本发明属于生物
技术领域：
，涉及一种抗塞尼卡谷病毒的双峰驼vhh重链抗体库。此外，本发明还涉及到该抗体文库的构建方法、库容量鉴定和用途。
背景技术：
：塞尼卡谷病毒(senecavalleyvirus，svv)，也称为塞尼卡病毒a(sva)，其属于小rna病毒科塞尼卡病毒属(与口蹄疫病毒同科不同属)，也是该属的唯一成员。基因组为单链正股rna。像其他小rna病毒科成员一样，svv具有直径约25-30nm的无包膜衣壳，呈二十面体对称性。svv基因组长度大约为7.2kb，包含一个独特的开放阅读框(orf)，其两侧为5’非翻译区(μtr)(约668个核苷酸)和3’非翻译区(约68个核苷酸)，其中3’μtr后面是聚(a)尾巴。svv编码区编码2181个氨基酸的多聚蛋白前体，多聚蛋白前体可以被切割成前导蛋白和三个主要的多聚蛋白(p1、p2和p3)。p1基因组区域编码构成病毒衣壳的结构蛋白(vp4，vp2，vp3和vp1)，而p2和p3基因组区域编码参与病毒复制的7个非结构蛋白(2a，2b，2c，3a，3b，3c和3d)。塞尼卡谷病毒(senecavalleyvirus，svv)感染猪能引起猪的原发性水泡病，临床症状与口蹄疫无法区别。svv先后在美国(2015、2016、2017年)、加拿大(2007、2011、2015、2016年)、巴西(2014、2015年)、哥伦比亚(2016年)、中国(2015、2016、2017年)和泰国(2016年)等国家引发疫情。2015年，传入中国以来，2015-2016年呈散发，2017年以来，svv先后在福建、广东、广西、河南(11个县区)、河北、山东、辽宁等省迅速扩散开来，引起大量猪场发病，且存在svv和fmdv混合感染病例。然而，至今仍svv的流行底细不明，还没有商品化的疫苗和诊断试剂可用，svv仍然处于失控状态，svv防控形式严峻。并且因临床发病症状与口蹄疫相似，且能混合感染，对口蹄疫防控形成严重干扰。1993年hamers等报道，骆驼血液中的抗体有一半天然缺失轻链和重链恒定区1(ch1)，克隆这种抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体(variabledomainofheavychainofheavy2chainantibody，vhh)，现已被重新命名为“纳米抗体”(nanobody)，它是具有完整功能的最小的抗原结合片段。纳米抗体从发现至今，已经发展为有广泛生物应用价值和临床应用价值的高度通用分子。纳米抗体具有高度稳定性和与抗原结合的高亲合力，能与蛋白裂隙和酶活性位点的相互作用，其作用类似于抑制剂。因此，纳米抗体可以为从肽模拟药物设计小分子酶抑制物提供新的思路。由于仅有重链，纳米抗体的制造较mab容易。纳米抗体的独特性质，如处于极端温度和ph环境中的稳定性，还具有常规单域抗体无法比拟的水溶性和构象稳定性。这种单体结构域能高特异性、高亲和力地与抗原结合，从而中和或封闭相对隐蔽的抗原表位。凭借以上特性纳米抗体与普通单域抗体相比有很大优势。纳米抗体是目前可以得到的具有完整功能、稳定、可结合抗原的最小单元，由于相对分子质量小、稳定性强、可溶性好、抗原结合性能好、易表达及免疫原性低等特点成为当前分子影像研究中的重要靶分子，这为工程化抗体提供了一个良好的来源，具有广阔的应用前景。因此，纳米抗体在疾病的治疗和诊断中具有很大的价值。因此，综合目前在抗体领域的研究和利用情况，不难发现传统抗体类药物仍面临着挑战，有必要设计和生产新一代更有效的抗体分子以满足临床的需要。特别是如何实现抗体小型化，使其高效作用于特定部位。为此，实现抗体小型化靶向癌细胞内效应分子或者其他靶细胞一直是抗体工程与抗癌研究的重要目标和研究热点。抗体库的容量和多样性很大程度上影响从中淘选出特异性抗体的概率以及抗体的亲和力。自1976年构建的第一个cdna文库以来，其方法不断的改进，其中smart(switchingmechanismat5’endofthernatranscript)方法构建的cdna文库能够代表原有样品中mrna的丰度，保持了生物遗传信息的完整性。