本发明涉及一种异亮氨酸双加氧酶突变体及其应用，属于分子生物学的技术领域。
背景技术：
定向进化属于非理性设计，是指在不了解酶分子相关的空间结构、催化机制的情况下，通过人为的创造特殊的进化条件，模拟自然进化的机制(随机突变、重组以及自然选择)，通过体外建立突变库，利用高通量定向筛选方法获得所需要的有价值的突变酶。近十年来，定向进化技术已经在酶的相关性质改造领域取得了很多成功的案例，主要集中在提高催化活性，改进底物特异性，提高热稳定性等方面。定点突变(site-directedmutagenesis)属于理性设计，是指对目的基因的指定位点进行碱基替换、饱和突变、缺失、或者插入，从而改变其编码的氨基酸序列的技术。它是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的强有力的工具，也是实验室常用的基因改造的手段。而将两种技术结合后有可能起到更好的效果。在通过定向进化技术筛选得到具有效果的重要氨基酸位点后，然后结合对其它重要位点进行定点突变，将有助于进一步改进酶分子的结构和功能，并了解这些位点在蛋白质结构和功能的关系中所发挥的作用，所以理性设计和非理性设计的合理结合是蛋白质改造的一种重要技术手段。
异亮氨酸双加氧酶(isoleucinedioxygenase，简称ido)以l-异亮氨酸(l-isoleucine，简称ile)、α-酮戊二酸(α-ketoglutarate，简称α-kg)和氧气为底物，催化ile发生羟基化，生成4-羟基异亮氨酸(4-hydroxyisoleucine，简称4-hil)，同时将α-kg转变成琥珀酸。ido仅存在于芽孢杆菌等少数物种中，但是它们的序列不尽相同。并且成熟的ido酶的n端会去掉几个氨基酸残基，相对于未去除几个氨基酸残基的新生ido酶，其稳定性和催化活性都有所提高。生物学中一般将ido用于ile的生物转化以合成4-hil。4-hil是一种天然的非蛋白氨基酸，具有促进胰岛素分泌，降低肝脏、肌肉、脂肪等外周组织对胰岛素的抵抗，调节血脂异常等生理功能，在治理糖尿病及其并发症方面有潜在的应用价值。目前4-hil的主要生产方法是生物转化法，ido是4-hil生物转化的关键酶，但是经研究发现ido的热稳定性和ph稳定性不高，并且酶的催化效率低，这会使利用该酶生物合成4-hil受到限制，导致4-hil的产量偏低。为了近一步提高4-hil的产量，因此需要对ido酶进行改造，提高酶的活性和催化效率，为利用该酶及其编码基因来生物合成4-hil创造好的条件。
技术实现要素：
本发明的第一个目的是提供一种异亮氨酸双加氧酶突变体，含有seqidno.1或seqidno.3所示的氨基酸序列。
本发明的第二个目的是提供编码所述异亮氨酸双加氧酶突变体的基因。
在本发明的一种实施方式中，所述基因含有seqidno.2所示的核苷酸序列。
在本发明的一种实施方式中，所述基因含有seqidno.4所示的核苷酸序列。
本发明的第三个目的是提供携带所述异亮氨酸双加氧酶突变体的基因的载体。
本发明的第四个目的是提供表达所述异亮氨酸双加氧酶突变体的细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述细胞包括真菌细胞或细菌细胞。
本发明的第五个目的是提供一种基因工程菌，表达所述异亮氨酸双加氧酶突变体。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以大肠杆菌为宿主，以pet系列质粒为表达载体。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌是将seqidno.2和seqidno.4所示的核苷酸序列以pet28a或能表达该酶的质粒为表达载体，在大肠杆菌(escherichiacoli)bl21(de3)或能表达该酶的菌株中表达。
