本发明涉及一种小麦醇溶蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测技术领域。
背景技术：
小麦醇溶蛋白是分子量为22-58kda的单体蛋白质，是小麦蛋白的主要成分。醇溶蛋白是小麦等谷物类的主要过敏原，小麦过敏会影响皮肤、内脏、呼吸道的健康，引起运动激发过敏症、职业哮喘、鼻炎、接触性荨麻症、乳糜泻肠炎、麻风皮肤病等。乳糜泻肠炎是遗传易感患者摄入小麦麸质后不能耐受所致的慢性小肠吸收不良综合症，并且目前认为醇溶蛋白是乳糜泻患者的主要诱因。食物过敏已成为一个公众性的食品安全问题。食物过敏是人类常见的一种免疫性疾病，主要是由食物中蛋白质引起，由ige介导的ⅰ型超敏反应，其临床症状主要有水肿、皮炎、哮喘以及肠道综合症等，严重时会引发休克甚至危及生命，复杂食物样品中微量过敏原的检测和定量成为当务之急。目前体外针对微量过敏原的检测方法有免疫学方法、蛋白组学法、pcr法、化学发光免疫方法。虽然目前有关过敏原检测的方法很多,但都存在各自不同的问题,如检测速度慢、成本高、检测需要特定的分析仪器等,制约了食品中过敏原检测方法的发展。因此实现准确、安全、经济、快速、高通量、高灵敏的体外检测技术方法具有现实意义。
技术实现要素：
本发明的第一个目的是提供小麦醇溶蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，已于2017年9月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.14687，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明的第二个目的是提供小麦醇溶蛋白单克隆抗体，它由所述保藏编号为cgmccno.14687的单克隆细胞株分泌产生。
本发明的第三个目的是提供所述小麦醇溶蛋白单克隆抗体的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述应用是用于食品中小麦醇溶蛋白的分析检测。
在本发明的一种实施方式中，所述应用是制备elisa竞争法检测小麦醇溶蛋白的试剂。
本发明的第四个目的是提供所述单克隆细胞株的制备方法，所述方法是用小麦醇溶蛋白免疫动物，从动物体内分离多克隆抗体。
在本发明的一种实施方式中，所述小麦醇溶蛋白杂交瘤细胞株是按如下方法制备的：
(1)动物免疫与效价测定：采用小剂量短周期方案免疫健康balb/c雌性小鼠，首次免疫用100μg小麦醇溶蛋白与等量弗氏完全佐剂混匀后进行皮下注射，间隔3周后，再用100μg小麦醇溶蛋白与等量弗氏不完全佐剂加强免疫，此后每隔3周用半量小麦醇溶蛋白加强免疫一次；冲刺免疫剂量减半，与等体积的生理盐水混合后采用腹腔免疫，用小麦醇溶蛋白作为包被抗原，通过直接elisa法检测血清效价；
其具体elisa程序如下：
1)包被：将包被抗原用0.05mph9.6碳酸盐缓冲液梯度稀释，100μl/孔，37℃孵育2h；
2)洗涤：将板内溶液倾去，每孔注入200μlpbst溶液，置于摇床上振荡3min，甩干，洗涤3次；以下洗涤方法相同；
3)封闭：拍干后，加入200μl/孔封闭液，37℃孵育2h，洗涤后烘干备用；
4)加样：将抗血清从1:1000开始梯度稀释，100μl/孔，37℃孵育30min；充分洗涤后，加入1:3000稀释的鼠二抗，100μl/孔，37℃孵育30min，洗涤后拍干；
5)显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μl的显色液(tmb与底物液体积比例1:5)，37℃避光反应15min；
6)终止和测定：取出酶标板，每孔加入50μl终止液(2mol/l的硫酸)终止反应，然后用酶标仪测定各孔的吸光值od450nm。
(2)细胞融合与筛选：在冲击免疫三天后，按照常规peg(聚乙二醇，分子量为1450)方法进行细胞融合，具体步骤如下：
a、无菌取小鼠脾脏，研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，并进行细胞计数；
b、收集sp2/0细胞，悬浮于rpmi-1640基础培养液中，进行细胞计数；
