启动子增强系统及其在细菌中的应用的制作方法

文档序号：15396578发布日期：2018-09-08 02:24阅读：803来源：国知局

本发明涉及生物技术领域中，启动子增强系统及其在细菌中的应用。

背景技术：

枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、乳酸菌(lacticacidbacterial)及大肠杆菌(escherichiacoli)是3种非常重要的原核表达宿主，是工业生产及医药领域主要的生产菌株，同时也是科学研究领域中重要的模式菌株，均具有很高的应用价值及研究价值。枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)因培养简单快速，具有较强的分泌蛋白质的能力、非致病性(不含内毒素)及良好的发酵基础和生产技术，是目前生产各种工业用酶，如淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等的理想表达宿主。乳酸菌是重要的益生菌，因其被公认为是安全的(generallyregardedassafe,gras)食品级微生物，且不产生内毒素，自身分泌性蛋白质较少，不产生细胞外蛋白酶，不会对目的分泌蛋白进行胞外降解，因此是很具吸引力的基因工程菌。应用乳酸菌基因表达系统产生的大量酶、多肽、中间代谢物等表达产物，可以应用于食品、医药、保健业和工业等领域，有巨大的应用前景和潜在的商业价值。大肠杆菌(escherichiacoli)是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌，其遗传背景清楚、转化和转导效率高、培养操作简单、生长繁殖快、成本低廉，可快速大规模地生产目的蛋白，且其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的30％，因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统。

鉴于以上3种表达宿主的优良性状及广泛用途，建立和发展相应的基因克隆和表达系统，实现有生产价值蛋白的高产，将取得巨大的科研价值与经济利益，实现外源蛋白高效表达的关键因素之一是使用强并可控制的启动子，启动子是基因表达调控的重要顺式调控元件，也是基因工程表达载体的重要元件。依照控制转录水平的高低，启动子可以分为强启动子和弱启动子；从转录模式上分类，启动子可以分为组成型启动子、诱导型启动子、时期特异性启动子及自诱导启动子。目前发现的强启动子多为组成型启动子，组成型启动子即不需要任何诱导物，持续性表达蛋白的启动子，可用作调控元件构建表达载体实现目标蛋白的胞内或胞外大量表达。

p43是革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌的组成型强启动子，但其启动下游基因转录的效率仍不高，虽然通过启动子诱捕系统(promotertrapsystem)等分子生物学手段发现了多种新型的启动子，如plaps，是目前应用在枯草芽孢杆菌中表达的最强的组成型启动子，但此启动子的强度只是p43的13倍，应用于芽孢杆菌的强启动子系统仍有待进一步开发。乳酸菌外源蛋白表达量一般相对偏低，且乳酸菌宿主对表达载体的启动子要求比较严格，具有很高的特异性和选择性，目前可用于构建乳酸菌表达载体的启动子数量相对较少，其中大多数乳酸菌表达载体的启动子活性不高，且需要诱导，这不仅降低了外源蛋白表达的效率，也使操作变得繁琐，更重要的是限制了乳酸菌的实际应用。对于芽孢杆菌及乳酸菌，组成型启动子不需诱导等特殊条件即可在菌体存活期持续不断地表达外源基因，从而简化了操作过程、且具有相对较高的安全性，更适合在实际生产中应用，因此寻找组成型的强启动子对于芽孢杆菌及乳酸菌具有十分重要的意义。应用于大肠杆菌的启动子多为诱导型启动子，常用的t7启动子，需iptg诱导，iptg价格较高，在生产应用中会增加成本，而阿拉伯糖诱导的启动子，虽然成本较iptg低，但是启动子强度也低于t7，因此如果能增强阿拉伯糖诱导的启动子，不仅降低了成本也达到了高产外源蛋白的目的。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是如何提高外源基因在生物细胞中的表达量。

