泌尿生殖道感染病原体多联检测引物组及含有该引物组的检测装置的制作方法

文档序号:15457584发布日期:2018-09-15 01:33

本发明涉及一种泌尿生殖道感染病原体多联检测引物组及含有该引物组的检测装置,属于生物技术领域。



背景技术:

目前的研究发现,林球奈瑟菌、沙眼衣原体、解脲脲原体、人型支原体、生殖支原体是目前常见于泌尿生殖道感染病原体,与多种泌尿生殖道炎症相关,同时会导致不孕不育,影响母婴健康。这些病原体常常呈隐性感染的情况,也有研究报道存在混合感染的情况。这都给临床诊断带来很大的麻烦。而目前的实验室诊断方法主要有病原体镜检观察、培养检查、血清免疫学检测和基因诊断,其中镜检和培养法的特异性最好,但灵敏度较差,对样本的采集、保存、运输和实验条件要求高;检测周期长,部分病原体极难培养、无法质控;对混合感染患者检出率低;而免疫学检测灵敏度低,而且病原体感染具有窗口期,对于诊断无并发症的泌尿生殖道感染价值不大。基因诊断由于其高灵敏度和特异性已越来越广泛的应用于STD相关病原体的检测,但较低的检测通量限制了其在病原微生物方面的应用。这些方法在实际应用中存在一定的局限性,而恒温扩增结合微流控检测技术则具有简便、快速、高度特异的特点,克服目前目时效差,指标单一和灵敏度低等缺点,在多重病原微生物检测方面有巨大的优势。



技术实现要素:

本发明的目的是克服现有技术中存在的不足,提供一种泌尿生殖道感染病原体多联检测引物组,能够进行多联常见泌尿生殖道感染病原体检测。

本发明还提供一种含有该引物组的检测装置,实现单样品多指标同时检测,简化实验操作步骤、提高检测通量,以满足多指标快速筛查及精准检测的迫切需求。

按照本发明提供的技术方案,所述泌尿生殖道感染病原体多联检测引物组,其特征是:包括沙眼衣原体引物组、淋球菌引物组、解脲脲原体引物组、人型支原体引物组、生殖支原体引物组中的任意一组或几组以及内参引物组,其中:

所述沙眼衣原体引物组包括SEQ ID No:7所示的正向外引物CT-F3、SEQ ID No:8所示的反向外引物CT-B3、SEQ ID No:9所示的正向内引物CT-FIP、SEQ ID No:10所示的反向内引物CT-BIP、SEQ ID No:11所示的正向环引物CT-LF和SEQ ID No:12所示的反向环引物CT-LB;

所述淋球菌引物组包括SEQ ID No:13所示的正向外引物NG-F3、SEQ ID No:14所示的反向外引物NG-B3、SEQ ID No:15所示的正向内引物NG-FIP、SEQ ID No:16所示的反向内引物NG-BIP、SEQ ID No:17所示的正向环引物NG-LF、SEQ ID No:18所示的反向环引物NG-LB;

所述解脲脲原体引物组包括SEQ ID No:19所示的正向外引物UU-F3、SEQ ID No:20所示的反向外引物UU-B3、SEQ ID No:21所示的正向内引物UU-FIP、SEQ ID No:22所示的反向内引物UU-BIP和SEQ ID No:23所示的反向环引物UU-LB;

所述人型支原体引物组包括SEQ ID No:24所示的正向外引物MH-F3、SEQ ID No:25所示的反向外引物MH-B3、SEQ ID No:26所示的正向内引物MH-FIP、SEQ ID No:27所示的正向外引物MH-BIP和SEQ ID No:28所示的反向环引物MH-LB;

所述生殖支原体引物组包括SEQ ID No:29所示的正向外引物Mg-F3、SEQ ID No:30所示的反向外引物Mg-B3、SEQ ID No:31所示的正向内引物Mg-FIP、SEQ ID No:32所示的反向内引物Mg-BIP和SEQ ID No:33所示的反向环引物Mg-LB;

所述内参引物组包括SEQ ID No:1所示的正向外引物HBB-F3、SEQ ID No:2所示的反向外引物HBB-B3、SEQ ID No:3所示的正向内引物HBB-FIP、SEQ ID No:4所示的反向内引物HBB-BIP、SEQ ID No:5所示的正向环引物HBB-LF和SEQ ID No:6所示的反向环引物HBB-LB。

