本发明涉及环境微生物
技术领域：
，具体涉及一种定向筛选土壤目标微生物菌群的方法。
背景技术：
：土壤中存在着大量微生物，且种类繁多。微生物能够降解土壤环境中有机污染物，也可通过促进植物生长，提高植物修复的效率。由于外源添加到土壤中的微生物需要与土著微生物进行竞争，使得添加的微生物在土壤环境中存在时间较短。快速筛选土壤样品中的目标微生物菌群可有效提高污染土壤植物修复和微生物修复的效率。目标微生物菌群的传统筛选主要采用选择性培养基法。由于选择性培养基的选择作用往往非常有限，分离得到的目标微生物菌群数量较少，尤其大量菌群没有合适的选择性培养基供使用。而且，传统分离过程成本高、周期长。技术实现要素：针对以上不足之处，本发明的目的在于提供一种定向筛选土壤目标微生物菌群的方法，该方法可以在短时间内从大量未知细菌中识别目标微生物，实现土壤样品中的目标微生物菌群的定向高通量快速筛选。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种定向筛选土壤目标微生物菌群的方法，其特征在于，包括以下步骤：s1采集土壤样品，制备土壤悬液：取土样，置于无菌瓶中，加入缓冲液，置于摇床上震荡，得土壤悬液；s2分离培养：将步骤s1所述土壤悬液进行梯度稀释，取稀释液涂布到含有真菌抑制剂的培养基平板上，于培养箱内培养；然后，挑取单菌落在培养基平板上进行划线纯化；接着，挑取纯化后的所述单菌落，在含有无菌水的聚合酶链式反应(pcr)管中搅拌，同时接种至含有液体培养基的离心管；再将离心管置于摇床上培养8h～12h生成菌株；s3快速分筛：将步骤s2所述pcr管置于pcr仪上，运行pcr程序；其中，所述pcr管中溶液作为后续pcr反应的模板，使用目标微生物的特异性引物进行聚合酶链式反应(pcr)；采用琼脂糖凝胶电泳检测菌株的聚合酶链式反应(pcr)扩增产物，筛选出扩增dna片段大小与目标微生物扩增dna片段相近的菌株，即为潜在目标微生物。本发明，在步骤s1中，取5g～10g新鲜土样，置于无菌三角瓶中，加入45ml～90ml无菌磷酸缓冲液，置于摇床上震荡，得土壤悬液；其中，所述无菌磷酸缓冲液ph6.5，含磷酸二氢钾1g/l；在置于摇床上震荡时，震荡时间为30min～60min，且每10min～15min以47khz频率超声一次，每次20s～40s。在步骤s2中，将步骤s1所述土壤悬液进行10倍梯度稀释，取稀释倍数为10、102以及103的稀释液分别涂布到含有真菌抑制剂的培养基平板上，于温度为30℃的培养箱内培养2～7天，其中，所述真菌抑制剂为放线菌酮和噻菌灵，浓度分别为100mg/l和50mg/l；所述培养基可以为低营养培养基，也可以为富营养培养基；进一步地，所述低营养培养基为1g/l磷酸二氢钾、0.1g/l硫酸铵、0.1g/l酵母提取物、20g/l琼脂，ph6.5；所述富营养培养基为胰酪蛋白胨15.0g/l、大豆木瓜蛋白酶消化物5.0g/l、氯化钠5.0g/l、琼脂15.0g/l，ph7.1～ph7.5；优选地，步骤s2中，使用无菌牙签挑取单菌落在培养基平板上进行划线纯化，接着，挑取纯化后的所述单菌落，在含有20μl无菌水的pcr管中搅拌多次，同时接种至含有1ml液体培养基的2ml的离心管，将离心管置于转速为180rpm的摇床上培养8h～12h。在步骤s3中，所述pcr反应的模板无需dna提取步骤，所述pcr程序为：95℃预变性10min，10℃冷却10min。优选地，所述pcr反应采用25μl反应体系：takarapremixextaq12.5μl，10μmol/l的引物各0.5μl，dna模板1μl，无菌水10.5μl；pcr反应条件：95℃预变性30s；94℃变性60s，56℃退火30s，72℃延伸30s，32个循环，72℃延伸10min；或者，95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火和延伸30s，32个循环，72℃延伸10min；采用琼脂糖凝胶电泳检测菌株的pcr扩增产物，筛选出扩增dna片段大小与目标微生物扩增dna片段相近的菌株，即为潜在目标微生物。