为解决上述技术问题，本发明首先提供一种启动子增强系统，所述系统包括cerr基因与pa启动子；所述cerr基因编码cerr蛋白质，所述cerr蛋白质为a1)、a2)或a3)：

a1)氨基酸序列为序列2的蛋白质；

a2)在序列2的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的由a1)衍生的蛋白质；

a3)在a1)或a2)的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质；

所述pa启动子为下述b1)、b2)或b3)：

b1)序列表中序列1的第256-548位所示的dna分子；

b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的dna分子；

b3)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且具有相同功能的dna分子。

上述a2)中的蛋白质，可为与序列2所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。

这里使用的术语“同一性”指与天然序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述应用中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(sds)、0.5mnapo4和1mmedta的混合溶液中杂交，在50℃，2×ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5mnapo4和1mmedta的混合溶液中杂交，在50℃，1×ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5mnapo4和1mmedta的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5mnapo4和1mmedta的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5mnapo4和1mmedta的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×ssc，0.1％sds中漂洗；也可为：在6×ssc，0.5％sds的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×ssc,0.1％sds和1×ssc,0.1％sds各洗膜一次；也可为：2×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；也可为：0.1×sspe(或0.1×ssc)、0.1％sds的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述系统中，所述cerr基因可为下述a1)、a2)或a3)：

a1)序列表中序列1的第1-255位所示的dna分子；

a2)与a1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的dna分子；

a3)在严格条件下与a1)或a2)限定的核苷酸序列杂交，且具有相同功能的dna分子。

上述启动子增强系统可为下述c1)、c2)或c3)：

c1)序列表中序列1的第1-548位所示的dna分子；

c2)与c1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的dna分子；

c3)在严格条件下与c1)或c2)限定的核苷酸序列杂交，且具有相同功能的dna分子。

本发明还提供了与所述系统相关的生物材料，所述生物材料为下述d1)至d6)中的任一种：

d1)含有所述系统的表达盒；

d2)含有d1)所述表达盒的重组载体；

d3)含有d1)所述表达盒的重组微生物；

d4)含有d2)所述重组载体的重组微生物；

d5)含有d1)所述表达盒的细胞系；

d6)含有d2)所述重组载体的细胞系。

可用现有的载体构建含有所述表达盒的重组载体。

所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为phy300plk载体、pbad载体或pmg36e载体。

所述重组载体可为phy-p43-rpa-gfp、phy-p43-rpa-bgab、pbad-para-rpa-gfp或pmg36e-p32-rpa-gfp。

所述phy-p43-rpa-gfp可为将phy300plk载体的ecorⅰ与xbaⅰ间的dna片段替换为含有序列3所示的p43启动子和序列1所示的dna片段得到的重组载体。

所述phy-p43-rpa-bgab可为将phy300plk载体的ecorⅰ与salⅰ间的dna片段替换为含有序列3所示的p43启动子和序列4所示的dna片段得到的重组载体。

所述pbad-para-rpa-gfp可为将pbad载体的kpnⅰ和hindⅲ间的dna片段替换为含有序列1所示的dna片段得到的重组载体。

所述pmg36e-p32-rpa-gfp可为将pmg36e载体的hindⅲ及kpnⅰ间的dna片段替换为含有序列1所示的dna片段得到的重组载体。

本发明还提供了一种增强生物细胞中目的基因表达的方法，所述包括：向目的基因与其启动子间导入所述系统，实现所述目的基因表达的增强。

上述方法中，所述生物细胞可为微生物细胞。

所述微生物细胞可为细菌。

所述细菌可为革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。所述细菌具体可为枯草芽孢杆菌、大肠杆菌或乳酸菌。

本发明还提供了所述系统或所述生物材料的下述任一应用：

x1)在生物细胞中表达目的基因中的应用；

x2)在制备生物细胞中表达目的基因产品中的应用。

所述生物细胞可为微生物细胞。

所述微生物细胞可为细菌。

所述细菌可为革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。所述细菌具体可为枯草芽孢杆菌、大肠杆菌或乳酸菌。

实验证明，当本发明的启动子增强系统rpa应用于不同的g⁺菌(革兰氏阳性菌)及g^-菌(革兰氏阴性菌)中时，均可显著地提高下游蛋白的表达量，当把cerr编码基因的密码子优化为其他表达宿主偏好的密码子，即可推广应用到更多的表达系统中。在宿主菌选择方面，尤其是对于乳酸菌，该系统不仅可以提高乳杆菌表达蛋白的量，也可以提高乳球菌表达蛋白的量，因乳酸菌相应的强启动子较少，且乳酸菌一般表达外源蛋白的量也较低，该启动子增强系统的应用在乳杆菌中可以将蛋白的表达水平提高70多倍，因此该系统具有很好的应用潜力。

