶片中多糖含量，b图为根部多糖含量；
图4为gmmate75型烟草经铝处理后细胞中过氧化氢含量测定结果示意图，其中a图为叶片中过氧化氢含量，b图为根部过氧化氢含量。
具体实施方式
下面所述的实施例中的试验方法如无特殊说明均为常规方法，所用试剂如无特殊说明均为常规市售试剂以及按常规方法配置的试剂。
实施例1：gmmate75转基因烟草株系的构建
取丹波黑大豆水培幼苗，用50μmph4.5的alcl3溶液处理24h，取其叶片用异硫氰酸胍法提取总rna，采用逆转录酶m-mlv(promega)以总rna为模板合成cdna第一链，反应体系和操作过程为：取5μgtotalrna，依次加入50ngoligo（dt），2μldntp（2.5mmeach）、depc水至反应体积为14.5μl；混匀后，70℃加热变性5min后迅速在冰上冷却5min，然后依次加入4μl5×first-standbuffer、0.5μlrnasin（200u）、1μlm-mlv（200u），混匀并短时离心，42℃温浴1.5h，取出后70℃加热10min，终止反应；cdna第一链合成后置于-20℃保存备用。
以合成的cdna为模板用gmmate75特异性引物进行pcr扩增gmmate75基因；
设计特异性引物如下：
ma75-f：cgggatcccgatggacgagaatagaagttccaac，ggatcc为bamhi酶切位点；
ma75-r：ccgctcgagcggtcatttgcagtgtccttgttgctg，ctcgag为xhoi酶切位点；
pcr反应条件：95℃4min；95℃30s，54℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min；反应体系（20μl）为1μlcdna、2μl10×advantage2pcrbuffer、1.8μl50×dntpmix（10mmeach）、0.2μl正向引物（10μm）、0.2μl反向引物（10μm）、0.2μladvantage2pcrpolymerasemix、14.6μlpcr-gradewater；pcr结束后，取5μl用于琼脂糖凝胶电泳，以检测扩增产物的特异性以及大小，结果与目的基因大小相符（见图1）。
采用琼脂糖凝胶回收法获取该dna片段，连接至pmd18t克隆载体，使用的试剂盒为pmd18-tvectorkit（大连宝生物），反应体系和操作过程为：取1.5μlpcr产物，依次加入1μlpmd18-tvector（50ng/μl）和2.5μl2×ligationsolutioni，混匀后置于16℃过夜反应；采用热激转化法将连接产物转入大肠杆菌dh5α中；使用含有氨苄青霉素（ampicillin，amp）的lb固体培养基筛选阳性克隆，菌落pcr检测正确后提取质粒。
采用sanprep柱式质粒dna小量抽提试剂盒（上海生工）提取质粒，取1μl用于琼脂糖凝胶电泳以检测所提取质粒的完整性及浓度高低；用限制性内切酶（takara）对质粒pmd-18t-gmmate75和pentr-2b进行双酶切（100μl体系），反应体系和操作过程为：取20μlpmd-18t-gmmate75和pentr-2b质粒、依次加入10μl酶切缓冲液、相应内切酶各5μl、60μlddh2o，混匀后短时离心，置于37℃过夜反应；将所有酶切产物点于琼脂糖凝胶中进行电泳，然后对gmmate75片段和pentr-2b载体片段分别进行胶回收，整个过程使用sanprep柱式dna胶回收试剂盒（上海生工）；取1μl回收产物通过琼脂糖凝胶电泳检测回收片段的大小以及浓度，置于-20℃保存备用。
利用t4dnaligase（takara），将回收的gmmate75片段和pentr-2b载体片段连接起来，反应体系（20μl）和操作过程为：取10μlgmmate75dna片段依次加入2μlpentr-2b载体dna、2μl10×t4dnaligasebuffer、1μlt4dnaligase、5μlddh2o，混匀后短时离心，然后16℃水浴过夜反应；接着采用热激转化法将连接产物转入大肠杆菌dh5α中，用含有50mg/l卡那霉素（kanamycin，km）的固体培养基筛选阳性克隆；挑选单菌落摇菌，用以pcr检测，选择检测正确的样品进行测序。
测序正确的菌液进行质粒提取，与过表达载体pk2gw7进行lr反应，反应后获得重组载体pk2-35s-gmmate75的质粒，转化e.colidh5α，用含有100mg/l壮观霉素的固体培养基培养，筛选阳性克隆并进行菌落pcr检测；提取质粒转化农杆菌pmp90感受态细胞。
本实验采用的受体植物为野生型（wt）烟草（nicotianal），获取方法为将烟草种子用75%的酒精浸泡30s，用无菌水洗涤后用0.1%的hgcl2浸泡8min，然后再用无菌水洗涤若干次，播种于ms培养基上，28℃暗培养6d，发芽后转至光照培养箱（25℃，16h/d光照），以后每月用ms培养基继代一次。取wt烟草叶片，用农杆菌介导的叶盘转化法转化烟草叶片。转化后的叶片放在共培养固体培养基ms1上，避光培养24h。之后将叶片移至芽诱导固体培养基ms4上诱导其生芽，筛选标记为卡那霉素。1个月左右之后，幼芽长出。剪取长度为1-2cm的芽，移至ms培养基上进行培养，直至其长成完整的烟草幼苗。从培养好的烟草上取叶片，提取总dna，并以之为模板用gmmate75的特异性引物进行pcr鉴定，并鉴定出成功转化的烟草植株，继续培养成功转化的烟草并进行后续实验。
实施例2：gmmate75转基因烟草植株耐铝性评估
本实验主要从3个方面对烟草的耐铝性进行评估:铝处理下的相对根伸长率，铝处理后植物细胞中的可溶性糖含量以及过氧化氢（h2o2）含量。由于酸性条件下铝毒对植物的主要危害在于抑制其根部的生长，故测定相对根伸长率可表示铝毒对植物的损伤程度。可溶性糖作为植物细胞缓解渗透压的溶质，在植物细胞受损时，会产生可溶性糖来缓解细胞损伤。在达到细胞承受上限之前，细胞损伤程度与产生可溶性糖的量可视为正相关。植物组织内积累的h2o2是由一些氧化酶（主要是超氧化物歧化酶sod）催化超阳阴离子发生氧化反应而形成，其含量可以间接反映植物细胞膜脂的受损程度。