本发明中，所述目标微生物可以为伯克氏菌、假单胞菌或其他微生物菌群。所述目标微生物菌群为伯克氏菌，所述特异性引物的序列分别如seqidno：1和seqidno：2所示，筛选出的扩增dna片段大小约440bp。所述目标微生物菌群为假单胞菌，所述特异性引物的序列分别如seqidno：3和seqidno：4所示，筛选出的扩增dna片段大小约250bp。有益效果：本发明利用目标微生物菌群特异性引物与细菌菌液直接进行聚合酶链式反应(pcr)筛选未知细菌菌群中的目标菌群，整个筛选过程操作简单，省时省力，快速、直观、高效；实现土壤样品中的目标微生物菌群的定向高通量快速筛选；本发明无需提取dna直接进行pcr，大大缩短菌株鉴定周期。附图说明图1为本发明定向筛选土壤目标微生物菌群的流程图。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例1-4的工作流程如图1所示。实施例1和2中，目标微生物菌群为伯克氏菌，其特异性引物为p1和p2，如表1所示；实施例3和4中，目标微生物菌群为假单胞菌，其特异性引物为p3和p4，如表1所示。表1特异性引物引物引物序列(5′-3′)p1ccctaaacgatgtcaactagttg(seqidno：1)p2accctctgttccgaccat(seqidno：2)p3actttaagttgggaggaaggg(seqidno：3)p4acacaggaaattccaccaccc(seqidno：4)实施例1s1采集土壤样品，制备土壤悬液：取10g新鲜土样，置于无菌三角瓶中，加入90ml无菌磷酸缓冲液(ph6.5，含磷酸二氢钾1g/l)，置于摇床上震荡60min，每15min47khz超声一次，每次30s；s2分离培养：将步骤s1中土壤悬液10倍梯度稀释，取适量稀释液(稀释倍数为10、102、103)均匀涂布到含有真菌抑制剂(放线菌酮和噻菌灵，浓度分别100和50mg/l)的培养基平板上，30℃培养箱内培养7天，所选用培养基为低营养培养基，其中，1g/l磷酸二氢钾，0.1g/l硫酸铵，0.1g/l酵母提取物，20g/l琼脂，ph6.5，使用该培养基产生单菌落；使用无菌牙签挑取单菌落在培养基平板上进行划线纯化；使用无菌牙签挑取纯化后的单菌落，在含有20μl无菌水的pcr管中搅拌数次，同时接种至含有1ml液体培养基的2ml离心管，将离心管置于转速为180rpm的摇床上培养8h～12h；s3快速分筛：将步骤s2中的pcr管置于pcr仪上，运行pcr程序：95℃预变性10min，10℃冷却10min；pcr管中溶液作为后续pcr反应的模板；pcr引物分别如seqidno：1和seqidno：2所示；pcr采用25μl反应体系：takarapremixextaq12.5μl，引物(10μmol/l)各0.5μl，dna模板1μl，10.5μl无菌水；pcr反应条件：95℃预变性30s；94℃变性60s，56℃退火30s，72℃延伸30s，32个循环；72℃延伸10min；采用琼脂糖凝胶电泳检测菌株的pcr扩增产物；扩增dna片段大小约440bp的菌株即为潜在伯克氏菌。实施例2s1采集土壤样品，制备土壤悬液：取10g新鲜土样，置于无菌三角瓶中，加入90ml无菌磷酸缓冲液(ph6.5，含磷酸二氢钾1g/l)，置于摇床上震荡60min，每15min47khz超声一次，每次30s；s2分离培养：将步骤s1中土壤悬液10倍梯度稀释，取适量稀释液(稀释倍数为10、102、103)均匀涂布到含有真菌抑制剂(放线菌酮和噻菌灵，浓度分别100和50mg/l)的培养基平板上，30℃培养箱内培养2天，所选用培养基为富营养培养基，其中，胰酪蛋白胨15.0g/l，大豆木瓜蛋白酶消化物5.0g/l，氯化钠5.0g/l，琼脂15.0g/l，ph7.1～ph7.5；使用无菌牙签挑取单菌落在培养基平板上进行划线纯化；使用无菌牙签挑取纯化后的单菌落，在含有20μl无菌水的pcr管中搅拌数次，同时接种至含有1ml液体培养基的2ml离心管，将离心管置于转速为180rpm的