附图说明

图1为phy-pa-gfp的示意图。

图2为phy-p43-gfp的示意图。

图3为phy-p43-rpa-gfp的示意图。

图4为phy-pa-bgab的示意图。

图5为phy-p43-bgab的示意图。

图6为phy-p43-rpa-bgab的示意图。

图7为枯草芽孢杆菌中gfp表达量的检测结果。pa表示wb600/phy-pa-gfp，p43表示wb600/phy-p43-gfp，p43-rpa表示wb600/phy-p43-rpa-gfp。

图8为枯草芽孢杆菌中bgab酶活的检测结果。pa表示wb600/phy-pa-bgab，p43表示wb600/phy-p43-bgab，p43-rpa表示wb600/phy-p43-rpa-bgab。

图9为pbad-pa-gfp的示意图。

图10为pbad-para-gfp的示意图。

图11为pbad-para-rpa-gfp的示意图。

图12为大肠杆菌中gfp表达量的检测结果。pa表示bw25113/pbad-pa-gfp，para表示bw25113/pbad-para-gfp，para-rpa表示bw25113/pbad-para-rpa-gfp。

图13为pmg36e-pa-gfp的示意图。

图14为pmg36e-p32-gfp的示意图。

图15为pmg36e-p32-rpa-gfp的示意图。

图16为干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)atcc27092中gfp表达量的检测结果。pa表示27092/pmg36e-pa-gfp，p32表示27092/pmg36e-p32-gfp，p32-rpa表示27092/pmg36e-p32-rpa-gfp。

图17为乳酸乳球菌(lactococcuslactis)mg1363中gfp表达量的检测结果。pa表示mg1363/pmg36e-pa-gfp，p32表示mg1363/pmg36e-p32-gfp，p32-rpa表示mg1363/pmg36e-p32-rpa-gfp。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应dna的5′末端核苷酸，末位均为相应dna的3′末端核苷酸。

phy300plk载体记载在(ishiwah,shibaharah.newshuttlevectorsforescherichiacoliandbacillussubtilis.ii.plasmidphy300plk,amultipurposecloningvectorwithapolylinker,derivedfromphy460,jpn.j.genet.1985,60:235-243.)一文中，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

pbad载体为thermofisherscientific公司产品。

pmg36e载体记载在(jianqiangni,kunlingteng,gangliu,caixiaqiao,liandonghuan,jinzhong.autoregulationoflantibioticbovicinhj50biosynthesisbytwo-componentsignaltransductionsystembovk/bovrinstreptococcusbovishj50.applenvironmicrobiol，2011jan；77(2):407-15.)一文中，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

枯草芽孢杆菌(b.subtilis)wb600记载在(yux,xuj,liux,chux,wangp,tianj,wun,fany.identificationofahighlyefficientstationaryphasepromoterinbacillussubtilis.scirep.2015dec17；5:18405.)一文中，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

大肠杆菌(e.coli)bw25113记载在(grenierf,matteaud,babyv,rodrigues.completegenomesequenceofescherichiacolibw25113.genomeannounc.2014oct16；2(5).pii:e01038-14.)一文中，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)atcc27092为atcc产品。

乳酸乳球菌(lactococcuslactis)mg1363记载在(liug,zhongj,nij,chenm,xiaoh,huanl.characteristicsofthebovicinhj50geneclusterinstreptococcusbovishj50.microbiology2009；155(pt2):584—93.)一文中，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

本发明提供的启动子增强系统的名称为rpa，包括cerr基因与pa启动子的dna序列，rpa的序列为序列表中序列1的第1-548位。下面以枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和乳酸菌为例具体阐述rpa在提高细菌中目的基因表达量中的应用。

实施例1、rpa可以提高目的蛋白在枯草芽孢杆菌中的表达量

1、重组载体的构建

1)目的蛋白为gfp的重组载体的构建

phy-pa-gfp：将pa启动子与gfp基因利用融合pcr无缝连接在一起后获得pa-gfp片段，其序列为序列表中序列1中第256-1265位；通过限制性内切酶ecorⅰ及xbaⅰ将phy300plk载体的ecorⅰ和xbaⅰ间的dna片段替换为pa-gfp片段，得到重组载体，将序列正确的重组载体命名为phy-pa-gfp，该载体中pa启动子启动gfp基因的表达，其示意图如图1。