在本发明的一种实施方式中，异亮氨酸双加氧酶基因ido来自韦氏芽孢杆菌(bacillusweihenstephanensis)，核苷酸序列见seqidno.5。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌按如下方法构建：第一，以来自b.weihenstephanensis的异亮氨酸双加氧酶基因idoδ6为模板，通过易错pcr获得随机突变文库，采用纸层析筛选和粗酶液酶活测定两步筛选法获得所需要的突变酶，扩大培养，表达、纯化后得到了突变酶idoδ6n126h，并测定其酶学性质；第二，以第一步筛选得到的突变体基因为模板，进行t130k定点突变，构建突变体，以质粒pet28a或能表达该酶的质粒为表达载体，将重组质粒转入大肠杆菌bl21(de3)或能表达该酶的宿主细胞，挑选验证后的阳性单菌落进行扩大培养，表达、纯化后得到突变酶idoδ6n126h/t130k。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌的表达单元的启动子为常用的t7启动子，在t7启动子的作用下，突变体酶可以直接在宿主细胞e.colibl21(de3)中，完成胞内的可溶性表达。
本发明的第六个目的是提供一种提高异亮氨酸双加氧酶催化效率的方法，是将ido基因(genbank登录号aby46544.1)编码的氨基酸序列基础上，去掉n端2～7位的六个氨基酸残基，将第126位的天冬酰胺替换为组氨酸。
在本发明的一种实施方式中，所述方法还将第130位的苏氨酸替换为赖氨酸。
本发明的第七个目的是提供一种生产4-羟基异亮氨酸的方法，所述方法以l-异亮氨酸、α-酮戊二酸为底物，应用所述基因工程菌为催化剂进行催化反应。
本发明还提供所述异亮氨酸双加氧酶突变体在制备含4-羟基异亮氨酸或琥珀酸的产品方面的应用。
有益效果：本发明通过比较野生酶idoδ6和突变酶idoδ6n126h、idoδ6n126h/t130k的酶学性质，发现，突变体酶idoδ6n126h与底物的亲和性为野生型的4.6倍，催化效率是野生型的2.8倍；突变体酶idoδ6n126h/t130k与底物的亲和性为野生型的1.6倍，催化效率是野生型的2.4倍，并且突变体酶idoδ6n126h/t130k的活性相比于对照提高了10％。利用突变体酶idoδ6n126h/t130k合成4-hil产量提高了2.5倍。
附图说明
图1为重组质粒pet28a(+)-idoδ6的构建图谱。
图2为随机突变筛选到的5株菌株粗酶液比活力图。
图3为突变菌株和对照菌株24h内全细胞转化生成4-hil的折线图。
具体实施方式
所用限制性内切酶，t4dna连接酶，pcr试剂等均购于takara宝生物公司；大肠杆菌jm109、bl21(de3)菌株购自天根生物公司；引物，质粒提取试剂盒，pcr产物纯化试剂盒均购于上海生工生物工程公司；ni-ntaagarose购自qiagen公司；其他试剂均为国内或国外购买的分析纯试剂。
异亮氨酸双加氧酶的酶活测定：反应体系为1ml：先加入200μl缓冲液(500mmna2hpo4，250mm柠檬酸以一定比例混合；ph5.96)、再加入30mmile、30mmα-kg、5mm抗坏血酸、1mmfeso4、之后加入30μl的纯化完的蛋白液，最后加水补齐。30℃下在恒温水浴摇床上震荡反应1h，反应结束后用沸水浴5min终止反应，取750μl反应液加入250μl三氯乙酸(20％)，置于4℃下沉淀蛋白4h以上，再离心20min，用水相滤膜过滤之后用于hplc分析，测定4-hil的含量。一个酶的活性单位(u)定义：在测定条件下，每分钟生成1mol4-hil所需的酶量。
实施例1：重组质粒的构建
ido基因合成于华大基因，连接的载体为puc57-ido。
设计如下引物用于idoδ6的扩增：
idoδ6-f：5’catcccatggcgaagacaagcagttttgacgtag3’
idoδ6-r：5’ccgctcgagttttggctccttataagaaa3’
其中上游引物酶切位点为ncoi(ido-f中下划线部分)，下游引物酶切位点为xhoi(ido-r中下划线部分)。
pcr扩增条件：94℃变性5min，34个循环(95℃30s，55℃30s,72℃50s)最后72℃延伸10min。
扩增产物纯化后，用ncoi和xhoi对pcr产物和载体pet28a进行双酶切，两者的回收产物，用t4连接酶22℃连接过夜，化学转化到jm109细胞中，待平板上长出转化子之后，挑取转化子液体培养，提取质粒，通过酶切和pcr验证获得重组质粒pet28a-idoδ6(图1)，然后将重组质粒转到bl21(de3)细胞，得到bl21(de3)/pet28a-idoδ6工程菌。
