本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种普鲁兰酶的制备方法。
背景技术：
普鲁兰酶(pullulanase)是一类淀粉脱支酶，因其能专一性水解普鲁兰糖(pullulan，麦芽三糖以α-1,6糖苷键连接起来的聚合物)而得名，属淀粉酶类，能够专一性切开支链淀粉分支点中的α-1,6糖苷键，切下整个分支结构，形成直链淀粉。
根据普鲁兰酶对底物特异性及水解产物的种类，可以将普鲁兰酶分为4种类型：ⅰ型普鲁兰酶(ec3.2.1.41)、ii型普鲁兰酶(ec3.2.1.41)、新普鲁兰酶(ec3.2.1.135)和异普鲁兰酶(ec3.2.1.57)。
20世纪60年代bender在出芽短梗霉(aureobasidiumpullulans)的发酵液中发现普鲁兰酶。目前筛选获得的产酶微生物主要包括产气气杆菌、蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等，以及高温厌氧菌、嗜热古细菌、海栖热袍菌、深海古菌等极端微生物。
目前从普鲁兰酶发酵液中提取普鲁兰酶的主要问题是发酵液不易过滤，板框处理量少；过滤后滤液酶活较低，导致收率较低；过滤后细菌数比较高，易变质；过滤后滤液不够澄清；处理需要的药品价格相比较高。
技术实现要素：
为克服现有技术不足，本发明提供一种普鲁兰酶的制备方法。
本发明技术方案如下：
本发明首先提供一种絮凝剂组合物，用于将普鲁兰酶发酵液进行絮凝处理，以利于后续普鲁兰酶的制备。
本发明所述絮凝剂组合物包括：生石灰或氢氧化钙，氯化钙，磷酸氢二钠，以及聚丙烯酰胺。
本发明所述絮凝剂组合物中各组分一般可单独存放或独立包装。
使用前可将各组分分别配制成适当的溶液或乳液，然后依次(分别)用石灰溶液(或称石灰乳，主要成分为氢氧化钙)或氢氧化钙溶液、氯化钙乳液、磷酸氢二钠溶液、以及聚丙烯酰胺溶液对普鲁兰酶发酵液进行絮凝处理；然后进行过滤、浓缩等处理即可制备普鲁兰酶。
采用本发明所述絮凝剂组合物对普鲁兰酶发酵液进行絮凝处理的优点是：絮凝后滤液澄清，更利于过滤；且过滤后处理量较大，滤速较快；过滤一遍后滤液中菌落总数可达50000cfu/ml以下(如未到50000cfu/ml以下可则再过滤一遍)；另外过滤后滤液酶活较高。
本发明所述絮凝剂组合物向对于传统絮凝剂价格较低，有利于大幅较低生产成本。
本发明还提供一种含有上述絮凝剂组合物的试剂盒。所述试剂盒中各组分一般可独立包装或独立成为使用单元。可根据实际需要对所述试剂盒中各组分含量进行调整，以满足使用需求。
本发明还包括上述絮凝剂组合物在对普鲁兰酶发酵液进行絮凝处理方面的应用。
本发明所述生石灰主要成分为氧化钙。
本发明还提供一种普鲁兰酶的制备方法，包括将普鲁兰酶发酵液进行絮凝处理，还包括将絮凝处理后的发酵液进行过滤、浓缩以及贮存等操作处理。
具体地，所述将普鲁兰酶发酵液进行絮凝处理的方法包括如下步骤：
1)将普鲁兰酶发酵液用石灰水溶液(或称石灰乳)或氢氧化钙溶液调节ph值至6.9-7.1；
进一步地，使用浓度1.5％-2.5％的石灰水溶液或浓度1.5％-2.5％的氢氧化钙溶液调节ph值。为避免局部ph过高，要缓慢地加入石灰水溶液，加入过程中进行搅拌，充分混匀；一般地，每吨普鲁兰酶发酵液可在30分钟左右加完石灰水溶液。
2)向步骤1)所得普鲁兰酶发酵液中加入氯化钙溶液，使普鲁兰酶发酵液中氯化钙的重量含量为2.5％-6％；
