本发明涉及醇脱氢酶突变体及其在双芳基手性醇合成中的应用，属于生物工程技术领域。
背景技术：
手性双芳基醇化合物是合成众多药物和精细化学品的关键手性中间体，其中手性(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇(cpma)是合成抗组胺药物倍他司汀的关键手性中间体。以潜手性(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲酮(cpmk)为原料，通过化学法不对称还原合成手性cpma主要由以下五种技术实现：
1.在底物浓度为1.0mm条件下，以trans-rucl2[(r)-xylbinap][(r)-daipen]为催化剂，在压力为40-60psi充氮气条件下室温反应24h，还原获得(s)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇((s)-cpma)，其ee值为60.6％，产率为98％。(c.y.chen,etal.,org.lett.,2003,5,5039-5042)。
2.以(s)-[ru(binap)cl2]2(ne3)为催化剂，加压，通氢气，还原得到(s)-cpma)，ee值为99％。(赵志全等,中国医药工业杂志,2006,37,726-727)。
3.以cpmk为原料，在底物浓度仅为0.2mm条件下以(s,s)-6-choona为催化剂，在50℃条件下反应24h，还原获得的(r)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇((r)-cpma)，其ee值为40.8％，产率为90％。(b.g.wang,org.lett.,2017,19,2094-2097)。
4.以cpmk为原料，采用三步反应，1)先用三氟甲磺酸酐等进行保护，2)再用催化剂钯配位体及me-cbs等还原羰基到s构型羟基，3)在三苯基磷钯作用下脱保护，得到(s)-cpma。(中国专利cn101848893a)。
5.以手性binal-h为手性还原剂，在底物浓度为400mmcmpk条件下定向合成单一构型cpma。进行乙酸乙酯-石油醚重结晶后，(r)-cpma收率88.2％，纯度96.2％，(s)-cpma收率87.4％，纯度95.7％。(中国专利cn103121966a)。
由此可见，上述反应存在贵金属配位体催化剂成本较高、底物浓度低、反应需要高压条件、操作步骤较多、物光学纯度低的问题，不能满足药物对光学纯度的要求，不利于工业化生产。
生物催化是指利用酶或者生物有机体(细胞、细胞器、组织等)作为催化剂进行化学转化的过程，作用条件温和，在常温、中性和水等环境中完成，对于手性活性药物成分的合成具有独特的优点。符合“可持续发展”、“绿色化学”、“环境友好制造”等工业发展的目标。与化学合成方法相比，使用醇脱氢酶将潜手性酮中的羰基进行不对称还原的反应具有立体选择性高、反应条件温和等优势，具有重要的经济、社会价值和生态意义。生物不对称还原法主要可通过以下四种技术实现：
1.2007年，truppo等筛选了一系列商品化酮还原酶kred后，发现虽然有一些酮还原酶对双芳基底物有还原能力，但立体选择性一般，且底物谱较窄，底物中的取代基团对立体选择性的影响较大。仅kred124可以不对称还原cpmk生成(r)-cpma，ee值为94％，转化率98％，且需要外加葡萄糖脱氢酶提供辅酶循环。(m.d.truppo,org.lett.,2007,9,335-338)。
2.2009年，朱敦明等发现来游于sporobolomycessalmonicolor的重组羰基还原酶sscr及其突变体可以立体选择性还原不同双芳基酮底物(8-99％ee)。在葡萄糖脱氢酶的协助下，还原cpmk生成(r)-cpma，转化率62％，对映选择性为88％(r)。(d.m.zhu,org.lett.,2008,10,525-528)。
3.2012年，周婕妤等通过传统富集培养筛选到一株克鲁维酵母kluyveromycessp.cctccm2011385，可催化还原cpmk生成(s)-cpma(87％ee)。然而活性酶在野生菌中的含量低，最高仅能催化2g/l底物，产物浓度较低，分离成本高，因而不能满足应用的需要。(y.ni,processbiochem.,2012,47,1042-1048；中国专利cn102559520a)。
4.2013年，李哲等研究了一个来源于毕赤酵母gs115的羰基还原酶pascr对一系列双芳香基甲酮类化合物的不对称还原，底物浓度为10mm，转化率最高只有50％。(李哲等,生物工程学报,2013,29,68-77)。