（1）烟草相对根伸长率测定
取幼根长度约为1cm的gmmate75转基因型烟草（mac），用水洗去根部的固体培养基置于自来水中培养3d后，放到0.5mmph4.5的cacl2溶液中预处理12h；之后测定烟草的根长，然后在培养溶液中加入alcl3使之浓度分别为0μm、50μm、100μm、200μm和400μm；之后分别在24h，48h和72h时测定烟草根部长度，以wt型烟草作为对照，每组实验进行三次平行实验。
根伸长（cm）=本时间测定根长-上一时间测定根长；
相对根伸长率（%）=（根伸长/0μm氯化铝处理根伸长）
通过测定结果可知，随着铝处理时间的增长以及处理浓度的升高，烟草的相对根伸长率均呈下降趋势；而gmmate75转基因型烟草无论在任何时段和处理浓度下，其相对根伸长率均明显比相应的wt型烟草高（图2），由此可知与wt型烟草相比gmmate75型烟草根部呈现出更高的对铝胁迫抗性。
（2）烟草细胞可溶性糖含量测定
取鉴定后生根后1个月左右的gmmate75型烟草，置于清水中水培一周后，加入0.5mmph4.5的cacl2溶液预处理12h，再分别加入0μm、50μm、100μm、200μm和400μm的alcl3处理24、48和72h后，取根和叶样品，样品每份1g，加液氮研磨，加入1.5ml的1mtris-hcl(ph7.4)，转移到ep管中，12000rpm离心15min，转移上清至新ep管，用于可溶性糖及h2o2含量测定；每种样品取3份测定，以wt型烟草作为对照。
可溶性糖的含量采用蒽酮比色法进行测定，以µmol·g-1fw表示。将20µl上清液加入到1ml浓度为1mg·ml-1的蒽酮溶液中，再加入180µlddh2o后，沸水浴10min后冷却至室温；625nm处测定吸光值后代入标准曲线y=0.485x+0.0118后计算可溶性糖含量（标准曲线由葡萄糖标准溶液测得）；
通过测定结果可知，铝处理后烟草可溶性糖主要产生于叶片细胞中；通过对比，wt型烟草受到铝胁迫后根和叶细胞中产生的多糖要高于gmmate75型烟草的叶片和根部细胞（图3），因此可知相较于wt型烟草，gmmate75型烟草受到铝毒的影响较小。
（3）烟草细胞h2o2含量测定
用步骤（2）中所得到的样品提取液测定h2o2含量；h2o2采用二甲酚橙法进行测定，以µmol·g-1fw表示。用ddh2o水配制试剂a(3.3mmfeso4,3.3mm(nh4)2so4,412.5mmh2so4)和试剂b(165µm二甲酚橙，165mm山梨醇)。使用前试剂a和试剂b按照1:10的比例混合构成工作试剂。此工作试剂与h2o2待测液按照2:1的比例混合，30℃金属浴30min后，测定od560值代入标准曲线y=0.26544x-0.0523计算h2o2含量变化（以h2o2标准液制作标准曲线）。
由结果可知，铝处理后烟草的根部细胞中产生h2o2较多；通过对比可知wt型烟草细胞中的h2o2含量明显高于gmmate75型烟草（图4），因此可知相较于wt型烟草，gmmate75型烟草在铝胁迫下细胞膜脂损伤较小。
序列表
<110>昆明理工大学
<120>一种丹波黑大豆柠檬酸转运蛋白基因及其应用
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1288
<212>dna
<213>丹波黑大豆(glycinemax)
<400>1
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ttcaaaggtgcaaggaatgttttcaagctggatgctctatctcgggagatattagggatt120
gcactcccctcagcactggccgtttctgctgatccaattgcttctctcatagacacagca180
ttcataggccgtttaggaccggtggaacttgcagctgctggagtttccatttctttgttt240
aaccaagcttcgaggattaccatattccctctggtcaacattaccacttcctttgtggct300
gaagaagataccattcaaaaactgaacaccaaagcagctgaaaatggtaatagtaaggcc360
aagttcggcgaaacaattatgccagaggatcatatgcttcaagacatggaaaaaggtacc420
cccaaagtgatgaatactgacgctccaacagaatttagggaagaaaaagatgaatcaaag480
gaatataatgctaccggcaacaatgacacaaatattggagatggagccaatacaatatgc540
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cttctctccttggccatgcaaggcatctttcgagggttcaaggatacaacaactccttta840
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<210>2
<211>429
<212>prt
<213>丹波黑大豆(glycinemax)
<400>2
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leuphevalphephelysglyalaargasnvalphelysleuaspala
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<212>dna
<213>人工序列(artificial)
<400>3
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<212>dna
<213>人工序列(artificial)
<400>4
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