本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种用于制备dnaladder的引物对、dna片段及方法。
背景技术：
dna分子量标准(dnaladder或dnamarker)是指一系列已知分子量的dna混合物，因dna分子量不同而引起电泳迁移率的不同，从而形成dna片段分布的梯度(ladder)，用以指示电泳过程中未知dna样品的分子量，是分子生物学实验常用的试剂耗材之一。dnaladder的制备方法可以分为限制性内切酶酶切法和pcr扩增法两种方法。
限制性内切酶酶切法系利用限制性内切酶对天然的基因组dna或人工构建的质粒dna进行酶切，从而得到dnaladder。由于天然来源的基因组dna往往存在以下缺点：(1)酶切产生的片段分子量跨度虽然较大，但条带大小分布不均匀，不能人工调控dnaladder的片段大小和浓度；(2)酶切所用的内切酶不是常用的种类，制备成本较高，这些不足限制了其在dnaladder中的应用。人工构建的质粒dna则是一次性把预先设计的各种dna片段插入到质粒中，随后将质粒转化大肠杆菌，对大肠杆菌进行发酵培养，再对质粒dna进行分离纯化，最后用限制性内切酶酶切质粒dna即可获得事先设计好的dnaladder。该方法的优势在于制备规模容易放大、电泳条带锐利、重复性好。但在制备小片段的dnaladder时，由于dna片段越小，结合的dna染料就越少，其条带的亮度弱，所以人工构建的质粒dna通常不适用于制备小片段的dnaladder。目前，小片段dnaladder的制备主要以pcr扩增法为主。
pcr扩增法是基于pcr能够快速有效地扩增大量的目的片段，在制备小片段dnaladder时优势明显，pcr扩增又可分为单片段的扩增和多片段的扩增，利用这些方法已能制备出dl1000(100-1000bp)dnaladder。然而，单片段扩增法需要对每个片段进行pcr扩增，检测各片段的pcr扩增效率和浓度情况，再按照设计好的分子量及浓度进行稀释与混合。单片段扩增法通常需要分别扩增数十个pcr反应，浓度调配过程费时费力，实验重复性差。多片段扩增法指在pcr体系中引入数十对引物，以期通过一次pcr来获得数十个dna片段，然而，由于每个片段的扩增效率和反应参数都会存在差异，循环数越多，pcr扩增效率上的差距就会越加显著，导致优化过程费时费力，重复性差。
技术实现要素：
本发明针对现有技术中存在的上述不足，提供了一种用于制备dnaladder的引物对、dna片段及方法。利用本发明方法制备dnaladder克服了单片段pcr扩增法所需劳动强度大、多片段pcr扩增法条件优化复杂等缺陷，能够快速地制备dnaladder。
一种用于制备dnaladder的引物对，包括上游引物和下游引物，所述上游引物包括位于5’端的第一互补结合区和位于3’端的第一模板结合区，所述下游引物包括位于5’端的第二互补结合区和位于3’端的第二模板结合区，所述第一互补结合区序列和第二互补结合区序列反向互补。
第一模板结合区和第二模板结合区作为在pcr时引物与模板的结合区域，本发明对模板的序列本身没有特殊要求，因为作为dnaladder，只需要考虑分子量大小，即片段中含有的碱基数量，而对序列本身并没限定。
优选的，所述第一互补结合区和第二互补结合区的退火温度为55℃～70℃。退火温度与序列的长短及dna序列中a、t或g、c碱基所占比例有关，合适的退火温度可以使pcr扩增方便简单，成功率高。
优选的，所述第一互补结合区和第二互补结合区的长度为15～30bp。更优选的，所述第一互补结合区和第二互补结合区的长度为18～25bp。长度能够完成pcr扩增即可，一般20个左右较为合适。
本发明又提供了一种制备dnaladder的方法，包括以下步骤：
(1)使用所述的引物对扩增相应的模板或者互为模板进行第一次pcr扩增获得双链dna片段；
(2)将步骤(1)所得的双链dna片段同时作为引物及模板进行第二次pcr扩增，获得所述dnaladder。
