本发明属于酶提取技术领域，尤其涉及一种菠萝蛋白酶的高效提取方法。
背景技术：
菠萝蛋白酶能分解蛋白质、肽、酯和酰胺等，可用于肉质嫩化、啤酒澄清和干酪生产等。此外，菠萝蛋白酶具有消炎、免疫刺激和抗水肿等作用，可用于炎症、水肿、支气管炎和急性肺炎等的治疗。菠萝蛋白酶已在食品、化妆品和医药等领域得到广泛的应用。
菠萝蛋白酶广泛存在于菠萝的果实、叶、茎和皮等部位中，根据提取部位的不同，菠萝蛋白酶可分为果菠萝蛋白酶(ec3.4.22.5)和茎菠萝蛋白酶(ec3.4.22.4)两种。果菠萝蛋白酶主要是从菠萝果实中提取得到，等电点为4.6，分子量约为30000，含糖量较高。茎菠萝蛋白酶主要是从菠萝果皮和茎中提取得到，等电点为9.5，分子量约为33000，其含糖量低，并且其糖组分是通过n-糖苷键与酶分子的天冬酰胺残基共价链接，使茎菠萝蛋白酶的结构明显区别于其他蛋白酶的结构。
菠萝蛋白酶的提取包括吸附法、沉淀法、超滤法和色谱法等。吸附法所用的吸附剂包括高岭土和纳米二氧化钛，使菠萝蛋白酶经吸附沉淀后再洗脱得到菠萝蛋白酶。沉淀法包括盐析法、乙醇沉淀法和等电点沉淀法等。超滤法凭借离心力或压力差，通过对超滤膜孔径的选择，实现不同分子量大小的物质的截留或透过，超滤法提取菠萝蛋白酶具有无相变、酶活力稳定、回收率较高、糖酸比不会改变的优点，在工业化生产中得到较广泛的应用，但存在容易堵塞的问题，影响了生产效率，且后续往往需要进行反渗透除去与菠萝蛋白酶分子量相近的杂蛋白。
中国专利申请cn1091152公开了一种菠萝蛋白酶的物理提取方法，通过将菠萝植株原料进行冷冻预处理后破碎榨汁，调节ph后过滤，经超滤和反渗透得到浓缩酶液，再经冷冻干燥得到菠萝蛋白酶；该方法所使用的化学助剂较少，但酶活力和纯度较低，杂蛋白的含量较高。中国专利申请cn104611316公开了一种提取菠萝蛋白酶的方法，在获得菠萝汁后通过超滤设备进行透析降低电导率，再进行调节ph和冷却使菠萝蛋白酶产生絮状沉淀，分离酶膏后冷冻干燥得到菠萝蛋白酶成品，具有酶活损失较少的优点，但存在纯度较低的不足。
我国的菠萝资源丰富，每年因菠萝生产产生的副产物菠萝茎近百万吨，从菠萝茎中分离提取不仅可以得到较高酶活的茎菠萝蛋白酶，还可以实现废物再利用，减少环境的污染。因此，提供一种酶活力和纯度较高的茎菠萝蛋白酶的提取方法具有重要意义。
技术实现要素：
为解决现有技术中存在的问题，发明人通过向菠萝汁中加入茶多酚和乙二胺四乙酸二钠后，加入茶皂素和壳寡糖，预料不到地发现：能促进菠萝蛋白酶以外的杂蛋白和大颗粒物质的吸附沉淀，由于茶多酚的结合保护作用，仅少量菠萝蛋白酶被壳寡糖吸附而发生絮凝或沉淀，从而在实现消泡效果的同时，有效去除了大颗粒物质和分子量约为28kd和45kd的杂蛋白，减少了后续超滤的堵塞发生，提高了超滤效率。基于上述发现，从而完成本发明。
本发明的目的将通过下面的详细描述来进一步体现和说明。
本发明提供一种菠萝蛋白酶的高效提取方法，包括如下步骤：
s1菠萝汁的获取：收集菠萝原料，预冷冻后，经破碎或捣碎后压榨，收集菠萝汁；
s2上清液的获取：向所述菠萝汁中加入茶多酚和乙二胺四乙酸二钠，混匀后再加入茶皂素和壳寡糖，先快速搅拌再慢速搅拌，然后于2～10℃、3000～5000rpm条件下离心5～10min，收集上清液；茶多酚的加入量为菠萝汁重量的0.01～0.05％，乙二胺四乙酸二钠的加入量为菠萝汁重量的0.01～0.1％，茶皂素的加入量为菠萝汁重量的0.01～0.1％，壳寡糖的加入量为菠萝汁重量的0.05～0.2％；