其中，序列1的第256-548位为pa启动子的序列，序列1的第549-1265位为gfp基因的序列。

phy-p43-gfp：分别在p43启动子(其序列为序列表中序列3)的5′端和3′端添加ecorⅰ和bamhⅰ的识别序列及相应的保护碱基，将得到的dna片段记为dna片段1，将dna片段1利用ecorⅰ和bamhⅰ进行双酶切，得到dna片段1′；分别在gfp基因(其序列为序列1的第549-1265位)的5′端和3′端添加bamhⅰ和xbaⅰ的识别序列及相应的保护碱基，将得到的dna片段记为dna片段2，将dna片段2利用bamhⅰ和xbaⅰ进行双酶切，得到dna片段2′；将phy300plk载体利用ecorⅰ和xbaⅰ进行双酶切，得到phy300plk载体骨架；连接dna片段1′、dna片段2′和phy300plk载体骨架，得到重组载体，将序列正确的重组载体命名为phy-p43-gfp，该重组载体中p43启动子启动gfp基因的表达，其示意图如图2。

phy-p43-rpa-gfp：将cerr基因与pa-gfp片段利用融合pcr连接在一起得到cerr-pa-gfp片段，其序列为序列表中序列1。分别在cerr-pa-gfp片段的5′端和3′端添加bamhⅰ和xbaⅰ的识别序列及相应的保护碱基，将得到的dna片段记为dna片段3，将dna片段3利用bamhⅰ和xbaⅰ进行双酶切，得到dna片段3′；连接dna片段1′、dna片段3′和经ecorⅰ与xbaⅰ酶切得到的phy300plk载体骨架，得到重组载体，将序列正确的重组载体命名为phy-p43-rpa-gfp，该重组载体的示意图如图3。

序列1的第1-255位为cerr基因的序列，编码序列表中序列2所示的cerr蛋白质，序列1的第1-548位为cerr基因与pa启动子形成的rpa启动子增强系统的序列。

2)目的蛋白为bgab的重组载体的构建

phy-pa-bgab：将pa启动子与bgab基因(β-半乳糖苷酶基因)利用融合pcr无缝连接在一起后获得pa-bgab片段，其序列为序列表中序列4中第256-2567位；通过限制性内切酶ecorⅰ及bamhⅰ将phy300plk载体的ecorⅰ和bamhⅰ间的dna片段替换为pa-bgab片段，得到重组载体，将序列正确的重组载体命名为phy-pa-bgab，该载体中pa启动子启动bgab基因的表达，其示意图如图4。

其中，序列4的第256-548位为pa启动子的序列，序列4的第549-2567位为bgab基因的序列。

phy-p43-bgab：分别在bgab基因(其序列为序列4的第549-2567位)的5′端和3′端添加bamhⅰ和salⅰ的识别序列及相应的保护碱基，将得到的dna片段记为dna片段4，将dna片段4利用bamhⅰ和salⅰ进行双酶切，得到dna片段4′；将phy300plk载体利用ecorⅰ和salⅰ进行双酶切，得到phy300plk载体骨架；连接步骤1)中的dna片段1′、dna片段4′和phy300plk载体骨架，得到重组载体，将序列正确的重组载体命名为phy-p43-bgab，该重组载体中p43启动子启动bgab基因的表达，其示意图如图5。

phy-p43-rpa-bgab：将cerr基因与pa-bgab片段利用融合pcr连接在一起得到cerr-pa-bgab片段，其序列为序列表中序列4。分别在cerr-pa-bgab片段的5′端和3′端添加bamhⅰ和salⅰ的识别序列及相应的保护碱基，将得到的dna片段记为dna片段5，将dna片段5利用bamhⅰ和salⅰ进行双酶切，得到dna片段5′；连接步骤1)的dna片段1′、dna片段5′和经ecorⅰ与salⅰ酶切得到的phy300plk载体骨架，得到重组载体，将序列正确的重组载体命名为phy-p43-rpa-bgab，该重组载体的示意图如图6。