而且该方法只需要25ng的mrna或者50ng的totalrna就可以得到高质量、高产量的cdna库，更重要的是得到的cdna能够代表原有样品中的mrna的丰度，可以应用于直接扩增基因、构建cdna文库。综上所述，通过建立抗体库筛选具有svv特异性、生物学活性好、结合抗原能力强、具有潜在中和功能的抗体，尤其是纳米抗体之类的新型抗体，对于建立敏感的svv的临床诊断方法，研究病毒的感染机理具有极其重要的意义。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种抗塞尼卡谷病毒vhh抗体的酵母cdna文库及其构建方法。为了达到上述目的，本发明采用的技术手段如下：本发明的一种抗塞尼卡谷病毒vhh抗体的酵母cdna文库的构建方法，其包括以下步骤：步骤(1)淋巴细胞分离：从塞尼卡谷灭活疫苗免疫的骆驼的外周血中分离得到淋巴细胞，保存备用；步骤(2)淋巴细胞总mrna的提取：提取步骤(1)分离得到的淋巴细胞的总mrna；步骤(3)全基因cdna合成：以步骤(2)提取的淋巴细胞的总mrna为模板，合成全基因cdna；步骤(4)第一轮扩增：以步骤(3)合成的全基因cdna为模板，以p1、r1为引物进行第一轮扩增，扩增程序为：95℃1min；95℃15s，68℃5min，20个循环；68℃5min，将扩增产物电泳，纯化收集600bp产物，-20℃保存备用；seqidno.1-p1:5-gtcctggctgctcttctacaagg-3seqidno.2-r1:5-ggtacgtgctgttgaactgttcc-3步骤(5)第二轮扩增：以第一轮扩增产物为模板，以p2、r2为引物进行第二轮扩增，扩增程序为：95℃1min；95℃15s，68℃5min，20个循环；68℃5min；扩增产物电泳，纯化收集400bp产物，置-20℃保存备用；seqidno.3-p2:5-ttccacccaagcagtggtatcaacgcagagtgggagtctgggggagg-3seqidno.4-r2:5-gtatcgatgcccaccctctagaggccgaggcggccgacatggagacggtgacctgggt-3步骤(6)文库的构建和收获：制备酵母感受态细胞，每600μl感受态细胞转化20μl第二轮扩增产物和6μlpgadt7-rec载体，将转化的菌液均匀涂布于sd/-leu平板上，30℃倒置培养3-5d直至克隆出现；再次将平板置于4℃冰箱，放置3-4h，给每块平板加入含25％(v/v)甘油的ypda液体培养基，并加入无菌玻璃珠，水平方向反复摇动，之后收集菌液，即得抗塞尼卡谷病毒vhh抗体的酵母cdna文库。在本发明中，优选的，所述的淋巴细胞分离是采用骆驼外周血淋巴细胞的分离试剂盒(产品编号：lts1076，购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)按照以下步骤进行：(1)塞尼卡谷病毒灭活疫苗免疫的骆驼的抗凝血中加入等体积量的样本稀释液，混匀，得到抗凝血的稀释液；(2)按照样本稀释液与淋巴细胞分离液体积比为5:9的比例，量取淋巴细胞分离液，之后先慢后快加入抗凝血的稀释液，水平离心机1800rpm，18-22℃离心20min；(3)小心收集淋巴细胞层于新的收集管，以5倍量细胞洗涤液稀释，水平离心机1000rpm，18-22℃离心10min；弃上清，沉淀再用细胞洗涤液稀释，水平离心机1000rpm，18-22℃离心10min；沉淀用5ml无rna酶水重悬，随即加入45mlrpim-1640培养液混匀，1000rpm，18-22℃离心10min，沉淀即为淋巴细胞，并将其重悬于rnalater保存液中，置-70℃保存备用。