进一步地，所述氯化钙溶液的浓度为6％-15％。
由于加入氯化钙溶液后，普鲁兰酶发酵液的ph会下降，故还需要在加完氯化钙溶液后再用石灰水溶液(或称石灰乳)或氢氧化钙溶液调节普鲁兰酶发酵液的ph值至6.9-7.1；
进一步地，为避免因局部氯化钙浓度过高(可能会降低酶活)，要中速加入氯化钙溶液(例如将氯化钙溶液按150-500kg/小时的速度加入普鲁兰酶发酵液中)，加入过程中进行搅拌，充分混匀；一般地，每吨普鲁兰酶发酵液可在60分钟左右加完氯化钙溶液。
尤其要注意的是，氯化钙溶液与石灰乳不能同时添加。
优选地，氯化钙溶液与石灰乳采用分布盘添加，优点是更好地溶于发酵液，不会导致发酵液局部过酸或过碱，从而使酶失活。
3)向步骤2)所得普鲁兰酶发酵液中加入磷酸氢二钠溶液，使普鲁兰酶发酵液中磷酸氢二钠的重量含量为2.4％-2.5％；
进一步地，所述磷酸氢二钠溶液的浓度为10％-16％。
进一步地，可分多次例如至少三次添加磷酸氢二钠溶液。同样地，由于每次加入磷酸氢二钠溶液后，普鲁兰酶发酵液的ph会下降，故还需要在加完磷酸氢二钠溶液后再用石灰水溶液(或称石灰乳)或氢氧化钙溶液调节普鲁兰酶发酵液的ph值至6.9-7.1；最后再用石灰水溶液(或称石灰乳)或氢氧化钙溶液调节ph值至7-7.2(即步骤4)。
进一步地，为避免因局部浓度过高造成磷酸氢二钠与与石灰乳反应，要缓慢或中速加入磷酸氢二钠溶液(例如将磷酸氢二钠溶液按140-200kg/小时的速度加入普鲁兰酶发酵液中)，加入过程中进行搅拌，充分混匀；一般地，每吨普鲁兰酶发酵液可在120分钟左右加完磷酸氢二钠溶液。
尤其要注意的是，磷酸氢二钠溶液与石灰乳不能同时添加。
4)向步骤3)所得普鲁兰酶发酵液中用石灰水溶液(或称石灰乳)或氢氧化钙溶液调节ph值至7-7.2；
进一步地，将调整好ph值的普鲁兰酶发酵液充分稳定(例如稳定30分钟后)再进行后续操作。
5)向步骤4)所得普鲁兰酶发酵液中加入聚丙烯酰胺溶液，使普鲁兰酶发酵液中聚丙烯酰胺的重量含量为0.008％-0.02％；使普鲁兰酶发酵液充分凝聚。
进一步地，所述聚丙烯酰胺溶液的浓度为0.1％-0.3％，优选为0.2％。
进一步地，可分批加入聚丙烯酰胺溶液。
取样检验，达到絮凝效果后，即可停止添加聚丙烯酰胺，絮凝剂最大添加量不要超过0.02％。
具体地，判断达到絮凝效果的方法是：待发酵液有明显的块状絮凝，静止30s后絮凝物沉淀，上清液澄清，用实验室滤纸过滤，滤液澄清透亮，滤速每分钟30滴以上，达到絮凝效果。
进一步地，将絮凝处理好的普鲁兰酶发酵液静置(一般静置30分钟左右)后，过滤(例如采用板框压滤，400#硅藻土，1.5kg/m2，)；
将滤液用冰醋酸溶液(例如浓度20％)调节ph到4.2-4.5(例如调节ph到4.5)；浓缩(例如采用超滤膜浓缩，mmco为20000)，一般浓缩至酶活3000u/g以上；再进行精滤(例如采用板框压滤，1-2次，400#硅藻土，1.6-2kg/m2)；将所得精滤液加入氯化钠3-4％(优选4％)，蔗糖20-25％(优选20％)以及适量防腐剂(优选山梨酸钾2％，苯甲酸钠1％)，混匀；即得普鲁兰酶(液)。
本发明还包括上述方法制备的普鲁兰酶(液)。
进一步地，本发明所用生石灰或氢氧化钙，氯化钙，磷酸氢二钠，以及聚丙烯酰胺均为食品级。
进一步地，本发明可采用apam1600万单位或采用apam1200万单位的聚丙烯酰胺。