c、将脾细胞和sp2/0细胞按照10:1(数量比)的比例混合，离心后用50％peg融合，时间1min，之后按照从慢到快，加入rpmi-1640基础培养液，离心后悬浮于含20％胎牛血清、2％的50×hat的rpmi-1640筛选培养液中，加到96孔细胞培养板，置于37℃、5％co2的培养箱中培养。在细胞融合的第三天对融合细胞进行rpmi-1640筛选培养液半换液，第6天用含20％胎牛血清、1％100×ht的rpmi-1640过渡培养液进行全换液，在第9天取细胞上清进行筛选。
筛选：用小麦醇溶蛋白作为包被抗原，用直接elisa进行检测，选取细胞团数少且阳性高的孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，即得到能稳定分泌小麦醇溶蛋白单克隆抗体的细胞株。
(3)单克隆抗体的制备与鉴定：取8-10周龄balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1ml；7天后每只小鼠腹腔注射1×106杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化，获得的单抗置于-20℃保存。
本发明的第五个目的是提供一种小麦醇溶蛋白的检测方法，所述方法包括如下步骤：
(1)包被：用浓度为4μg/ml的细胞株编号为cs6-1的抗体包被酶标板，100μl/孔，4℃过夜；
(2)洗涤：用pbst洗涤反应板三次，每次3min，200μl/孔，甩干；
(3)封闭：加入200μl/孔封闭液，37℃孵育2h；
(4)洗涤：同(2)；
(5)样品：用pbs将小麦醇溶蛋白稀释成5μg/ml，再三倍进行梯度稀释；另设一个pbs空白对照。每孔加入100μl样品，于37℃温育1h；
(6)洗涤：同(2)；
(7)加酶标抗体(4f2-hrp，2μg/ml)，100μl/孔，37℃反应1h；
(8)洗涤：同(2)；
(9)显色：加底物tmb100μl/孔，显色12min；
(10)终止：加终止液50μl/孔；
(11)测定：用酶标仪检测od450nm。
本发明的第六个目的是提供一种小麦醇溶蛋白检测试剂盒，所述试剂盒含有所述单克隆抗体、固相载体，用于包被所述固相载体的抗体，能与检测抗原结合的酶标抗体，显色底物，洗涤液和封闭液；所述用于包被所述固相载体的抗体为杂交瘤细胞cgmccno.xxxx分泌的单克隆抗体。
本发明的有益效果：本发明获得了能够分泌小麦醇溶蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，建立了检测小麦醇溶蛋白的双抗体夹心elisa法，该方法检测限为9.28ng/ml，在检测食品过敏原中的应用，具有实际应用价值。
生物材料保藏
单克隆细胞株，保藏编号为cgmccno.14687，已于2017年9月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
附图说明
图1是本发明获得的小麦醇溶蛋白检测曲线方程y＝0.60495-0.0285x(r2＝0.9979)的示意图。
具体实施方式
实施例1杂交瘤细胞的制备
1、动物免疫：采用小剂量短周期方案免疫健康balb/c雌性小鼠，首次免疫用100μg小麦醇溶蛋白与等量弗氏完全佐剂混匀后进行皮下注射，间隔3周后，再用100μg小麦醇溶蛋白与等量弗氏不完全佐剂加强免疫，此后每隔3周用半量小麦醇溶蛋白加强免疫一次；冲刺免疫剂量减半，与等体积的生理盐水混合后采用腹腔免疫，用小麦醇溶蛋白作为包被抗原，通过直接elisa法检测血清效价；
其具体elisa程序如下：
(1)包被：将包被抗原用0.05mph9.6碳酸盐缓冲液梯度稀释，100μl/孔，37℃孵育2h；
(2)洗涤：将板内溶液倾去，每孔注入200μlpbst溶液，置于摇床上振荡3min，甩干，洗涤3次；以下洗涤方法相同；
(3)封闭：拍干后，加入200μl/孔封闭液，37℃孵育2h，洗涤后烘干备用；
(4)加样：将抗血清从1:1000开始梯度稀释，100μl/孔，37℃孵育30min；充分洗涤后，加入1:3000稀释的鼠二抗，100μl/孔，37℃孵育30min，洗涤后拍干；