在本发明中，优选的，所述的淋巴细胞总mrna的提取按照以下方法进行：吸取步骤(1)分离得到的淋巴细胞液400μl，加入1mltrizol，混匀，4℃静置5min；加入200μl三氯甲烷，混匀，室温静置3min，12000r/min，4℃离心15min；吸取750μl上清，加等量异丙醇，室温静置10min，10000r/min，4℃离心10min；轻弃上清，沉淀加75％乙醇，8000r/min，4℃，离心5min；沉淀置通风橱10min使之干燥；20μl无rna酶的水溶解的沉淀即为收获的总mrna。在本发明中，优选的，所述的全基因cdna合成是采用smartcdna文库构建试剂盒，在0.2ml的pcr扩增管中依次加入下列组分：mrna3μlsmart1μlcdsⅲ1μl混匀后，将离心管放置于72℃金属浴，孵育2min，立即置冰上，冷却2min，然后再依次加入下列组分：5×firststrandbμffer2μldtt(20mm)1μldntpmi×(10mm)1μlmmlv逆转录酶(200μ/μl)1μl混匀后，将离心管放置于42℃金属浴，反转录1h，室温冷却，加入1μlrna酶h，得到的产物为全基因组cdna，置-20℃保存备用。在本发明中，优选的，所述的第一轮扩增是采用smartcdna文库构建试剂盒，在0.2ml的pcr扩增管中依次加入下列组分：10×pcr缓冲液10μl10×溶解液10μl50×聚合酶混合物2μl50×dntp2μlp1引物2μlr1引物2μl全基因组cdna2μlh2o70μl在步骤(4)所述扩增程序下进行第一轮扩增，将扩增产物电泳，纯化收集600bp产物，-20℃保存备用。在本发明中，优选的，所述的第二轮扩增是采用smartcdna文库构建试剂盒，在0.2ml的pcr扩增管中依次加入下列组分：10×pcr缓冲液10μl10×溶解液10μl50×聚合酶混合物2μl50×dntp2μlp2引物2μlr2引物2μl第一轮扩增产物2μlh2o70μl在步骤(5)所述扩增程序下进行第二轮扩增，扩增产物电泳，凝胶回收试剂盒从凝胶中纯化收集400bp产物，置-20℃保存备用。在本发明中，以上涉及cdna合成所采用的试剂盒为smartcdna文库构建试剂盒(产品编号：634901，购自宝生物公司)。进一步的，本发明还提出了按照以上所述的方法构建得到的抗塞尼卡谷病毒vhh抗体的酵母cdna文库。在本发明中，所述的文库中cdna分布在400-2000bp之间，滴度为5.5×106cfμ/ml，重组率为100％。更进一步的，本发明还提出了所述的抗塞尼卡谷病毒vhh抗体的酵母cdna文库在筛选抗塞尼卡谷病毒vhh抗体中的用途。本发明相对现有技术的有益效果：本发明对所构建的抗塞尼卡谷病毒vhh抗体的酵母cdna文库的容量及多态性进行了鉴定，结果表明该文库滴度约为7.2×106cfμ/ml。从sd/-leu平板上随机挑取16个克隆进行菌落pcr，电泳结果显示文库插入片段均不同，分布在400-2000bp之间，如图4所示，平均插入片段约为1000bp，说明所构建的文库的多样性好。由菌落pcr结果可以得知文库的重组率为100％。采用血凝抑制试验对抗塞尼卡谷病毒vhh抗体的酵母cdna文库进行初步功能性鉴定，表明所构建的酵母文库中存在具有中和活性的抗塞尼卡谷病毒vhh抗体。本发明的提出为筛选抗塞尼卡谷病毒vhh抗体提供了平台，并且为塞尼卡谷的早期治疗和诊断提供了新的技术手段。附图说明图1.为骆驼外周血淋巴细胞总rna电泳图；m.dl5000相对分子质量标准；1.骆驼外周血淋巴细胞总rna；图2.为骆驼外周血淋巴细胞dscdna第二轮扩增琼脂糖凝胶电泳图；m.dl2000相对分子质量标准；1.第一轮扩增dsdna，600bp；图3.为骆驼外周血淋巴细胞dscdna第二轮扩增琼脂糖凝胶电泳图；m.dl2000相对分子质量标准；1.第二轮扩增dsdna，400bp；图4.为骆驼外周血淋巴细胞酵母双杂交cdna文库单克隆pcr扩增结果；m.dl5000相对分子质量标准；1-16:酵母菌落的pcr结果。图5.为抗塞尼卡谷病毒的vhh基因的pcr扩增结果；m:dl200dna分子质量标准；1,2：vhhpcr扩增产物图6.为表达载体pmal-c2x-vhh的双酶切鉴定结果；m.dl5000dna分子质量标准；1,2,3:pmal-c2x-vhh双酶切产物；图7.