本发明所用原料均可市售购得，或按本领域常规方法制备。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，即得本发明各较佳实例。
此外，应理解，本文中，“包括”、“包含”、“含有”等术语的含义中也包括了“由……组成”、“由……构成”、“由……制成”等。
本发明所述普鲁兰酶发酵液可按本领域常规方法制备，例如cn201010101281.1记载的方法。
本发明优点在于：
1)成本低：生石灰、氯化钙、磷酸氢二钠、聚丙烯酰胺价格低；
2)提高板框过滤效果，100m2板框压滤机可以处理6-8m3酶活1000u/ml的发酵液；
3)过滤后滤液菌落数较少，澄清，od600在0.15以下；
4)过滤速度快，生产效率高，适合产业化；
5)板框过滤后酶活损失少。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
1.絮凝剂的溶解
1.1食品级阴离子聚丙烯酰胺的配制(apam1600万单位，加热搅拌)：首先在配料罐添加合适的工艺水，然后升温至45-50℃，再缓慢添加适量的聚丙烯酰胺，浓度控制范围为0.1％-0.3％，配制过程温度控制在45-50℃。
1.2食品级磷酸氢二钠的配制：首先在配料罐在添加合适的工艺水，然后升温至50-60℃，再缓慢添加适量的磷酸氢二钠，浓度控制范围为10％-16％，配制过程温度控制在50-60℃；
1.3食品级氯化钙的配制：食品级氯化钙使用工艺水调配氯化钙浓度到6％-15％，待用。
1.4石灰乳的配制
石灰(粉碎好的)，加水配制成1.5％-2.5％的浓度待用，使用期间一直开启搅拌。
2.絮凝
2.1.普鲁兰酶发酵液调ph值：用浓度1.5-2％的石灰水溶液调节ph值至6.9-7.1，30分钟内完成。要缓慢地加入，避免局部ph过高。
2.2.中速流加氯化钙溶液，至2.5-6％，加完后，ph会下降，接着用石灰乳调节ph范围为6.9-7.1。
要求：添加时间控制在1小时附近；
氯化钙与石灰乳不能同时添加；
氯化钙与石灰乳必须采用分布盘添加。
2.3.缓慢流加磷酸氢二钠溶液：至少分三次添加，每次添加溶液ph都会下降，每次要用石灰乳调节ph到6.9-7.1。
要求：添加时间控制在2小时附近；
磷酸氢二钠与石灰乳不能同时添加；
磷酸氢二钠与石灰乳必须采用分布盘添加。
2.4.将添加完氯化钙和磷酸氢二钠的发酵液的ph值用石灰乳调节至7-7.2。
要求：(待ph稳定30min后，再进行下一步操作。)
2.5.添加聚丙烯酰胺：分批加入约溶液体积20％的聚丙烯酰胺，取样检验，达到絮凝效果后，停止添加聚丙烯酰胺，絮凝剂最大添加量不要超过0.02％。
2.6.停止搅拌，待发酵液静置30分钟后，用400#硅藻土预涂，1.5kg/m2，进行板框压滤。
2.7.滤液用20％的冰醋酸调ph到4.5。
2.8.超滤膜(mmco为20000)浓缩。
2.9.将400#硅藻土加入酶液，1.6-2kg/m2，进行板框精滤，1-2次，酶成品加入氯化钠4％，蔗糖20％，山梨酸钾2％，苯甲酸钠1％，灌装，提取结束。
实施例1
一种普鲁兰酶的制备方法，包括以下步骤：
1)将普鲁兰酶发酵液(酶活886u/ml)用浓度2％的石灰水溶液(或称石灰乳)调节ph值至6.9-7.1；
2)向步骤1)所得普鲁兰酶发酵液中加入浓度6％的氯化钙溶液，使普鲁兰酶发酵液中氯化钙的重量含量为3％，在加完氯化钙溶液后再用步骤1)相同石灰水溶液调节普鲁兰酶发酵液的ph值至6.9-7.1；