摇床上培养8h～12h；s3快速分筛：将步骤s2中的pcr管置于pcr仪上，运行pcr程序：95℃预变性10min，10℃冷却10min；pcr管中溶液作为后续pcr反应的模板；pcr引物分别如seqidno：1和seqidno：2所示；pcr采用25μl反应体系：takarapremixextaq12.5μl，引物(10μmol/l)各0.5μl，dna模板1μl，10.5μl无菌水；pcr反应条件：95℃预变性30s；94℃变性60s，56℃退火30s，72℃延伸30s，32个循环；72℃延伸10min；采用琼脂糖凝胶电泳检测各菌株的pcr扩增产物；扩增dna片段大小约440bp的菌株即为潜在伯克氏菌。实施例3s1采集土壤样品，制备土壤悬液：取10g新鲜土样，置于无菌三角瓶中，加入90ml无菌磷酸缓冲液(ph6.5，含磷酸二氢钾1g/l)，置于摇床上震荡60min，每15min47khz超声一次，每次30s；s2分离培养：将步骤s1中土壤悬液10倍梯度稀释，取适量稀释液(稀释倍数为10、102、103)均匀涂布到含有真菌抑制剂(放线菌酮和噻菌灵，浓度分别100和50mg/l)的培养基平板上，30℃培养箱内培养2天，所选用培养基为富营养培养基，其中，胰酪蛋白胨15.0g/l，大豆木瓜蛋白酶消化物5.0g/l，氯化钠5.0g/l，琼脂15.0g/l，ph7.1～ph7.5；使用无菌牙签挑取单菌落在培养基平板上进行划线纯化；使用无菌牙签挑取纯化后的单菌落，在含有20μl无菌水的pcr管中搅拌数次，同时接种至含有1ml液体培养基的2ml离心管，将离心管置于转速为180rpm的摇床上培养8h～12h；s3快速分筛：将步骤s2中的pcr管置于pcr仪上，运行pcr程序：95℃预变性10min，10℃冷却10min；pcr管中溶液作为后续pcr反应的模板；pcr引物分别如seqidno：3和seqidno：4所示；pcr采用25μl反应体系：takarapremixextaq12.5μl，引物(10μmol/l)各0.5μl，dna模板1μl，10.5μl无菌水；pcr反应条件：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火和延伸30s，32个循环；72℃延伸10min；采用琼脂糖凝胶电泳检测各菌株的pcr扩增产物；扩增dna片段大小约250bp的菌株即为潜在假单胞菌。实施例4s1采集土壤样品，制备土壤悬液：取10g新鲜土样，置于无菌三角瓶中，加入90ml无菌磷酸缓冲液(ph6.5，含磷酸二氢钾1g/l)，置于摇床上震荡60min，每15min47khz超声一次，每次30s；s2分离培养：将步骤s1中土壤悬液10倍梯度稀释，取适量稀释液(稀释倍数为10、102、103)均匀涂布到含有真菌抑制剂(放线菌酮和噻菌灵，分别100和50mg/l)的培养基平板上，30℃培养箱内培养7天；选用培养基为低营养培养基，其中，1g/l磷酸二氢钾，0.1g/l硫酸铵，0.1g/l酵母提取物，20g/l琼脂，ph6.5；使用无菌牙签挑取单菌落在培养基平板上进行划线纯化；使用无菌牙签挑取纯化后的单菌落，在含有20μl无菌水的pcr管中搅拌数次，同时接种至含有1ml液体培养基的2ml离心管，将离心管置于转速为180rpm的摇床上培养8h～12h；s3快速分筛：将步骤s2中的pcr管置于pcr仪上，运行pcr程序：95℃预变性10min，10℃冷却10min；pcr管中溶液作为后续pcr反应的模板；pcr引物分别如seqidno：3和seqidno：4所示；pcr采用25μl反应体系：takarapremixextaq12.5μl，引物(10μmol/l)各0.5μl，dna模板1μl，10.5μl无菌水；pcr反应条件：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火和延伸30s，32个循环；72℃延伸10min；采用琼脂糖凝胶电泳检测各菌株的pcr扩增产物；扩增dna片段大小约250bp的菌株即为潜在假单胞菌。当前第1页12