实施例2：利用随机突变来构建异亮氨酸双加氧酶的突变文库
利用易错pcr技术在体外向异亮氨酸双加氧酶基因idoδ6引入核苷酸突变。
易错pcr的反应条件(50μl体系)
pet28a-idoδ61μl，10×rtaqpcr缓冲液5μl，dntpmixture4μl，dttp、dctp各0.3μl，2％明胶0.25μl，25mmmgcl215.6μl，5mmmncl21μl，rtaqdna聚合酶1μl，ddh2o补齐。
引物为idoδ6-f和idoδ6-r。
pcr扩增条件：94℃变性5min，34个循环(95℃30s，55℃30s，72℃50s)最后72℃延伸10min。
易错pcr扩增产物纯化后，用ncoi和xhoi分别对易错pcr产物和载体pet28a进行双酶切，两者的回收产物，用t4连接酶22℃连接过夜，化学转化到bl21(de3)，涂布lb平板，37℃培养15h，构建突变文库。
实施例3：突变体的筛选
纸层析初筛：将突变体于24孔板预培养、诱导和表达，通过外源添加ile的方式进行全细胞转化反应生成4-hil，以bl21(de3)/pet28a-idoδ6作为对照，筛选纸层析中4-hil斑点明显比对照大的突变体,经过一轮纸层析初筛，从2000株突变体中筛选出5个突变体。
粗酶液酶活测定复筛：将纸层析初筛得到的五株突变体进行液体培养，测定粗酶液的酶活，粗酶液比活力见图2，其中突变体ep-1粗酶液的活性为12.22u/g显著高于野生型菌株的4.34u/g，将其命名为bl21(de3)/pet28a-idoδ6n126h，进一步扩大培养，表达、纯化，测定纯酶的酶学性质。
实施例4：定点突变
定点突变原理：点突变质粒的构建采用dpni法。根据待突变的氨基酸位点来设计pcr点突变引物，以bl21(de3)/pet28a-idoδ6n126h质粒为模板，以设计的相关的正向引物以及互补引物(反向引物)，通过pcr扩增出产物。
正向引物：aaatatacttgataaaagtaaggatttggt
反向引物：accaaatccttacttttatcaagtatattt
pcr扩增体系为：质粒dna0.5μl，5×primerstarbuffer5μl，引物各0.5μl，dntp2μl，primerstar0.25μl，ddh2o补至25μl，pcr扩增条件95℃变性1min，循环18次(95℃40s，50℃15s，68℃6min30s)，72℃10min。
pcr产物用dpni酶在37℃处理1h，去除模板dna，消化产物转化大肠杆菌jm109感受态细胞，得到相关突变株的转化子，提取质粒，经过测序验证，得到正确突变株，将构建成功的重组质粒转入大肠杆菌bl21(de3)，得到待表达的突变株bl21(de3)/pet28a-idoδ6、bl21(de3)/pet28a-idoδ6n126h和bl21(de3)/pet28a-idoδ6n126h/t130k。
实施例5：野生酶和突变酶的表达纯化
表达：bl21(de3)/pet28a-idoδ6、bl21(de3)/pet28a-idoδ6n126h、bl21(de3)/pet28a-idoδ6n126h/t130k接种于含有30mg/l卡那霉素的lb液体培养基中，37℃、200rpm培养至od600至3.0～5.0，将其转接种到含有30mg/l卡那霉素的装液量为100mllb液体培养基的250ml三角瓶中，控制初始od600为0.02，在37℃、200rpm下培养至od600在0.5～0.9范围内，加入1mmiptg进行诱导，然后28℃、200rpm诱导表达培养8h。
提取：菌液在4℃、4000rpm下，离心20min，弃上清液；然后加入20ml平衡缓冲液a重悬菌体，在4℃、4000rpm下，离心20min并倒掉上清液，重复2次。再用10ml平衡缓冲液a重悬，之后超声破碎细胞25min(破碎条件：功率：55％，超2s，停3s)，在冰上放置1h后，用水系0.45μm膜过滤，4℃、8000rpm下离心30min，在4℃、8000rpm离心30min，收集上清即为粗酶液，最后用孔径为0.22μm水系膜过滤，即得ni柱上样样品。