本发明还提供一种含有上述引物组的检测装置,其特征是:包括一个或多个底片以及盖片,底片与盖片之间相互定位密封配合;所述底片上设置有第一试剂储存槽、第二试剂储存槽、连接第一试剂储存槽和第二试剂储存槽的连接通道;在所述第二试剂储存槽末端连接一个均分通道,在均分通道的内侧设置有排气系统,排气系统的入口与均分通道的末端相连;所述第一试剂储存槽、连接通道、第二试剂储存槽、均分通道和排气系统之间依次相连;

所述均分通道包括均分流道,均分流道的首端至末端沿第一试剂储存槽和第二试剂储存槽的外周布置;沿所述均分流道外沿设置多个均分孔,在每个均分孔的径向上依次设置密封孔、第二缓冲孔和检测孔,均分孔、密封孔、第一缓冲孔和检测孔之间通过微细通道依次相连;

在各个检测孔中分别容纳沙眼衣原体引物组、淋球菌引物组、解脲脲原体引物组、人型支原体引物组、生殖支原体引物组中的任意一组或几组以及内参引物组;在所述第二试剂储存槽或者检测孔中容纳扩增试剂。

进一步地,所述均分流道的前端至末端沿第一试剂储存槽和第二试剂储存槽的外圆周呈半径递增式布置。

进一步地,在所述均分流道的前端设置第一废液槽,在均分流道的末端设置第二废液槽,第二废液槽具有两个开口,第一开口与均分流道的末端相连,第二开口与排气系统的入口相连。

进一步地,在所述第一试剂储存槽内设置有1个或多个第二缓冲孔,排气系统的末端与第一试剂储存槽末端的第一缓冲孔连通。

进一步地,所述第一试剂储存槽和第二试剂储存槽为弧形结构,且弧形结构的半径向外逐渐增大。

进一步地,所述第二试剂储存槽内设置有1个或多个堤坝。

进一步地,所述第一缓冲孔的直径小于密封孔和检测孔的直径。

进一步地,在所述排气系统上设置1个或多个第三缓冲孔,第三缓冲孔位于排气系统的外侧。

进一步地,所述均分孔不少于8个。

与现有技术相比,本发明具有以下优点:

(1)本发明将微流控芯片技术与核酸检测技术进行结合,实现单样品多指标同时检测,该系统简化了实验操作步骤、提高了检测通量,为泌尿生殖道感染病原体多指标精准检测提供了新方法,满足多指标快速筛查及精准检测的迫切需求;

(2)将样品加入芯片后,在驱动力的作用下,样品均匀分布至各检测区,不同检测区内预包埋的试剂与样品进行充分溶解及混合,通过仪器的精准温度控制和探测器实时检测,判别各检测孔的结果;

(3)本发明所述检测装置结构简单,无需阀体结构、在离心力和温度的作用下实现对多重指标的同时检测;

(4)操作简单,将检测试剂预包埋在相应的区域,只需加入处理好的样品即可进行检测;

(5)本发明所述检测装置中具有密封孔和密封试剂,检测过程中检测区的完全相互隔离和密闭,检测完成后,密封试剂固化,有效防止整个检测过程和检测结束后扩增产物的向外扩散,防止实验室污染;

(6)通过均分通道和均分孔的设计,可防止空气柱或气泡造成的各检测孔试剂加入量不均匀导致检测结果异常的发生;

(5)短时间内(30分钟)在一个装置内同时实现至少5种常见泌尿生殖道感染病原体的检测。

附图说明

图1为所述底片的主视图。

图2为所述盖片的主视图。

具体实施方式

下面结合具体附图对本发明作进一步说明。

本发明所述泌尿生殖道感染病原体多联检测引物组包括沙眼衣原体引物组、淋球菌引物组、解脲脲原体引物组、人型支原体引物组、生殖支原体引物组中的任意一组或几组以及内参引物组,其中:

所述沙眼衣原体引物组包括SEQ ID No:7所示的正向外引物CT-F3、SEQ ID No:8所示的反向外引物CT-B3,SEQ ID No:9所示的正向内引物CT-FIP、SEQ ID No:10所示的反向内引物CT-BIP、SEQ ID No:11所示的正向环引物CT-LF和SEQ ID No:12所示的反向环引物CT-LB;