为vhh基因的表达结果；m1和m2：蛋白质分子质量标准；1:pmal-c2x全蛋白；2:pmal-c2x上清；3:pmal-c2x沉淀；4:pmal-c2x-1全蛋白；5:pmal-c2x-1上清；6:pmal-c2x-1沉淀；图8.为vhh基因的westernblotting检测结果。m1和m2：蛋白质分子质量标准；1:pmal-c2x全蛋白；2:pmal-c2x上清；3:pmal-c2x沉淀；4:pmal-c2x-1全蛋白；5:pmal-c2x-1上清；6:pmal-c2x-1沉淀。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。实施例1抗塞尼卡谷病毒vhh抗体的酵母cdna文库的构建1.材料与方法1.1材料1.1.1试验动物、抗原、佐剂和塞尼卡谷病毒抗体检测试剂盒1峰雄性双峰驼(1周岁)，1峰雌性双峰驼(6个月大)；塞尼卡谷病毒灭活疫苗，svv抗体elisa检测试剂盒购自idexx。1.1.2菌株和试剂酵母文库相关载体购自clontech，限制性内切酶购自neb、骆驼外周血淋巴细胞的分离试剂盒(产品编号：lts1076)购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司、trizol、镍亲和层析树脂、dna片段回收试剂盒和质粒提取试剂盒为omega产品、smartcdna文库构建试剂盒(产品编号：634901)以及pcr相关试剂购自宝生物公司、分子生物学试剂来自sigma公司；其他生化试剂均为国产分析纯。1.2方法1.2.1抗原接种剂量、免疫程序和血清抗体效价的测定在双峰驼的颈部皮下、背部皮下和后腿皮下进行分点接种塞尼卡谷病毒灭活疫苗，每个部位不少3个接种点。首次免疫前和每次免疫后采集静脉血，用svv抗体elisa检测试剂盒检测血清抗体效价，检测抗体阻断率大于70％时静脉采血。具体动物免疫程序和抗原接种剂量见表1：表1双峰驼免疫程序和抗原剂量免疫次数首免二免三免剂量(ml/头份)103030与首免间隔时间(天)021351.2.2淋巴细胞分离测定抗体效价达到要求后，颈静脉采集骆驼抗凝血100ml。淋巴细胞分离按照天津灏洋tbd骆驼外周血淋巴细胞分离试剂盒操作说明进行，具体为：向采集的抗凝血中加入等量的样本稀释液，混匀；按照样本稀释液与淋巴细胞分离液体积比为5:9的比例，量取淋巴细胞分离液，之后先慢后快加入稀释好的抗凝血，水平离心机1800rpm，18-22℃离心20min；小心收集淋巴细胞层于新的收集管，以5倍量细胞洗涤液稀释之，水平离心机1000rpm，18-22℃离心10min；弃上清，沉淀再用细胞洗涤液稀释，水平离心机1000rpm，18-22℃，离心10min；弃上清，沉淀即为分离到的淋巴细胞，取悬浮细胞上清液并且计数后并悬浮于rna保存液(rnalater)中，置-70℃保存备用。1.2.3淋巴细胞总mrna的提取吸取上述淋巴细胞液400μl，加入1mltrizol，混匀，4℃静置5min；加入200μl三氯甲烷，混匀，室温静置3min，12000r/min，4℃离心15min；吸取750μl上清，加等量异丙醇，室温静置10min，10000r/min，4℃离心10min；轻弃上清，沉淀加75％乙醇，8000r/min，4℃离心5min；沉淀置通风橱10min使之干燥；20μl无rna酶的水溶解的沉淀即为收获的总mrna。1.2.4文库制备引物的设计第一轮扩增引物：seqidno.1-p1:5-gtcctggctgctcttctacaagg-3seqidno.2-r1:5-ggtacgtgctgttgaactgttcc-3第二轮扩增引物：seqidno.3-p2:5-ttccacccaagcagtggtatcaacgcagagtgggagtctgggggagg-3seqidno.4-r2:5-gtatcgatgcccaccctctagaggccgaggcggccgacatggagacggtgacctgggt-31.2.5cdna合