序列4的第1-255位为cerr基因的序列，第1-548位为cerr基因与pa启动子形成的rpa启动子增强系统的序列。

2、目的基因表达量的检测

将phy-pa-gfp、phy-p43-gfp、phy-p43-rpa-gfp、phy-pa-bgab、phy-p43-bgab和phy-p43-rpa-bgab分别导入枯草芽孢杆菌(b.subtilis)wb600中，得到重组菌，将得到的重组菌分别命名为wb600/phy-pa-gfp、wb600/phy-p43-gfp、wb600/phy-p43-rpa-gfp、wb600/phy-pa-bgab、wb600/phy-p43-bgab和wb600/phy-p43-rpa-bgab。

1)gfp表达量的检测

(1)将wb600/phy-pa-gfp、wb600/phy-p43-gfp、wb600/phy-p43-rpa-gfp分别在含tet20μg/ml的lb平板上进行划线活化，从平板上接种wb600/phy-pa-gfp、wb600/phy-p43-gfp、wb600/phy-p43-rpa-gfp单克隆(各三个)于3ml含tet20μg/ml的lb培养基中，37℃，200rpm培养12h；

(2)将步骤(1)得到的菌液按1％接种量接种于10ml含tet20μg/ml的lb培养基中，37℃，200rpm培养60h，期间每隔2h取200μl样品(每个克隆取两个重复)于黑色96孔板中检测荧光强度。

(3)荧光检测利用多功能荧光读板仪synergytmh4(美国biotek)进行检测，激发波长为488nm，吸收波长为511nm。

结果显示，pa启动子基本不启动目的基因的转录，wb600/phy-pa-gfp中gfp基本不表达；p43启动子可以启动gfp基因的转录，但wb600/phy-p43-gfp中gfp表达量一直维持低水平；在加入rpa启动子增强系统后，gfp的表达量显著提高，在培养48h时，wb600/phy-p43-rpa-gfp中的gfp表达量是wb600/phy-p43-gfp的46倍(图7)，表明，rpa启动子增强系统可以大大提高目的基因在枯草芽孢杆菌中的表达量。

2)bgab酶活的检测

1)将wb600/phy-pa-bgab、wb600/phy-p43-bgab和wb600/phy-p43-rpa-bgab分别进行划线活化，挑取活化后的单克隆于含有tet(20μg/ml)的3ml的lb试管中37℃震荡200rpm过夜培养。

2)按照1％的接种量转接过夜培养的各检测株于含有tet(20μg/ml)的10ml的lb试管中，37℃震荡培养。

3)于18h取样，每管分别收集1.2ml的样品于1.5mlep管中，离心，去上清，收集菌体；

4)向收集的菌体中加入1.2ml的zbuffer(冰浴)进行重悬，吸取200μl重悬的菌体，加入透明的96孔板中，用多功能荧光读板仪synergytmh4测定od600；

5)剩下的1.0ml样品再次离心收集菌体去上清，然后加入500μl含有溶菌酶(终浓度20mg/ml)的zbuffer，重悬菌体，置于37℃温箱1h，消化细菌细胞壁(设置对照平行管)；

6)消化后的样品加入500μl含有1.2％sds的zbuffer，室温处理10min，溶解细胞膜；

7)处理后的样品12,000rpm，4℃离心10min，收集上清，弃沉淀；

8)将各样品的上清用zbuffer稀释20倍，取200μl的样品与40μl4mg/ml的onpg混匀(事先放入28℃平衡)，置于28℃反应至样品足够黄时加入100μl的1mna2co3终止反应，并准确记录反应时间；

9)各吸取200μl反应产物于透明的96孔板中，用多功能荧光读板仪synergytmh4测定od420和od550。按照以下公式计算各样品β-半乳糖苷酶活性：

millerunits＝1000×[(od420-1.75×od550)]/(t×v×od600)。

试剂：

1×zbuffer(ph7.0)：60mmna2hpo4·7h2o；40mmnah2po4·h2o；10mmkcl；1mmmgso4；50mmβ-mercaptoethanol(bme)。