由此可知，采用生物不对称还原法制备手性cpma的立体选择性较难达到医药的要求大于95％的对映体过量值，尤其缺乏合成制备(s)-cpma的还原酶，因此亟需开发高效、高立体选择性的生物酶催化剂。
技术实现要素：
本发明针对现有技术中的醇脱氢酶立体选择性较低的问题，提供了一系列醇脱氢酶的突变体蛋白质、编码该突变体蛋白质的核酸序列，含有该核酸序列的重组表达载体和重组表达转化体，以及该醇脱氢酶突变体蛋白质或表达该醇脱氢酶突变体蛋白质的重组转化体作为催化剂在不对称还原、制备光学手性双芳基醇中应用。
本发明的第一个目的是提供一种更高的反应活性和立体选择性的醇脱氢酶突变体。
在本发明的一种实施方式中，所述醇脱氢酶突变体是将氨基酸序列为seqidno.2醇脱氢酶的第161位苯丙氨酸、第196位丝氨酸中的一个或两个氨基酸位点进行突变。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如seqidno.2所示醇脱氢酶的第196位丝氨酸替换为缬氨酸，命名为m1。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如seqidno.2所示醇脱氢酶的第196位丝氨酸替换为色氨酸，命名为m2；
在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如seqidno.2所示醇脱氢酶的第196位丝氨酸替换为脯氨酸，命名为m3。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如seqidno.2所示醇脱氢酶的第196位丝氨酸替换为甘氨酸，命名为m4。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如seqidno.2所示醇脱氢酶的第196位丝氨酸替换为甘氨酸，第161位苯丙氨酸替换为缬氨酸，命名为m5。
在本发明的一种实施方式中，表达所述突变体的重组菌。
在本发明的一种实施方式中，所述重组菌的构建方法：将编码所述突变体的核酸分子克隆到重组载体中，将所得重组载体转化到转化体中，得到重组表达转化体，通过培养所得重组表达转化体，即可分离纯化获得所述蛋白质。
在本发明的一种实施方式中，所述重组菌的宿主为大肠杆菌(escherichiacoli)，所述质粒为pet28a(+)。
在本发明的一种实施方式中，所述重组菌的宿主为e.colibl21(de3)。
本发明的另一个目的是，提供一种所述重组菌生产醇脱氢酶的方法，具体步骤如下：将重组菌接种至含有40-60μg/ml硫酸卡那霉素的lb培养基中，30～40℃，100～200rpm摇床培养，培养液的吸光度od600达到0.5～1.0时，加入0.05～1.0mm的异丙基-β-d-六代呋喃半乳糖苷(iptg)进行诱导，诱导温度为16～30℃，诱导5～10h即可获得高效表达重组醇脱氢酶的突变体。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体作为催化剂在不对称还原潜手性羰基化合物制备光学纯手性双芳基醇中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述潜手性羰基化合物为4-氯苯基-吡啶-2-基-甲酮((4-chlorophenyl)-(pyridin-2-yl)-methanone,cpmk)，苯基-吡啶-2-基-甲酮(phenyl-(pyridin-2-yl)-methanone)，4-氯苯基-苯基甲酮((4-chlorophenyl)-(phenyl)-methanone)，4-氟苯基-苯基-甲酮(4-fluorophenyl)-(phenyl)-methanone，4-溴苯基-苯基-甲酮(4-brormophenyl)-(phenyl)-methanone，4-甲氧苯基-苯基甲酮(4-methoxyphenyl)-(phenyl)-methanone。
一种应用醇脱氢酶生产手性cpma的方法，所述方法的具体步骤如下：构建反应体系，cpmk浓度为10-500mm，权利要求1-3任一所述脱氢酶突变体用量为1-10ku/l，nadp+用量为0.1～1.0mm，加入辅酶循环系统，辅酶循环系统中含有葡萄糖脱氢酶gdh和d-葡萄糖，其中葡萄糖脱氢酶gdh用量为1～10ku/l，d-葡萄糖用量为20～1000mm，磷酸盐缓冲液的浓度为0.1-0.2m；在30～35℃，ph6～8的条件下反应1～24h，不对称还原反应结束后，可按照有机溶剂萃取方法从反应液中提取手性cpma。