成双链及纯化1.2.5.1全基因cdna合成在0.2ml的pcr扩增管中依次加入下列组分：试剂材料体积mrna3μlsmart1μlcdsⅲ1μl总体积5μl混匀，将离心管放置于72℃金属浴，孵育2min，立即置冰上，冷却2min，依次加入下列组分：试剂材料体积5×firststrandbμffer2μldtt(20mm)1μldntpmix(10mm)1μlmmlv逆转录酶(200μ/μl)1μl总体积5μl混匀，将离心管放置于42℃金属浴，反转录1h，室温冷却，加入1μlrna酶h，得到的产物为全基因组cdna，置-20℃保存备用。1.2.5.2第一轮扩增在0.2ml的pcr扩增管中依次加入下列组分：上述扩增程序:95℃1min；95℃15s，68℃5min，20个循环；68℃5min。将扩增产物电泳，采用凝胶回收试剂盒从凝胶中纯化收集600bp产物，-20℃保存备用。1.2.5.3第二轮扩增在0.2ml的pcr扩增管中依次加入下列组分：试剂材料(reagent)数量(amoμnt)10×pcr缓冲液10μl10×溶解液10μl50×聚合酶混合物2μl50×dntp2μlp2引物2μlr2引物2μl第一轮扩增产物2μlh2o70μl总体积100μl上述扩增程序:95℃1min；95℃15s，68℃5min，20个循环；68℃5min。扩增产物电泳，采用凝胶回收试剂盒从凝胶中纯化收集400bp产物，置-20℃保存备用。1.2.6文库的构建和收获采用peg/liac法制备酵母y187感受态细胞。每600μl感受态细胞转化20μl双链cdna和6μlpgadt7-rec，将转化的菌液均匀涂布于直径100mm的和150mm的sd/-leu平板上，30℃倒置培养3-5d直至克隆出现。再次将平板置于4℃冰箱，放置3-4h。给每块平板加入5ml冻存液(ypda液体培养基含25％甘油)，并加入无菌玻璃珠，水平方向反复摇动，之后收集菌液。1.2.7文库的质量评价取共转化产物菌液，按1/10、1/100和1/1000稀释，分别涂100μl稀释液至100mmsd/-leu平板，30℃倒置培养3-5d直至克隆出现，此时对生长的单菌落计数，并计算文库容量。随机挑取16个单菌落，用pgadt-rec通用测序引物进行菌落pcr，分析文库插入片段的大小以及重组率。pcr反应参数:94℃预变性5min；94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸2min，共30个循环，最后72℃延伸10min。取7μlpcr产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳分析。2.结果2.1骆驼外周血淋巴细胞总rna的提取及mrna的分离纯化提取的总rna经紫外分光光度计测定，浓度为5077ng/μl，od260/od280为1.98。变性琼脂糖凝胶电泳可见28s、18s、5s3条清晰带，28s:18s约为2:1。说明rna和mrna纯度较高，满足文库构建的需要(图1)。2.2双链cdna文库的琼脂糖凝胶电泳取第一轮扩增的dscdna产物进行电泳，收集600bp条带。取第二轮扩增的dscdna产物进行电泳，收集400bp条带。如图2、图3所示。2.3文库容量及多态性鉴定对涂布不同稀释度文库的平板进行单菌落计数，根据公式：文库滴度＝平板上菌落数/平铺菌液体积(ml)×稀释因子，经计算pgadt7-rec文库滴度约为5.5×106cfμ/ml。从sd/-leu平板上随机挑取16个克隆进行菌落pcr，电泳结果显示文库插入片段均不同，分布在400-2000bp之间，平均插入片段约为1000bp，说明所构建的文库的多样性较好，如图4所示。由菌落pcr结果可以得知文库的重组率为100％。