(5)显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μl的显色液(tmb与底物液体积比例1:5)，37℃避光反应15min；
(6)终止和测定：取出酶标板，每孔加入50μl终止液(2mol/l的硫酸)终止反应，然后用酶标仪测定各孔的吸光值od450nm。
2、细胞融合：在冲击免疫三天后，按照常规peg(聚乙二醇，分子量为1450)方法进行细胞融合，具体步骤如下：
(1)无菌取小鼠脾脏，研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，并进行细胞计数；
(2)收集sp2/0细胞，悬浮于rpmi-1640基础培养液中，进行细胞计数；
(3)将脾细胞和sp2/0细胞按照10:1(数量比)的比例混合，离心后用50％peg融合，时间1min，之后按照从慢到快，加入rpmi-1640基础培养液，离心后悬浮于含20％胎牛血清、2％的50×hat的rpmi-1640筛选培养液中，加到96孔细胞培养板，置于37℃、5％co2的培养箱中培养。
3、细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合的第三天对融合细胞进行rpmi-1640筛选培养液半换液，第6天用含20％胎牛血清、1％的100×ht的rpmi-1640过渡培养液进行全换液，在第9天取细胞上清进行筛选。
筛选：用小麦醇溶蛋白作为包被抗原，用直接elisa进行检测，选取细胞团数少且阳性高的孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，即可得到能稳定分泌小麦醇溶蛋白单克隆抗体的细胞株。
4、单克隆抗体的制备与鉴定：取8-10周龄balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1ml；7天后每只小鼠腹腔注射1×106杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化，获得的单抗置于-20℃保存。
实施例2检测小麦醇溶蛋白的双抗体夹心elisa方法的建立
1)包被：用浓度为4μg/ml的细胞株编号为cs6-1的抗体包被酶标板，100μl/孔，4℃过夜；
2)洗涤：用pbst洗涤反应板三次，每次3min，200μl/孔，然后甩干反应板；
3)封闭：加入200μl/孔封闭液，37℃孵育2h；
4)洗涤：同2)；
5)样品：用pbs将小麦醇溶蛋白稀释成5μg/ml，再三倍进行梯度稀释；另设一个pbs空白对照。每孔加入100μl样品，于37℃温育1h；
6)洗涤：同2)；
7)加酶标抗体(4f2-hrp，2μg/ml)，100μl/孔，37℃反应1h；
8)洗涤：同2)；
9)显色：加底物tmb100μl/孔，显色12min；
10)终止：加终止液50μl/孔；
11)测定：用酶标仪检测od450nm。结果如图1所示，小麦醇溶蛋白检测曲线方程为y＝-0.4968+0.8869x，r2＝0.9919，最低检测限为9.28ng/ml。
实施例3
以小麦样品为例，检测其中的致敏成分小麦醇溶蛋白
1)包被：用包被液将鼠抗醇溶蛋白单抗稀释至包被浓度，以100μl/孔加入酶标板中，4℃过夜；
2)洗涤：弃去酶标板孔内的液体，用pbst洗涤反应板三次，每次3min，200μl/孔，然后甩干反应板；
3)封闭：加入200μl/孔封闭液，37℃孵育2h；
4)洗涤：同2)；
5)样品：用样品稀释液将小麦醇溶蛋白作梯度稀释，待测样品作适当稀释，每孔100μl，设阳性对照和阴性对照，于37℃温育1h；
6)洗涤：同2)；
7)加入酶标抗体：将酶标记鼠抗醇溶蛋白抗体，稀释至工作浓度，100μl/孔，37℃反应1h；
8)洗涤：同2)；
9)显色：加底物tmb100μl/孔，显色12min；
10)终止：加终止液50μl/孔；
11)测定：用酶标仪检测od450nm。结果显示定量检测限为19ng/ml。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。