在本发明的一种实施方式中，所述辅酶循环系统还可以是亚磷酸盐/亚磷酸盐脱氢酶(ftdh)、甲酸/甲酸脱氢酶(fdh)、乳酸/乳酸脱氢酶(ldh)或甘油/甘油脱氢酶。
在本发明的一种实施方式中，所述(r)-和(s)-cpma的色谱分析方法为：取100μl反应液，加入500μl乙酸乙酯，震荡1～2min,12000rpm离心2-5min，取上清到离心管中，待有机相自然会发完全，加入500μl色谱纯乙醇，进行手性液相色谱分析转化率和ee值。色谱条件具体如下：daicelchiralcelob-h(5μm,250mm×4.6mm)液相色谱柱，流动相为正已烷:乙醇:乙醇胺(90:10:0.01,v/v/v)，流速lml/min，柱温30℃，紫外检测波长254nm，进样量10μl，(s)-和(r)-cpma保留时间分别为11.14min和12.34min；所述(r)-和(s)-4-氟苯基-苯基甲醇的色谱分析方法为：daicelchiralcelod-h(5μm,250mm×4.6mm)液相色谱柱，流动相为正已烷:乙醇:乙醇胺(90:10:0.01,v/v/v)，流速lml/min，柱温30℃，紫外检测波长254nm，进样量10μl，(s)-和(r)-cpma保留时间分别为6.29min和7.10min；所述(r)-和(s)-4-甲氧苯基-苯基甲醇的色谱分析方法为：daicelchiralcelod-h(5μm,250mm×4.6mm)液相色谱柱，流动相为正已烷:乙醇:乙醇胺(90:10:0.01,v/v/v)，流速lml/min，柱温30℃，紫外检测波长254nm，进样量10μl，(s)-和(r)-cpma保留时间分别为6.96min和8.45min；
本发明的有益效果为：
(1)本发明得到的醇脱氢酶突变对多种羰基化合物具有较高的活力，可以催化还原多种脂肪族或芳基取代的酮底物，尤其是空间位阻较大的双芳基酮底物。通过组合突变手段对kpadh进行分子改造，提高该酶的立体选择性，这将使其具有更高的工业应用价值。
(2)与野生型醇脱氢酶kpadh相比，本发明所述醇脱氢酶突变体m1，m2，m3对底物cpmk具有提高的r-立体选择性，其产物cpma的ee值由野生型的82％(r)提高至98.7％(m1)，97.7％(m2)和95.2％(m3)；m4对底物cpmk具有翻转趋势的r-立体选择性，其产物cpma的ee值由野生型的82％(r)下降至27.2％；此外，m4还原底物4-氟苯基-苯基甲酮具有优异的立体选性，产物构型与野生型相同，ee值为99.5％；m5对底物cpmk具有翻转的s-立体选择，突变体还原产物cpma的ee值为75.4％(s)；此外，m5还原底物4-甲氧苯基-苯基甲酮具有优秀的立体选择性，产物的构型与野生型相同，ee值为99.7％。本发明所获得的醇脱氢酶突变体特别适用于双芳基酮的不对称还原，具有良好的工业应用前景。
附图说明
图1野生型和醇脱氢酶突变体m1～m5的全质粒pcr核酸电泳图；
图2醇脱氢酶突变体m1～m5梯度洗脱蛋白电泳图；
图3醇脱氢酶突变体m1催化还原cpmk产物手性色谱图：
图4醇脱氢酶突变体m4催化还原4-氟苯基-苯基甲酮产物手性色谱图；
图5醇脱氢酶突变体m5催化还原4-甲氧基-苯基甲酮产物手性色谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行详细说明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下述实施例中未注明具体实验条件的实验方法，可按照常规方法和条件，或按照说明书进行选择。
实施例1：醇脱氢酶的活力和产物光学纯度的测定方法：
总反应体系为200μl，包括：1.0mmnadph,1.0mm底物cpmk，磷酸钠缓冲液(pbs,l00mm,ph7.0),充分混匀，30℃保温2min，加入适量的酶液，检测340nm下光吸收值的变化。
用下式计算得到酶活力：
酶活力(u)＝ew×v×103/(6220×l)
式中，ew为1分钟内340nm处吸光度的变化；v为反应液的体积，单位为ml；6220为nadph的摩尔消光系数，单位为l/(mol·cm)；1为光程距离，单位为cm。1个活力单位(u)对应于上述条件下每分钟催化氧化lμmolnadph所需的酶量。
光学纯度ee的测定方法：
as：液相色谱获得的(s)-cpma的摩尔浓度；ar：液相色谱获得的(r)-cpma的摩尔浓度；
实施例2：醇脱氢酶突变体基因和重组表达转化体的构建
采用全质粒pcr方法对位于161位、196位氨基酸残基进行定点突变，构建迭代组合突变体。其引物设计如下(均按5’-3’方向描述，下划线代表突变位点：