s3上清液的超滤：对所述上清液先采用截留分子量为50kd的超滤膜进行超滤浓缩，然后再采用截留分子量为20kd的超滤膜进行超滤浓缩至所述上清液体积的18～25％，超滤温度为2～10℃，超滤压力为0.02～0.15mpa，得到超滤浓缩液；
s4超滤浓缩液的真空冷冻干燥：将所述超滤浓缩液进行真空冷冻干燥，得到菠萝蛋白酶。
采用上述技术方案，通过向菠萝汁中加入茶多酚和乙二胺四乙酸二钠后，加入茶皂素和壳寡糖，先快速搅拌再慢速搅拌，提高了壳寡糖对杂蛋白(包括分子量约为28kd和45kd的杂蛋白)等的吸附效率，在超滤前有效去除了菠萝蛋白酶以外的杂蛋白和大颗粒物质，减少了后续超滤的堵塞和污染发生，提高了超滤效率；提取过程中的酶活损失少，通过先后经截留分子量为50kd、20kd的超滤膜，在提高超滤效率的同时获得较高的酶活截留率，得到的菠萝蛋白酶中的杂蛋白含量较少，纯度较高。令发明人惊奇的是，当茶多酚的加入量达到菠萝汁重量的0.2％时，会促进菠萝蛋白酶的沉淀，因此需要将茶多酚的加入量控制在菠萝汁重量的0.01～0.05％。
优选地，所述快速搅拌的转速为300～600r/min，快速搅拌的时间为5～10min；所述慢速搅拌的转速为50～200r/min，快速搅拌的时间为5～20min。在茶皂素降低了菠萝汁的表面张力的基础上，通过壳寡糖的电中和以及架桥作用，促进菠萝蛋白酶以外的杂蛋白和大颗粒物质的絮凝或吸附沉淀，先快速搅拌，使壳寡糖与杂蛋白等进行充分接触，但快速搅拌时间不宜过长，否则搅拌产生的剪切作用可能使形成的吸附物再次分散。因此，先以300～600r/min的较快转速搅拌5～10min后再以50～200r/min的较慢转速搅拌5～20min，可以实现较好的吸附沉淀效果，经3000～5000rpm条件离心实现了杂蛋白等的去除。
更优选地，所述步骤s2中，快速搅拌的转速为500r/min，快速搅拌的时间为8min；所述慢速搅拌的转速为100r/min，慢速搅拌的时间为10min。
优选地，所述步骤s2中，茶多酚的加入量为菠萝汁重量的0.01～0.03％，乙二胺四乙酸二钠的加入量为菠萝汁重量的0.02～0.08％，茶皂素的加入量为菠萝汁重量的0.02～0.08％，壳寡糖的加入量为菠萝汁重量的0.1～0.18％。
更优选地，所述步骤s2中，茶多酚的加入量为菠萝汁重量的0.02％，乙二胺四乙酸二钠的加入量为菠萝汁重量的0.05％，茶皂素的加入量为菠萝汁重量的0.05％，壳寡糖的加入量为菠萝汁重量的0.15％。
优选地，所述步骤s3中，超滤温度为4～6℃，超滤压力为0.05～0.1mpa。由于在超滤前去除了大颗粒物质和部分杂蛋白，因此超滤效率较高，且酶活截留率也高，膜通量高达82.5ml/s。超滤的温度和压力不宜过高，否则会影响菠萝蛋白酶的酶活。
优选地，所述菠萝原料选自菠萝皮和/或菠萝茎。
优选地，所述步骤s1中，破碎或捣碎的过程中加入木质素酶，木质素酶的加入量为菠萝原料重量的0.002％～0.01％。加入木质素酶，能够有效水解菠萝细胞壁，有利于菠萝蛋白酶的充分释放。