步骤(1)中，上游引物的第一模板结合区和下游引物的第二模板结合区分别与模板配对结合，最终所得的pcr产物为两端带有第一互补结合区(互补链两端带有第二互补结合区)序列的双链dna片段，dna片段两端第一互补结合区之间的片段称为间隔序列，间隔序列的长度称为间隔长度。当然，如果间隔长度较短，而第一模板结合区和第二模板结合区序列较长，则完全可以由上游引物和下游引物两者互为模板进行扩增，而不需要额外使用模板，此时第一模板结合区与第二模板结合区两者3’端的一定长度的序列可以互补配对，甚至于第一模板结合区与第二模板结合区全部序列都互补配对。
步骤(2)中，将步骤(1)所得双链dna片段同时作为引物和模板是指，双链dna片段在解链后，正义链(本申请中，正义链、反义链是一个相对的概念，也可以将带有第二互补结合区的那条定义为正义链)两端带有第一互补结合区，反义链(正义链的互补链)两端带有第二互补结合区，pcr时，共有三种可能的情况：①正义链和反义链之间完全进行配对，②正义链的5’端第一互补结合区与反义链的5’端第二互补结合区进行互补配对，③正义链的3’端与反义链的3’端进行互补配对。在第③种情况下，两条链之间即可以互为模板进行扩增，获得的双链dna片段中，正义链两端及中间各有一段第一互补结合区，三段第一互补结合区之间夹了两段间隔序列。
随着pcr循环数的增加，小片段的dna片段在pcr体系中逐渐减少，而扩增得到的大片段则逐渐增加，控制pcr循环数即可获得分子量相差固定核苷酸数量大小的dnaladder。
比如第一互补结合区和第二互补结合区的长度为n个bp，间隔长度为m个bp，则所得dnaladder最小的片段(不同大小的片段，跑dna胶后形成不同条带)为(2n+m)bp，第二小的片段为(3n+2m)bp，相邻两条条带中，分子量大的那条比分子量小的那条大(n+m)bp。相邻两条条带的分子量差值为dnaladder的梯度长度，梯度长度的大小为(n+m)bp。间隔序列的间隔长度可以为0，间隔长度为0时，即不含有中间的间隔序列，此时，所述双链dna片段仅只有两端的互补结合区，dnaladder的梯度长度为nbp。
优选的，所述dnaladder的梯度长度为20～250bp。本发明方法一般适用于小片段的dnaladder，所以梯度长度一般在一个较小的范围内时比较合适。
优选的，所述第二次pcr扩增为常规pcr扩增，pcr扩增方法为：退火温度为50～70℃，3～15个循环。pcr扩增的具体参数可以通过优化确定最合适的条件，随着pcr循环数的增加，小片段的dna片段在pcr体系中逐渐减少，而扩增得到的大片段则逐渐增加，基于此，可以通过优化循环数确定最合适的条件。
本发明又提供了一种用于制备dnaladder的双链dna片段，包括正义链和反义链，所述正义链包括两端的第一互补结合区和中间的间隔序列，所述反义链包括两端的与所述第一互补结合区序列反向互补的第二互补结合区和中间的与所述间隔序列反向互补的间隔互补序列。该双链dna片段即相当于上述方法中经步骤(1)所得的产物。所述的双链dna片段，利用所述引物对扩增相应的模板或者互为模板进行pcr扩增制得。当然也可以通过其他方法获得这种双链dna片段，比如通过基因合成或特定的质粒进行酶切获得。
本发明还提供了用于制备dnaladder的单链dna片段对，包括正义链和反义链，所述正义链包括两端的第一互补结合区和中间的间隔序列，所述反义链包括两端的与所述第一互补结合区序列反向互补的第二互补结合区和中间的与所述间隔序列反向互补的间隔互补序列。上述双链dna片段经高温解链即得到此处所述的单链dna片段，在pcr反应时，双链dna片段也是首选需要经高温解链。而这样的两条单链dna片段，除了可以由双链dna片段解链获得之外，还可以直接人工合成两条单链dna片段，相当于人工合成两条较长的引物，在pcr扩增时，将两条单链dna片段加入与直接加入上述双链dna片段具有相同的效果。
本发明还提供了一种制备dnaladder的方法，包括以下步骤：将所述的双链dna片段或所述的单链dna片段对同时作为引物及模板进行pcr扩增获得所述dnaladder。
优选的，所述dnaladder的梯度长度为20～250bp。