3)向步骤2)所得普鲁兰酶发酵液中分至少三次加入磷酸氢二钠溶液，使普鲁兰酶发酵液中磷酸氢二钠的重量含量为2.5％；每次加入磷酸氢二钠溶液后，普鲁兰酶发酵液的ph会下降，用步骤1)相同石灰水溶液调节普鲁兰酶发酵液的ph值至6.9-7.1；
4)向步骤3)所得普鲁兰酶发酵液中用石灰水溶液调节ph值至7-7.2；
5)充分稳定后，向步骤4)所得普鲁兰酶发酵液中加入聚丙烯酰胺溶液，使普鲁兰酶发酵液中聚丙烯酰胺的重量含量为0.02％，使普鲁兰酶发酵液充分凝聚。
6)将絮凝处理好的普鲁兰酶发酵液静置(一般静置30分钟左右)后，过滤，采用板框压滤，400#硅藻土，1.5kg/m2。
第一次过滤后滤液od600为0.12，酶活330u/ml；第一次过滤后酶液的收率：95％。
将滤液用浓度20％冰醋酸溶液调节ph到4.5；采用超滤膜浓缩(mmco为20000)；再进行采用板框压滤机精滤(1-2次，400#硅藻土，1.6-2kg/m2)；将所得精滤液加入氯化钠4％，蔗糖20％，山梨酸钾2％，苯甲酸钠1％，混匀；即得普鲁兰酶(液)。
实施例2
一种普鲁兰酶的制备方法，与实施例1的区别仅在于：步骤2)使普鲁兰酶发酵液中氯化钙的重量含量为2.5％。
步骤6)第一次过滤后滤液od600为0.13，酶活283u/ml；第一次过滤后酶液的收率：91％。
实施例3
一种普鲁兰酶的制备方法，与实施例1的区别仅在于：步骤3)使普鲁兰酶发酵液中磷酸氢二钠的重量含量为2.4％。
步骤6)第一次过滤后滤液od600为0.14，酶活302u/ml；第一次过滤后酶液的收率：90％。
实验例1
实验样品：
普鲁兰酶发酵液(酶活450u/ml)；
石灰(即氧化钙)80g，加水4l，制成石灰乳，备用；
氯化钙300g，加水2.5l，制成氯化钙溶液，备用；
磷酸氢二钠120g，加水750ml，制成磷酸氢二钠溶液，备用；
聚丙烯酰胺1g，加水500ml，制成聚丙烯酰胺溶液，备用；
高效助滤剂，供应商为钟祥市康硒生物科技有限公司。
处理1：
取普鲁兰酶发酵液(酶活450u/ml)5l，加入石灰乳，维持体系ph维持7.1-7.3；缓慢加入氯化钙溶液，搅匀；分三次加入磷酸氢二钠溶液，每次加入磷酸氢二钠溶液后，用石灰乳调节普鲁兰酶发酵液的ph值至6.9-7.1；全部加完磷酸氢二钠溶液后，用石灰乳调节普鲁兰酶发酵液的ph值至7-7.2；最后加入聚丙烯酰胺溶液，搅匀，使普鲁兰酶发酵液充分凝聚；经检测，达到絮凝效果。所得体系总体积为12.75l，相当于发酵液原液稀释2.55倍，ph为7.1。
将絮凝处理好的普鲁兰酶发酵液静置30分钟左右后，进行过滤：用400g的400#白色硅藻土预涂0.23m2小板框(气动隔膜泵)，滤饼成型；第一次过滤后滤液od600为0.13，酶活190u/ml；第一次过滤后酶液的收率：93％。
处理2：
取上述高效助滤剂45g，溶于7.5l水中，然后加入上述5l普鲁兰酶发酵液(酶活450u/ml)中；充分絮凝后采用与处理1相同的方法过滤；第一次过滤后滤液od600为0.5，酶活180u/ml；第一次过滤后酶液的收率：80％。
以上实验结果表明，处理1的絮凝效果显著优于处理2，且所用絮凝剂价格更低、处理后滤液更澄清，酶活更高、板框过滤速度更快。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。