m1(以pet28a-kpadh重组质粒为模板)
s196v-f:actatccacccagttttcgtt
s196v-r:tccgaaaacgaaaactgggtg
m2(以pet28a-kpadh重组质粒为模板)
s196w-f:actatccacccatggttcgtt
s196w-r:tccgaaaacgaaccatgggtg
m3(以pet28a-kpadh重组质粒为模板)
s196p-f:actatccacccacctttcgtt
s196p-r:tccgaaaacgaaaggtgggtg
m4(以pet28a-kpadh重组质粒为模板)
s196g-f:actatccacccaggtttcgtt
s196g-r:tccgaaaacgaaacctgggtg
m5(以m4重组质粒为模板)
f161v-f:tatgaaaatgtcgttactgct
f161v-r:acaataagcagtaacgacatt
pcr反应体系为：pcr反应体系(50μl)包括kod酶(2.5u/ml)l.0μl，模板(5-50ng)l.0μl，dntp4.0μl，10×reactionbuffer5.0μl，上下游引物各1.0μl，ddh2o补足至50μl。
pcr扩增程序为：(1)94℃变性3min，(2)94℃变性30sec，(3)54℃退火30sec，(4)72℃延伸150sec，重复步骤(2)～(4)进行10-15个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存pcr扩增产物。
pcr结束后，添加dpni限制性内切酶于反应混合物中并置于37℃孵育1h，用cacl2热转化法将10μl消化后pcr反应液转入50μle.colibl21(de3)感受态细胞，并均匀涂布于含有50μg/ml硫酸卡那霉素的lb琼脂平板，37℃倒置培养12h。
实施例3：醇脱氢酶及其突变体的表达及纯化
将携带立体选择性改善突变体的重组大肠杆菌按2％的转接量接种至含有硫酸卡那霉素(50μg/ml)的lb培养基中，37℃，200rpm摇床培养，培养液的吸光度od600达到0.8时，加入0.2mm的异丙基-β-d-六代呋喃半乳糖苷(iptg)进行诱导，诱导温度为25℃，诱导8h后，8000rpm离心10min获得高效表达重组醇脱氢酶突变体的菌体，将收集的菌体悬浮于磷酸钾缓冲液(100mm，ph6.0)中，超声破碎。
纯化所使用的柱子为镍亲和柱histrapffcrude，利用重组蛋白上的组氨酸标签进行亲和层析来完成。首先使用a液将镍柱平衡，粗酶液上样，继续使用a液将穿透峰洗脱下来，待平衡后用b液(20mm磷酸钠，500mmnacl,l000mm咪唑，ph7.4)进行梯度洗脱，将结合到镍柱上的重组蛋白洗脱下来，获得重组醇脱氢酶突变体。对纯化后的蛋白进行活力测定(cpmk为底物，nadph为辅酶)及sds-page分析。镍柱纯化后，在45kda左右显示单条带，且杂蛋白较少，说明柱纯化效果较好。之后使用hi-trapdesalting脱盐柱(gehealthcare)将纯化后的醇脱氢酶蛋白置换到tris-hcl(l00mm，ph7.0)缓冲液中。
实施例4：醇脱氢酶突变体的动力学和立体选择性分析
测定kpadh在不同底物浓度和辅酶浓度情况下的活力，并根据活力和底物浓度的倒数做出双倒数曲线，计算动力学参数。
由表2可知kpadh对cpmk的kcat/km为28.9s–1·mm–1，其还原产物构型为r构型，ee值为82.5％。突变体m1，m2和m3合成(r)-cpma立体选择性提高，达到95％以上，产物ee值分别为98.7％，97.7％和95.2％。突变体m4表现为降低的立体选择性，还原产物构型同为r构型，产物的ee值分别为22.4％。突变体m5表现为反转的立体选择性，还原产物为s构型，产物的ee值分别为75.4％。
表2醇脱氢酶突变体的动力学参数及立体选择性
实施例5：醇脱氢酶突变体的底物特异性分析
考察了实例2得到的醇脱氢酶突变体还原潜手性羰基化合物的情况，所考察的潜手性羰基化合物包括4-氯苯基-吡啶-2-基-甲酮((4-chlorophenyl)-(pyridin-2-yl)-methanone,cpmk)，苯基-吡啶-2-基-甲酮(phenyl-(pyridin-2-yl)-methanone)，4-氯苯基-苯基甲酮
((4-chlorophenyl)-(phenyl)-methanone)，4-氟苯基-苯基-甲酮
(4-fluorophenyl)-(phenyl)-methanone，4-溴苯基-苯基-甲酮