本发明使用一种双链dna片段(该双链dna片段可以由本发明所述引物对进行pcr扩增得到)，或者与该双链dna片段序列一致的两条单链dna片段进行pcr扩增，该双链dna片段的5’端和3’端具有第一互补结合区，即5’端和3’端具有相同的一段序列，因此，在pcr体系中，该dna片段既能作为pcr反应的模板，又能作为pcr反应的引物。随着pcr循环数的增加，小片段的dna片段在pcr体系中逐渐减少，而扩增得到的大片段则逐渐增加，控制pcr循环数即可获得分子量相差固定核苷酸数量大小的dnaladder。利用本发明中的dnaladder制备方法，可以在一次pcr反应中制备出片段浓度相对均一的dnaladder，该方法克服了单片段pcr扩增法所需劳动强度大、多片段pcr扩增法条件优化复杂等缺陷，能够快速地制备dnaladder。
附图说明
图1为引物对经pcr扩增得到双链dna片段的电泳检测结果图。其中，m为dl2000(分子量自下而上分别为：100、250、500、750、1000、2000，单位为bp，下同)，泳道1为tm55f/r引物对扩增得到的pcr产物，泳道2为tm60f/r引物对扩增得到的pcr产物，泳道3为tm65f/r引物对扩增得到的pcr产物，泳道4为tm70f/r引物对扩增得到的pcr产物。
图2是引物对经pcr扩增得到的双链dna片段分别在50℃退火条件下，不同pcr循环数后的电泳检测结果图。其中，泳道1-5为tm55f/r扩增dna片段分别经3、6、9、12和15个pcr循环后的电泳结果，泳道6-10为tm60f/r扩增dna片段分别经3、6、9、12和15个pcr循环后的电泳结果，泳道11-15为tm65f/r扩增dna片段分别经3、6、9、12和15个pcr循环后的电泳结果，泳道16-20为tm70f/r扩增dna片段分别经3、6、9、12和15个pcr循环后的电泳结果。
图3是引物对经pcr扩增得到的双链dna片段分别在60℃退火条件下，不同pcr循环数后的电泳检测结果图。其中，泳道1-5为tm55f/r扩增dna片段分别经3、6、9、12和15个pcr循环后的电泳结果，泳道6-10为tm60f/r扩增dna片段分别经3、6、9、12和15个pcr循环后的电泳结果，泳道11-15为tm65f/r扩增dna片段分别经3、6、9、12和15个pcr循环后的电泳结果，泳道16-20为tm70f/r扩增dna片段分别经3、6、9、12和15个pcr循环后的电泳结果。
图4是引物对经pcr扩增得到的dna片段分别在70℃退火条件下，不同pcr循环数后的电泳检测结果图。其中，泳道1-5为tm55f/r扩增dna片段分别经3、6、9、12和15个pcr循环后的电泳结果，泳道6-10为tm60f/r扩增dna片段分别经3、6、9、12和15个pcr循环后的电泳结果，泳道11-15为tm65f/r扩增dna片段分别经3、6、9、12和15个pcr循环后的电泳结果，泳道16-20为tm70f/r扩增dna片段分别经3、6、9、12和15个pcr循环后的电泳结果。
图5是本发明所制备dnaladder的电泳结果。其中，m1为dl100(分子量自下而上分别为：100、200、300、400等，单位为bp)，m2为dl2000(分子量自下而上分别为：100、250、500、750、1000、2000，单位为bp)，泳道1和2为制备的dnaladder(分子量自下而上分别为120、220、320、420、520等，每个条带递增100，单位为bp)。
具体实施方式
实施例1：
本实施例用于说明利用5’和3’端第一互补结合区退火温度为55℃的dna片段来制备分子量相差100bp的dnaladder的操作。
(1)以pqe60质粒为模板，进行pcr反应，引物为
上游引物tm55-f：
5’-gaattctagcgtcgttccacctggccccagtgctgcaatgatac-3’，
下游引物tm55-r：
5’-gtggaacgacgctagaattctccggctggctggtttattgctg-3’。
其中，上游引物中没有下划线的区域为第一互补结合区，有下划线的区域为第一模板结合区；下游引物中，没有下划线的区域为第二互补结合区，有下划线的区域为第二模板结合区(下同)。
pcr体系为10μl，含模板0.4μl，10μm的引物各0.4μl，2×pcrmix(内含dna聚合酶、dntp等)5μl，其余用ddh2o补足到10μl。pcr条件：94℃预变性4min；94℃变性10s、70℃退火10s、72℃延伸20s，共40个循环；72℃再延伸5min。pcr扩增得到120bp的双链dna片段，该片段单链序列如下：
gaattctagcgtcgttccacctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggagaattctagcgtcgttccac。
第一互补结合区的长度为20bp，间隔序列长度为80bp。
(2)以步骤(1)所得的双链dna片段为模板和引物进行3次单独的pcr反应。pcr体系为10μl，含步骤(1)所得的dna片段1μl，2×pcrmix5μl，其余用ddh2o补足到10μl。pcr条件：94℃预变性1min；94℃变性30s，50℃、60℃或70℃退火30s；72℃延伸1min，进行3-15个pcr循环。
(3)琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果，根据电泳结果选择最佳的pcr循环数或不同循环数的最佳组合，得到分子量相差100bp的dnaladder。
实施例2：
本实施例用于说明利用5’和3’端第一互补结合区退火温度为60℃的dna片段来制备分子量相差100bp的dnaladder的操作。
方法步骤同实施例1，仅引物更换为
上游引物tm60-f：
5’-gaattccacggtcgatccacctggccccagtgctgcaatgatac-3’，
下游引物tm60-r：
5’-gtggatcgaccgtggaattctccggctggctggtttattgctg-3’。
实施例3：
本实施例用于说明利用5’和3’端第一互补结合区退火温度为65℃的dna片段来制备分子量相差100bp的dnaladder的操作。
方法步骤同实施例1，仅引物更换为
上游引物tm65-f：
5’-gaattccgccgtcgttccacctggccccagtgctgcaatgatac-3’，
下游引物tm65-r：
5’-gtggaacgacggcggaattctccggctggctggtttattgctg-3’。
实施例4：
本实施例用于说明利用5’和3’端第一互补结合区退火温度为70℃的dna片段来制备分子量相差100bp的dnaladder的操作。
方法步骤同实施例1，仅引物更换为
上游引物tm70-f：
5’-gaattccgccgtcgggctgactggccccagtgctgcaatgatac-3’，
下游引物tm70-r：
5’-tcagcccgacggcggaattctccggctggctggtttattgctg-3’。
实施例1～4结果及分析：
图1为引物对经pcr扩增得到双链dna片段的电泳结果图，其中，m为dl2000(分子量自下而上分别为：100、250、500、750、1000、2000，单位为bp，下同)，泳道1为tm55f/r引物对扩增得到的pcr产物，泳道2为tm60f/r引物对扩增得到的pcr产物，泳道3为tm65f/r引物对扩增得到的pcr产物，泳道4为tm70f/r引物对扩增得到的pcr产物。根据图1可见，利用pqe60质粒为模板，第一互补结合区的退火温度虽然不同(55-70℃)，但都可以扩增得到均一的预期pcr条带。
图2是引物对经pcr扩增得到的双链dna片段分别在50℃退火条件下，不同pcr循环数后的电泳检测结果图。其中，泳道1-5为tm55f/r扩增dna片段分别经3、6、9、12和15个pcr循环后的电泳结果，泳道6-10为tm60f/r扩增dna片段分别经3、6、9、12和15个pcr循环后的电泳结果，泳道11-15为tm65f/r扩增dna片段分别经3、6、9、12和15个pcr循环后的电泳结果，泳道16-20为tm70f/r扩增dna片段分别经3、6、9、12和15个pcr循环后的电泳结果。根据图2可见，不同的dna片段在50℃退火条件下，经不同的pcr循环数后均能得到dnaladder。
图3是引物对经pcr扩增得到的双链dna片段分别在60℃退火条件下，不同pcr循环数后的电泳检测结果图。其中，泳道1-5为tm55f/r扩增dna片段分别经3、6、9、12和15个pcr循环后的电泳结果，泳道6-10为tm60f/r扩增dna片段分别经3、6、9、12和15个pcr循环后的电泳结果，泳道11-15为tm65f/r扩增dna片段分别经3、6、9、12和15个pcr循环后的电泳结果，泳道16-20为tm70f/r扩增dna片段分别经3、6、9、12和15个pcr循环后的电泳结果。根据图3可见，不同的dna片段在60℃退火条件下，经不同的pcr循环数后均能得到dnaladder。