结果显示，一般β-半乳糖苷酶活性在培养18h时达到最高，在18h取样检测bgab酶活，结果显示p43-rpa启动的β-半乳糖苷酶活性是p43的63倍(图8)，表明，rpa启动子增强系统可以大大提高目的基因在枯草芽孢杆菌中的表达量。

实施例2、rpa可以提高目的蛋白在大肠杆菌中的表达量

1、重组载体的构建

pbad-pa-gfp：以pbad载体为模板进行pcr扩增得到pbad线性化载体，在序列上pbad线性化载体与pbad载体相比缺少para启动子及his-tag片段，pbad线性化载体的序列为序列表中序列5；利用gibson连接将实施例1的pa-gfp片段连入pbad线性化载体中，得到重组质粒，将得到的序列正确的重组质粒命名为pbad-pa-gfp，该重组载体中，pa启动子启动gfp基因的表达，其示意图如图9。

pbad-para-gfp：分别在gfp基因(其序列为序列1的第549-1265位)的5′端和3′端添加kpnⅰ和hindⅲ的识别序列及相应的保护碱基，将得到的dna片段记为dna片段6，将dna片段6利用kpnⅰ和hindⅲ进行双酶切，得到dna片段6′；将pbad载体利用kpnⅰ和hindⅲ进行双酶切，得到pbad载体骨架；连接dna片段6′与pbad载体骨架得到重组载体，将得到的序列正确的重组载体命名为pbad-para-gfp，该重组载体中，para启动子(其序列为序列表中序列6)启动gfp基因的表达，其示意图如图10。

pbad-para-rpa-gfp：分别在实施例1的cerr-pa-gfp片段的5′端和3′端添加kpnⅰ和hindⅲ的识别序列及相应的保护碱基，将得到的dna片段记为dna片段7，将dna片段7利用kpnⅰ和hindⅲ进行双酶切，得到dna片段7′；连接dna片段7′与经kpnⅰ和hindⅲ酶切得到的pbad载体骨架，得到重组载体，将得到的序列正确的重组载体命名为pbad-para-rpa-gfp，该重组载体的示意图如图11。

2、目的基因表达量的检测

将pbad-pa-gfp、pbad-para-gfp和pbad-para-rpa-gfp分别导入大肠杆菌(e.coli)bw25113中，得到重组菌，将得到的重组菌分别命名为bw25113/pbad-pa-gfp、bw25113/pbad-para-gfp和bw25113/pbad-para-rpa-gfp。按照如下方法检测荧光强度：

(1)将bw25113/pbad-pa-gfp、bw25113/pbad-para-gfp和bw25113/pbad-para-rpa-gfp在含amp100μg/ml的lb平板上进行划线活化，从平板上接种bw25113/pbad-pa-gfp、bw25113/pbad-para-gfp和bw25113/pbad-para-rpa-gfp单克隆(各三个)于含amp100μg/ml的3mllb培养基中，37℃，200rpm培养12h。

(2)将步骤(1)得到的菌液按1％接种量接种于含amp100μg/ml的10mllb培养基中，37℃，200rpm培养48h，期间每隔2h取200μl样品(每个克隆取两个重复)于黑色96孔板中检测荧光强度。

(3)荧光检测利用多功能荧光读板仪synergytmh4(美国biotek)进行检测，激发波长为488nm，吸收波长为511nm。

结果显示，pa启动子基本不启动目的基因的转录，bw25113/pbad-pa-gfp中gfp基本不表达；para启动子可以启动gfp基因的转录，bw25113/pbad-para-gfp中gfp表达量一直维持低水平；在加入rpa启动子增强系统后，gfp的表达量显著提高，在培养32h时，bw25113/pbad-para-rpa-gfp中的gfp表达量是bw25113/pbad-para-gfp的13倍(图12)，表明，rpa启动子增强系统可以提高目的基因在大肠杆菌中的表达量。