纯化：采用ni-nta亲和层析柱对上一步所得的样品进行分离纯化。经过上样、漂洗和洗脱，收集含有目的蛋白的洗脱液，然后通过透析小分子即可得到纯酶。测定纯酶的浓度。纯化所涉及缓冲液配置：
平衡缓冲液：0.05mm抗坏血酸，20mmtris-hcl，30mmnacl，10％甘油，ph7.8。
漂洗缓冲液：0.05mm抗坏血酸，20mmtris-hcl，500mmnacl，10mm咪唑，10％甘油，ph7.8。
洗脱缓冲液：0.05mm抗坏血酸，20mmtris-hcl，500mmnacl，500mm咪唑，10％甘油，ph7.8。
透析缓冲液：0.05mm抗坏血酸，0.5mmna2hpo4-0.25mm柠檬酸，10％甘油，ph6.0。
实施例6：野生酶和突变酶动力学参数的测定
为了测定酶的动力学参数，将纯化的野生酶和突变体酶在ph6.0、30℃下催化ile的羟基化反应1h，反应体系为：500mmna2hpo4，250mm柠檬酸以一定比例混合(ph5.96)、再加入0.1-30mmile、0.1-30mmα-kg、5mm抗坏血酸、1mmfeso4、之后加入30μl的纯化完的蛋白液。其中将α-kg的浓度固定为30mm，测定在0.1-30mmile的反应速度，再将ile的浓度固定为30mm，测定在0.1-30mmα-kg的反应速度，从而得出酶促反应初速率与底物浓度之间的关系，利用lineweaver-burke做图法计算ido的酶促反应动力学参数。
结果表明以ile为底物时，野生型idoδ6、突变体酶idoδ6n126h和突变体酶idoδ6n126h/t130k的km值分别为2.38mm、0.52mm、1.51mm，其中突变体酶idoδ6n126h和idoδ6n126h/t130k与ile的亲和性分别为野生型的4.6倍和1.6倍；kcat/km值分别为12.15min-1mm-1、33.58min-1mm-1、29.31min-1mm-1，其中突变体酶idoδ6n126h和idoδ6n126h/t130k的催化效率分别是野生型的2.8倍和2.4倍。以α-kg为底物时，野生型idoδ6、突变体酶idoδ6n126h和突变体酶idoδ6n126h/t130k的km值分别为2.76mm、0.50mm、0.85mm，其中突变体酶idoδ6n126h和idoδ6n126h/t130k与α-kg的亲和性分别为野生型的5.5倍和3.2倍；kcat/km值分别为12.53min-1mm-1、38.2min-1mm-1、37.3min-1mm-1，其中突变体酶idoδ6n126h和idoδ6n126h/t130k的催化效率均为野生型的3倍。与其他来源的ido对比，本突变体酶的kcat达到了44.15min-1，高于已有报道的来自于其他芽孢杆菌ido。
实施例7：野生酶idoδ6和突变酶idoδ6n126h/t130k全细胞转化合成4-hil
将扩大培养诱导表达完的野生型菌株e.colibl21/pet28a-idoδ6以及突变菌株e.colibl21/pet28a-idoδ6n126h/t130k离心去除上清，用ph6.0的pbs缓冲液洗细胞两次，最后离心去上清液，称取20g湿菌体，加入全细胞反应液(200mmna2hpo4-柠檬酸缓冲液、100mmile、100mmα-kg、5mm抗坏血酸、1mmfeso4、0.6mg/l甘氨酸，ph6.0)，最终全细胞反应液的总体积为100ml，先在53℃下孵育1h，之后30℃、200rpm下反应24h，分别在6h、12h、18h、24h取样，通过hplc测定产生的4-hil含量。见图3，在24h时，突变菌株e.colibl21/pet28a-idoδ6n126h/t130k经过全细胞转化4-hil的产量达到了66.5±0.99mm，ile的摩尔转化率达到了66.5％，而野生型菌株e.colibl21/pet28a-idoδ6的4-hil产量仅为26.1±1.8mm，转化率为26.1％。相同条件下，突变菌株全细胞转化4-hil的产量是野生型的2.5倍。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
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