图4是引物对经pcr扩增得到的dna片段分别在70℃退火条件下，不同pcr循环数后的电泳检测结果图。其中，泳道1-5为tm55f/r扩增dna片段分别经3、6、9、12和15个pcr循环后的电泳结果，泳道6-10为tm60f/r扩增dna片段分别经3、6、9、12和15个pcr循环后的电泳结果，泳道11-15为tm65f/r扩增dna片段分别经3、6、9、12和15个pcr循环后的电泳结果，泳道16-20为tm70f/r扩增dna片段分别经3、6、9、12和15个pcr循环后的电泳结果。根据图4可见，不同的dna片段在70℃退火条件下，经不同的pcr循环数后均能得到dnaladder。
图5是本发明所制备dnaladder的电泳结果。其中，m1为dl100(分子量自下而上分别为：100、200、300、400等，单位为bp)，m2为dl2000(分子量自下而上分别为：100、250、500、750、1000、2000，单位为bp)，泳道1和2为tm60f/r在60℃退火温度下扩增dna片段制备的dnaladder，泳道1经过6个pcr循环，泳道2经过9个pcr循环(分子量自下而上分别为120、220、320、420、520等，每个条带递增100，单位为bp)。根据图5可知，利用本发明制备的dnaladder，具有条带清晰、分子量准确、条带均一性好等优点，可用于常规的分子生物学实验。
序列表
<110>浙江大学
<120>一种用于制备dnaladder的引物对、dna片段及方法
<160>9
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>44
<212>dna
<213>人工序列(artificial)
<400>1
gaattctagcgtcgttccacctggccccagtgctgcaatgatac44
<210>2
<211>43
<212>dna
<213>人工序列(artificial)
<400>2
gtggaacgacgctagaattctccggctggctggtttattgctg43
<210>3
<211>120
<212>dna
<213>人工序列(artificial)
<400>3
gaattctagcgtcgttccacctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctc60
accggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggagaattctagcgtcgttccac120
<210>4
<211>44
<212>dna
<213>人工序列(artificial)
<400>4
gaattccacggtcgatccacctggccccagtgctgcaatgatac44
<210>5
<211>43
<212>dna
<213>人工序列(artificial)
<400>5
gtggatcgaccgtggaattctccggctggctggtttattgctg43
<210>6
<211>44
<212>dna
<213>人工序列(artificial)
<400>6
gaattccgccgtcgttccacctggccccagtgctgcaatgatac44
<210>7
<211>43
<212>dna
<213>人工序列(artificial)
<400>7
gtggaacgacggcggaattctccggctggctggtttattgctg43
<210>8
<211>44
<212>dna
<213>人工序列(artificial)
<400>8
gaattccgccgtcgggctgactggccccagtgctgcaatgatac44
<210>9
<211>43
<212>dna
<213>人工序列(artificial)
<400>9
tcagcccgacggcggaattctccggctggctggtttattgctg43