实施例3、rpa可以提高目的蛋白在乳酸菌中的表达量

1、重组载体的构建

pmg36e-pa-gfp：以pmg36e载体为模板进行pcr扩增得到pmg36e线性化载体，在序列上pmg36e线性化载体与pmg36e载体相比缺少p32启动子片段，pmg36e线性化载体的序列为序列表中序列7；利用gibson连接将实施例1的pa-gfp片段连入pmg36e线性化载体中，得到重组质粒，将得到的序列正确的重组质粒命名为pmg36e-pa-gfp，该重组载体中，pa启动子启动gfp基因的表达，其示意图如图13。

pmg36e-p32-gfp：分别在gfp基因(其序列为序列1的第549-1265位)的5′端和3′端添加xbaⅰ及hindⅲ的识别序列及相应的保护碱基，将得到的dna片段记为dna片段8，将dna片段8利用xbaⅰ及hindⅲ进行双酶切，得到dna片段8′；将pmg36e载体利用xbaⅰ和hindⅲ进行双酶切，得到pmg36e载体骨架；连接dna片段8′与pmg36e载体骨架得到重组载体，将得到的序列正确的重组载体命名为pmg36e-p32-gfp，该重组载体中，p32启动子(其序列为序列表中序列8)启动gfp基因的表达，其示意图如图14。

pmg36e-p32-rpa-gfp：分别在实施例1的cerr-pa-gfp片段的5′端和3′端添加hindⅲ及kpnⅰ的识别序列及相应的保护碱基，将得到的dna片段记为dna片段9，将dna片段9利用hindⅲ及kpnⅰ进行双酶切，得到dna片段9′；连接dna片段9′与经hindⅲ及kpnⅰ酶切得到的pmg36e载体骨架，得到重组载体，将得到的序列正确的重组载体命名为pmg36e-p32-rpa-gfp，该重组载体的示意图如图15。

2、目的基因表达量的检测

将pmg36e-pa-gfp、pmg36e-p32-gfp和pmg36e-p32-rpa-gfp分别导入干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)atcc27092和乳酸乳球菌(lactococcuslactis)mg1363中，得到重组菌，将得到的重组菌分别命名为27092/pmg36e-pa-gfp、27092/pmg36e-p32-gfp、27092/pmg36e-p32-rpa-gfp、mg1363/pmg36e-pa-gfp、mg1363/pmg36e-p32-gfp和mg1363/pmg36e-p32-rpa-gfp。按照如下方法检测荧光强度：

(1)27092/pmg36e-pa-gfp、27092/pmg36e-p32-gfp、27092/pmg36e-p32-rpa-gfp在含erm5μg/ml的mrs平板上进行划线活化，mg1363/pmg36e-pa-gfp、mg1363/pmg36e-p32-gfp和mg1363/pmg36e-p32-rpa-gfp在erm5μg/ml的gm17平板上进行划线活化，从平板上接种活化的单克隆(各三个)于3mlmrs或gm17培养基中，抗生素浓度为erm5μg/ml,37℃，200rpm培养12h。

(2)将步骤(1)得到的菌液按1％接种量接种于mrs(ph6.8)或gm17培养基中，抗生素浓度为erm5μg/ml,37℃，200rpm培养24h(27092)或30h(mg1363)，期间每隔6h取500μl样品(每个克隆取两个重复)离心去上清，菌体沉淀用500μlph8.0的pbs洗一次，菌体沉淀用500μlph8.0的pbs重悬，取200μl菌悬液于黑色96孔板中检测荧光强度。

(3)荧光检测利用多功能荧光读板仪synergytmh4(美国biotek)进行检测，激发波长为488nm，吸收波长为511nm。

结果显示，pa启动子基本不启动目的基因的转录，27092/pmg36e-pa-gfp和mg1363/pmg36e-pa-gfp中gfp基本不表达；p32启动子可以启动gfp基因的转录，27092/pmg36e-p32-gfp和mg1363/pmg36e-p32-gfp中gfp表达量一直维持低水平；在加入rpa启动子增强系统后，gfp的表达量显著提高，在培养12h时，27092/pmg36e-p32-rpa-gfp中的gfp表达量是27092/pmg36e-p32-gfp的74倍(图16)，mg1363/pmg36e-p32-rpa-gfp中的gfp表达量是mg1363/pmg36e-p32-gfp的12倍(图17)。表明，rpa启动子增强系统可以提高目的基因在乳酸菌(干酪乳杆菌和乳酸乳球菌)中的表达量。

<110>中国科学院微生物研究所

<120>启动子增强系统及其在细菌中的应用

<160>8

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1265

<212>dna

<213>人工序列

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<212>dna

<213>人工序列

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