实施例2抗塞尼卡谷病毒vhh抗体的酵母cdna文库在筛选抗塞尼卡谷病毒vhh抗体中的用途1、实验材料及方法1.1塞尼卡谷vhh基因的扩增采用plasmidmidikitomega酵母质粒提取试剂盒提取实施例1中酵母文库质粒，同时针对vhh结构特点设计扩增引物，并在上下游引物的5′端分别引入ecori和xholi酶切位点，上、下游引物序列分别为：vf:5’-ccggaattcatgggtatcaacgcagag-3’；vr:5’-ccctcgagcatggagacggtgacc-3’，扩增体系为50μl：10×pcrbμffer5μl，dntp4μl，引物1μl，taq酶1μl，ddh2o39μl，进行pcr扩增，反应条件为94℃预变性5min；94℃变性50s，57℃退火40s，72℃延伸1min,共30个循环；72℃再延伸10min，4℃5min。pcr产物于10g/l的琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。1.2vhh基因的胶回收纯化按宝生物凝胶片段回收试剂盒操作进行，具体如下：在紫外灯下将符合vhh基因大小的条带从凝胶上切下，按0.1g胶加100μlpc液的比例加入pc，50℃水浴溶解10min至凝胶完全溶解；溶解后的胶溶液倒入平衡后的柱子，12000rmp离心1min，弃去废液，回收柱子；在柱子中加入600μl漂洗液pw，12000rmp离心1min，弃废液，并重复洗脱柱子一次。12000rmp空离2min，室温放置4-5min，目的是使乙醇蒸发。将柱子放入1.5ml的ep管中，加入30μl65℃加热过的去离子水。静置1-2min。12000rmp离心1min，收集离心液体。1.3pmal-c2x-vhh的构建与鉴定使用ecori和xholi双酶切，酶切pcr回收产物和表达载体pmal-c2x-1，回收纯化后使用t4dna连接酶将酶切后的vhh与pmal-c2x-14℃连接过夜。连接产物转化bl21感受态细胞中，涂布于氨苄抗性的lb固体平板上培养直到有菌落出现，再挑单菌落接到卡那抗性的lb液体培养基中，摇床上37℃过夜培养，提质粒做双酶切鉴定并将阳性质粒送去测序验证。1.4重组目的蛋白的纯化将阳性菌液加入于100ml含amp的lb液体培养基中，加入iptg进行诱导，od600值不再增长时，5000r/min离心5min收获菌体沉淀。加入10ml1×ibwashbμffer重悬沉淀，按novagen蛋白纯化试剂盒说明书进行纯化，分步洗脱并收集目的蛋白洗脱液即为塞尼卡谷vhh抗体蛋白。1.5vhh活性检测采用塞尼卡谷间接elisa抗体测试剂盒，按照操作说明书的要求对表达的vhh进行稀释，并对其效价进行测定。2.结果2.1抗塞尼卡谷病毒的vhh基因的pcr扩增pcr产物经10g/l琼脂糖凝胶电泳检测得到一条清晰特异性条带，大小约400bp，与预期片段大小一致(见图5)。这说明从构建的酵母文库中成功扩增到了vhh基因。2.2表达载体pmal-c2x-vhh的双酶切分析重组质粒用ecori和xholi限制性内切酶双酶切分析，得到约400bp和5000bp大小片段，与预期结果一致(见图6)。测序结果证明vhh基因成功插入表达载体，可用于后续试验。2.3vhh基因的表达28℃诱导后出现1条大小为37kda的特异蛋白条带，结果与预期相符(见图7)，并随诱导时间的延长而变浓，诱导后12h表达量达高峰。2.4表达的塞尼卡谷vhh抗体反应活性检测表达产物采用western-blotting检测表达的塞尼卡谷vhh抗体活性。western-blotting检测结果表明所表达的vhh可与塞尼卡谷病毒发生反应(图8)。以上所述的实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。organizationapplicant----------------------street:兰州市城关区盐场堡徐家坪1号city:兰州state:甘肃country:中国postalcode:730046phonenumber:0931-8342982faxnumber:0931-8340977emailaddres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