所述淋球菌引物组包括SEQ ID No:13所示的正向外引物NG-F3、SEQ ID No:14所示的反向外引物NG-B3、SEQ ID No:15所示的正向内引物NG-FIP、SEQ ID No:16所示的反向内引物NG-BIP、SEQ ID No:17所示的正向环引物NG-LF、SEQ ID No:18所示的反向环引物NG-LB;

所述解脲脲原体引物组包括SEQ ID No:19所示的正向外引物UU-F3、SEQ ID No:20所示的反向外引物UU-B3、SEQ ID No:21所示的正向内引物UU-FIP、SEQ ID No:22所示的反向内引物UU-BIP和SEQ ID No:23所示的反向环引物UU-LB;

所述人型支原体引物组包括SEQ ID No:24所示的正向外引物MH-F3、SEQ ID No:25所示的反向外引物MH-B3、SEQ ID No:26所示的正向内引物MH-FIP、SEQ ID No:27所示的正向外引物MH-BIP和SEQ ID No:28所示的反向环引物MH-LB;

所述生殖支原体引物组包括SEQ ID No:29所示的正向外引物Mg-F3、SEQ ID No:30所示的反向外引物Mg-B3、SEQ ID No:31所示的正向内引物Mg-FIP、SEQ ID No:32所示的反向内引物Mg-BIP和SEQ ID No:33所示的反向环引物Mg-LB;

所述内参引物组包括SEQ ID No:1所示的正向外引物HBB-F3、SEQ ID No:2所示的反向外引物HBB-B3、SEQ ID No:3所示的正向内引物HBB-FIP、SEQ ID No:4所示的反向内引物HBB-BIP、SEQ ID No:5所示的正向环引物HBB-LF和SEQ ID No:6所示的反向环引物HBB-LB。

表1 引物组

本发明还提供一种含有上述引物组的检测装置,如图1、图2所示,包括一个或多个底片1以及盖片2,底片1与盖片2之间相互定位密封配合;所述底片1上设置有第一试剂储存槽100、第二试剂储存槽300、连接第一试剂储存槽100和第二试剂储存槽300的连接通道200;在所述第二试剂储存槽300末端连接一个均分通道400,在均分通道400的内侧设置有排气系统800,排气系统800的入口与均分通道400的末端相连;所述第一试剂储存槽100、连接通道200、第二试剂储存槽300、均分通道400和排气系统800之间依次相连。

所述均分通道400包括均分流道402,所述均分流道402的首端至末端沿第一试剂储存槽100和第二试剂储存槽300的外圆周呈半径递增式布置;所述均分流道402的前端为均分入口401,均分入口401与第二试剂储存槽300末端连接;在所述均分流道402的前端设置第一废液槽405,在均分流道402的末端设置第二废液槽406,第二废液槽406具有两个开口,分别为第一开口406A和第二开口406B,第一开口406A与均分流道402的末端相连,第二开口406B与排气系统800的入口相连;沿所述均分流道402外沿设置多个均分孔404,在每个均分孔404的径向上依次设置密封孔500、第二缓冲孔600和检测孔700,均分孔404、密封孔500、第一缓冲孔600和检测孔700之间通过微细通道510依次相连,密封孔500能够与其他结构配合实现密封试验。

在各个检测孔700中分别容纳沙眼衣原体引物组、淋球菌引物组、解脲脲原体引物组、人型支原体引物组、生殖支原体引物组中的任意一组或几组以及内参引物组,上述检测孔700中除了靶标和内参检测孔,还有一个阳性对照检测孔和一个阴性对照检测孔,因而作为检测泌尿生殖道致病微生物的检测装置,所述均分孔404一般采用8个,在本实施例中均分孔404采用16个(如图1所示)。另外,在所述第二试剂储存槽300或者检测孔700中容纳扩增试剂,所述扩增试剂包括Bst DNA聚合酶、荧光染料、dNTPs;优选地,所述荧光染料优选为SYTO-9。