优选地，所述步骤s1中，预冷冻的温度为-10～10℃，预冷冻的时间为5～24h。通过预冷冻，一方面利于菠萝蛋白酶的榨出，另一方面也利于菠萝蛋白酶的酶活保持。
优选地，所述超滤膜为聚醚砜超滤膜。
优选地，超滤后可进一步进行反渗透，以降低菠萝蛋白酶中的杂质和水分的含量，从而缩短后续干燥时间且提高目标产品的纯度，减少酶活的损失。
优选地，所述真空冷冻干燥的冷冻温度为-35～-10℃。
此外，本发明还提供一种菠萝蛋白酶，采用上述的菠萝蛋白酶的高效提取方法制得，菠萝蛋白酶的纯度较高，杂蛋白的含量较低。
与现有技术相比，本发明的有益效果包括：(1)通过向菠萝汁中加入茶多酚和乙二胺四乙酸二钠后，加入茶皂素和壳寡糖，先快速搅拌再慢速搅拌，提高了壳寡糖对杂蛋白等的吸附效率，在超滤前有效去除了大颗粒物质和菠萝蛋白酶以外的杂蛋白(包括分子量约为28kd和45kd的杂蛋白)，减少了后续超滤的堵塞和污染发生，提高了超滤效率；(2)提取过程中菠萝蛋白酶未发生变性，酶活损失少，通过先后经截留分子量为50kd、20kd的超滤膜，在保证较高超滤效率的同时获得较高的酶活截留率(高达90％以上)，得到的菠萝蛋白酶中的杂蛋白含量较少，纯度较高；(3)本发明提供的提取方法效率高，周期较短，避免了硫酸铵的使用，得到的菠萝蛋白酶的纯度较高，杂蛋白的含量较低。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明做进一步的详细说明。
本发明中，所使用原料和材料均为常规市售产品，或可通过本领域的常规技术手段获得。
实施例一菠萝汁的获取
收集菠萝茎和菠萝皮，-4℃预冷冻12h后，经破碎后压榨，收集菠萝汁。
实施例二菠萝汁的获取
收集菠萝茎，4℃预冷冻18h后，经捣碎后压榨，收集菠萝汁。
实施例三菠萝汁的获取
收集菠萝茎和菠萝皮，4℃预冷冻18h后，经破碎后压榨，破碎的过程中加入木质素酶，木质素酶的加入量为菠萝原料重量的0.005％，收集菠萝汁。
实施例四菠萝蛋白酶的高效提取
菠萝蛋白酶的高效提取方法，包括如下步骤：
s1菠萝汁的获取：按实施例一的方法获取菠萝汁；
s2上清液的获取：向所述菠萝汁中加入茶多酚和乙二胺四乙酸二钠，混匀后再加入茶皂素和壳寡糖，先快速搅拌再慢速搅拌，然后于4℃、4000rpm条件下离心6min，收集上清液；茶多酚的加入量为菠萝汁重量的0.02％，乙二胺四乙酸二钠的加入量为菠萝汁重量的0.05％，茶皂素的加入量为菠萝汁重量的0.05％，壳寡糖的加入量为菠萝汁重量的0.15％；快速搅拌的转速为500r/min，快速搅拌的时间为8min；所述慢速搅拌的转速为100r/min，慢速搅拌的时间为10min；
s3上清液的超滤：对所述上清液先采用截留分子量为50kd的超滤膜进行超滤浓缩，然后再采用截留分子量为20kd的超滤膜进行超滤浓缩至所述上清液体积的20％，超滤温度为4℃，超滤压力为0.1mpa，得到超滤浓缩液；
s4超滤浓缩液的真空冷冻干燥：将所述超滤浓缩液进行真空冷冻干燥，冷冻温度为-20℃，然后在40℃进行真空干燥，得到菠萝蛋白酶。
经步骤s2的吸附和离心处理后，在除去大颗粒物质和部分杂蛋白的同时，菠萝蛋白酶活损失较小，仅为4.3％。步骤s3的超滤所用时间为54min，酶活截留率为90.1％。最终得到的菠萝蛋白酶的酶活为3.41×106u/g，对菠萝蛋白酶进行电泳检测，在20kd和50kd之间未见菠萝蛋白酶以外的明显条带。