(4-brormophenyl)-(phenyl)-methanone，4-甲氧苯基-苯基甲酮
(4-methoxyphenyl)-(phenyl)-methanone。由表3可以看出，对于底物cpmk，m1，m2和m3的还原产物均为r-构型，且产物的ee值均高于95％；对于底物苯基-吡啶-2-基-甲酮仅有m3的还原产物的ee值达到95％以上，m5的还原产物的构型与母本相反，为75.5％。对于底物4-溴苯基-吡啶-2-基-甲酮，m1催化产物的ee值达到99％以上，同时m2催化产物的ee值也较高，为95.5％；对于4-氟苯基-吡啶-2-基-甲酮和4-甲氧苯基-苯基甲酮，m5的催化产物的ee值均在95％以上，且与母本的构型相同。
表3醇脱氢酶突变体的底物特异性
实施例6：醇脱氢酶突变体不对称还原cpmk制备高光学纯度的(r)-cpma
建立了20ml的生物催化体系：100mm磷酸钾缓冲液(ph7.0)，加入实例2获得的醇脱氢酶突变体m1和野生kpadh10g/l，cpmk100mm，200mm和500mm(底物分批添加)。在30℃和200rpm条件下反应12h，恒定ph7.5。反应过程中的转化率分析结果见表4和表5，可知野生型脱氢酶和突变体m1均能不对称还原100mm和200mmcpmk。当cpmk浓度为200mm时，野生型kpadh和突变体m1分别需要12h和24h以达到接近99.9％的转化率。野生型kpadh最终还原产物为(r)-cpma，ee值为82％；突变体m1最终还原产物为同为(r)-cpma，ee值为99.7％；将所得(r)-cpma粗品重新溶解于乙醇中，加入相应的产物(r)-cpma纯品为晶种于4℃重结晶，最终获得光学纯度均>99.9％ee的产品。
表4野生型醇脱氢酶kpadh催化cpmk的不对称还原
表5醇脱氢酶突变体m1催化cpmk不对称还原
实施例7：醇脱氢酶突变体不对称还原cpmk制备高光学纯度的(r)-4-氟苯基-苯基甲醇
建立了20ml的生物催化体系：100mm磷酸钾缓冲液(ph7.0)，加入实例2获得的醇脱氢酶突变体m4细胞10g/l，4-氟苯基-苯基甲酮50mm。在30℃和200rpm条件下反应24h，恒定ph7.5。反应过程中的转化率分析结果见表6。当底物浓度为50mm，醇脱氢酶突变体m4均能够在24内达到99％以上的底物转化率，它们的还原产物均为(r)-4-氟苯基-苯基甲醇，其中野生型kpadh还原产物的ee值仅为25.3％，突变体m4还原产物的ee值可达到99.5％。将所得(r)-4-氟苯基-苯基甲醇粗品重新溶解于乙醇中，加入相应的产物纯品为晶种于4℃重结晶，最终获得光学纯度均>99.9％ee的产品。
表6.醇脱氢酶突变体m4催化50mm4-氟苯基-苯基甲酮不对称还原
实施例8：醇脱氢酶突变体不对称还原cpmk制备高光学纯度的(r)-4-甲氧苯基-苯基甲酮
建立了20ml的生物催化体系：100mm磷酸钾缓冲液(ph7.0)，加入实例2获得的醇脱氢酶突变体m4细胞10g/l，4-甲氧苯基-苯基甲酮50mm。在30℃和200rpm条件下反应24h，恒定ph7.5。反应过程中的转化率分析结果见表7。当底物浓度为50mm，醇脱氢酶突变体m4均能够在24内达到99％以上的底物转化率，它们的还原产物均为(r)-4-甲氧苯基-苯基甲醇，其中野生型kpadh还原产物的ee值仅为15.1％，突变体m4还原产物的ee值可达到99.7％。将所得(r)-4-甲氧苯基-苯基甲醇粗品重新溶解于乙醇中，加入相应的产物纯品为晶种于4℃重结晶，最终获得光学纯度均>99.9％ee的产品。
表7.醇脱氢酶突变体m5催化cpmk不对称还原
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110>醇脱氢酶突变体及其在双芳基手性醇合成中的应用
<120>江南大学
<130>1
<160>12
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>1029
<212>dna
<213>人工合成
<400>1
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ttggaacaaaattacaaagtaattggtactgttagaagtcaagacaaagctgataagtta120
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<211>342
<212>prt
<213>人工合成
<400>2
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