作为本发明的进一步改进,在所述第一试剂储存槽100内设置有1个或多个第二缓冲孔101,排气系统800的末端与第一试剂储存槽100末端的第一缓冲孔101连通。

作为本发明的进一步改进,所述第一试剂储存槽100和第二试剂储存槽300为弧形结构,且弧形结构的半径向外逐渐增大,呈发散的形式。

作为本发明的进一步改进,所述第二试剂储存槽300内设置有1个或多个堤坝301。

作为本发明的进一步改进,所述第一缓冲孔600的直径小于密封孔500和检测孔700的直径。

作为本发明的进一步改进,所述第一试剂储存槽100上方的盖片2上设置有凹槽900,凹槽900由多条相互交织的弧形凹槽构成。

作为本发明的进一步改进,所述均分孔404设置成不同的体积(设置不同的底面积和深度),可以实现各个检测孔700加入量不一样的需求。

作为本发明的进一步改进,在所述排气系统800上可以设置1个或多个第三缓冲孔801,第三缓冲孔801位于排气系统800的外侧。

应用例1:本发明所述检测测置的应用,包括以下步骤:

(1)样本核酸提取:

a)拭子中加入1ml无菌生理盐水,5000rpm离心1min,弃上清

b)加入50μl提取液,85℃干浴5min,5000rpm离心1min,将上清转移至一新管中备用;

(2)加样:将处理后的样品溶液通过加液孔302加入到检测装置的第二试剂储存槽300中;

(3)样品溶液的均分:将加入样品溶液的检测装置放入检测仪器上,仪器通过离心使样品溶液通过第二试剂储存槽300内的堤坡301及上盖阻拦板1000的拦截,实现样品溶液的充分均匀。然后进入试剂均分入口401,在连续稳定的离心力作用下,混匀试剂分别进入均分流道402,在填充满第一个均分孔404后,再进入下一段均分流道,然后填充满第2个均分孔,如此依次填满最后一个均分孔,如有多余的试剂则进入第二废液槽406,此时均分流道、均分孔填满检测试剂;

(4)密封:第一试剂储存槽100预加入石蜡,将温度升至石蜡的熔点65℃以上,此时第一试剂储存槽100内的石蜡融化,石蜡在离心条件下通过连接通道200、第二试剂储存槽300进入密封孔500;

(5)检测:扩增反应液位于第二试剂储存槽300或者检测孔700中,如果在第二试剂储存槽300中,通过步骤(2)和步骤(3)与样品溶液混匀后均分至各个检测孔700内;扩增反应液也可以位于各个检测孔700中,每个检测孔700都有相关检测靶标的引物用于检测样品溶液中各靶标,仪器通过精准的温度控制和实时的光学信号检测对各检测孔进行实时检测。

应用例2:检测恒温扩增微流控芯片的特异性,具体如下:

(1)用核酸提取液提取普通淋球菌DNA、沙眼衣原体DNA、解脲脲原体DNA、生殖支原体DNA、人型支原体DNA、人巨细胞病毒DNA、梅毒DNA、乳酸杆菌DNA、单纯疱疹病毒2型DNA、单纯疱疹病毒1型DNA、白念珠菌DNA、阴道毛滴虫DNA;

(2)将淋球菌DNA、沙眼衣原体DNA、解脲脲原体DNA、生殖支原体DNA、人型支原体DNA、人巨细胞病毒DNA、梅毒DNA、乳酸杆菌DNA、单纯疱疹病毒2型DNA、单纯疱疹病毒1型DNA、白念珠菌DNA、阴道毛滴虫DNA与扩增体系分别混匀,然后通过加液孔加入微流控芯片中,放入仪器后进行恒温扩增反应及检测,检测结果如表2所示。

表2 LAMP特异性检测

表2中,+表示检测结果阳性;-表示检测结果阴性。

由表2结果表明本发明能特异性地检测沙眼衣原体、淋球菌、解脲脲原体、人型支原体、生殖支原体,而与其他病原微生物无交叉反应,如人巨细胞病毒、梅毒、乳酸杆菌、单纯疱疹病毒2型、单纯疱疹病毒1型、白念珠菌、阴道毛滴虫。

应用例3:检测恒温扩增微流控芯片的灵敏度,具体如下:

将含有沙眼衣原体、淋球菌、解脲脲原体、人型支原体、生殖支原体各自靶标的质粒DNA用检测阴性的人基因组DNA溶液稀释一定拷贝数倍比稀释液,然后分别加入到微流控芯片上进行检测。由检测结果可以说明该检测方法对沙眼衣原体、淋球菌、解脲脲原体、人型支原体、生殖支原体的检测灵敏度都是500拷贝/反应。

序列表

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<120> 泌尿生殖道感染病原体多联检测引物组及含有该引物组的检测装置

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<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 正向外引物HBB-F3(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

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aggagaccaa tagaaactgg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 反向外引物HBB-B3(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

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ccataacagc atcaggagtg 20

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> 正向内引物HBB-FIP(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

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ggaaaataga ccaataggca gagaggcatg tggagacaga gaa 43

<210> 4

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<212> DNA

<213> 反向内引物HBB-BIP(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

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<210> 5

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<212> DNA

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<210> 6

<211> 21

<212> DNA

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<400> 6

cttggaccca gaggttcttt g 21

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 正向外引物CT-F3(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 7

acaaatcgta tctcgggtta 20

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 反向外引物CT-B3(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

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gctgcgaata gaaaaagtct t 21

<210> 9

<211> 46

<212> DNA

<213> 正向内引物CT-FIP(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 9

cacgctcaaa tcatcgagga aaacgcatga tgctttatca aatgac 46

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<211> 44

<212> DNA

<213> 反向内引物CT-BIP(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

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ttccgctcgt ttaatgagta caaccttccc tttatacgct caag 44

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<211> 23

<212> DNA

<213> 正向环引物CT-LF(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 11

cgtatgagaa acggatctaa gct 23

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 反向环引物CT-LB(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

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tgaaaatcca ttgcgtagat ctcc 24

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<211> 18

<212> DNA

<213> 正向外引物NG-F3(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 13

ggaagcggct tgaatctc 18

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 反向外引物NG-B3(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

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ctggtatgtt cgcgtttc 18

<210> 15

<211> 36

<212> DNA

<213> 正向内引物NG-FIP(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 15

agtggcggca atttcggtcg gctcagttgg atttgt 36

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<211> 39

<212> DNA

<213> 反向内引物NG-BIP(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

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ccgcttcggt aatacagtcc ctgactgcgt tcgacaaag 39

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 正向环引物NG-LF(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

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tggttttgtc ggcattttca g 21

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

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cgcatcagct atgcccat 18

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<211> 18

<212> DNA

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atgttgggtt aagtcccg 18

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<212> DNA

<213> 反向外引物UU-B3(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 20

ctaacttttt ctgtttcgct tc 22

<210> 21

<211> 44

<212> DNA

<213> 正向内引物UU-FIP(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 21

catccccacc ttcctctacc cctttcgtta gttrcttttc tagc 44

<210> 22

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<212> DNA

<213> 反向内引物UU-BIP(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 22

atcatcatgc cccttatatc tagggttacg attttgcagc agtttg 46

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 反向环引物UU-LB(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 23

tgcaaacgtg ctacaatggc ta 22

<210> 24

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<212> DNA

<213> 正向外引物MH-F3(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

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tgtcgagcga ggttagcaa 19

<210> 25

<211> 19

<212> DNA

<213> 反向外引物MH-B3(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 25

tcgacccggc taaacatca 19

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<211> 42

<212> DNA

<213> 正向内引物MH-FIP(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 26

tgcgtatccg gcattagcca ttgcgaatgg gtgagtaaca cg 42

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<211> 40

<212> DNA

<213> 正向外引物MH-BIP(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

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<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> 反向环引物MH-LB(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 28

aaggcgccac taaaagatsa g 21

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<211> 21

<212> DNA

<213> 正向外引物Mg-F3(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

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tgttgttagt gattgtgtga a 21

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<212> DNA

<213> 反向外引物Mg-B3(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 30

tgtttaacac ttaactgctt gg 22

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<212> DNA

<213> 正向内引物Mg-FIP(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

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<212> DNA

<213> 反向内引物Mg-BIP(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

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tgcacttacc cttggggtta tagttgctca cgctactacg 40

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<212> DNA

<213> 反向环引物Mg-LB(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

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acaggtgtag gtggttattt tctc 24

再多了解一些
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