实施例五菠萝蛋白酶的高效提取
菠萝蛋白酶的高效提取方法，包括如下步骤：
s1菠萝汁的获取：按实施例一的方法获取菠萝汁；
s2上清液的获取：向所述菠萝汁中加入茶多酚和乙二胺四乙酸二钠，混匀后再加入茶皂素和壳寡糖，先快速搅拌再慢速搅拌，然后于4℃、4000rpm条件下离心6min，收集上清液；茶多酚的加入量为菠萝汁重量的0.03％，乙二胺四乙酸二钠的加入量为菠萝汁重量的0.08％，茶皂素的加入量为菠萝汁重量的0.08％，壳寡糖的加入量为菠萝汁重量的0.15％；快速搅拌的转速为500r/min，快速搅拌的时间为10min；所述慢速搅拌的转速为100r/min，慢速搅拌的时间为10min；
s3上清液的超滤：对所述上清液先采用截留分子量为50kd的超滤膜进行超滤浓缩，然后再采用截留分子量为20kd的超滤膜进行超滤浓缩至所述上清液体积的20％，超滤温度为4℃，超滤压力为0.1mpa，得到超滤浓缩液；
s4超滤浓缩液的真空冷冻干燥：将所述超滤浓缩液进行真空冷冻干燥，冷冻温度为-20℃,然后在42℃进行真空干燥，得到菠萝蛋白酶。
经步骤s2的吸附和离心处理后，在除去大颗粒物质和部分杂蛋白的同时，菠萝蛋白酶活损失较小，仅为4.7％。步骤s3的超滤所用时间为62min，酶活截留率为89.6％。最终得到的菠萝蛋白酶的酶活为3.29×106u/g，对菠萝蛋白酶进行电泳检测，在20kd和50kd之间未见菠萝蛋白酶以外的明显条带。
对比例1
菠萝蛋白酶的高效提取方法，包括如下步骤：
s1菠萝汁的获取：按实施例一的方法获取菠萝汁；
s2上清液的获取：向所述菠萝汁中加入l-半胱氨酸和乙二胺四乙酸二钠，混匀后再加入茶皂素和壳寡糖，先快速搅拌再慢速搅拌，然后于4℃、4000rpm条件下离心6min，收集上清液；l-半胱氨酸的加入量为菠萝汁重量的0.02％，乙二胺四乙酸二钠的加入量为菠萝汁重量的0.05％，茶皂素的加入量为菠萝汁重量的0.05％，壳寡糖的加入量为菠萝汁重量的0.15％；快速搅拌的转速为500r/min，快速搅拌的时间为8min；所述慢速搅拌的转速为100r/min，慢速搅拌的时间为10min；
s3上清液的超滤：对所述上清液先采用截留分子量为50kd的超滤膜进行超滤浓缩，然后再采用截留分子量为20kd的超滤膜进行超滤浓缩至所述上清液体积的20％，超滤温度为4℃，超滤压力为0.1mpa，得到超滤浓缩液；
s4超滤浓缩液的真空冷冻干燥：将所述超滤浓缩液进行真空冷冻干燥，冷冻温度为-20℃，然后在40℃进行真空干燥，得到菠萝蛋白酶。
对比例1与实施例四的区别在于：添加的是l-半胱氨酸，而不是茶多酚。
经步骤s2的吸附和离心处理后，在除去大颗粒物质和部分杂蛋白的同时，菠萝蛋白酶活损失较多，达到13.5％。步骤s3的超滤所用时间为82min，酶活截留率为85.2％。最终得到的菠萝蛋白酶的酶活为3.03×106u/g，对菠萝蛋白酶进行电泳检测，在20kd和50kd之间见菠萝蛋白酶以外的2条明显条带，具体在约28kd和45kd处。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。