本发明涉及发酵工程领域，且特别涉及一种三孢布拉霉发酵产番茄红素的方法及番茄红素。
背景技术：
：现有发酵方法通常使用kh2po4或k2hpo4等含po43+的盐来提升磷酸化水平，同时提供了k+，增强细胞膜通透性，益于营养物质进入细胞。使用kh2po4或k2hpo4等含po43+的盐量过少则磷酸化水平不够，大幅降低了类胡萝卜素代谢通量，过多则会带入大量k+，使得菌体的细胞膜通透性变得过于强，导致内部物质如目标产物番茄红素析出至发酵清夜中。同时由于在发酵过程中需要加入碱性阻断剂，抑制了三孢布拉霉生成酸性性激素三孢酸，从而进一步导致番茄红素的代谢通量减弱，而现有方法都是补加代谢前体物质类似物如β-紫罗兰酮等，但加入的前体物质通常价格较高，或难以从市场上大批量获取，这些都是其在工业生产中应用的缺陷。因此，需对现有的三孢布拉霉发酵产番茄红素的方法进行改进。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种三孢布拉霉发酵产番茄红素的方法，此方法简单，成本低廉，通过用含有po43+且不含金属离子及盐的酸性物质控制发酵ph值并提供po43+，避免带入过量的k+，加之配合使用淀粉磷酸酯类物质，以提高番茄红素的产量。本发明的第二目的在于提供一种番茄红素，其由上述三孢布拉霉发酵产番茄红素的方法生产而得，该番茄红素产量较高，适于工业化生产。本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的：本发明提出一种三孢布拉霉发酵产番茄红素的方法，包括以下步骤：分别培养三孢布拉霉正菌和三孢布拉霉负菌，取部分培养的三孢布拉霉正菌及部分培养的三孢布拉霉负菌同时接种，发酵，发酵过程以调节剂控制发酵体系的ph值为5.8-6.2，于发酵开始后的40-100h期间进行补料，继续发酵至120h，放罐。调节剂为含有po43+且不含金属离子及盐的酸性物质。发酵过程中采用的发酵培养基含有淀粉磷酸酯类物质。本发明还提出一种番茄红素，其由上述三孢布拉霉发酵产番茄红素的方法生产而得。优选地，所得的番茄红素的产量为2.5-3.5g/l。本发明较佳实施例提供的三孢布拉霉发酵产番茄红素的方法及番茄红素的有益效果是：(1)一物多用，降低生产成本。含有po43+且不含金属离子及盐的酸性物质可用于调控ph，同时提供了大量po43+，从而提高磷酸化水平。淀粉磷酸酯类物质在提供c源的同时也能提高磷酸化水平。同时使用以上物质，可将kh2po4或k2hpo4的用量降至适宜水平，避免k+过量。(2)简化操作，免除控糖工艺。淀粉磷酸酯类物质作为迟效c源，不必控制补料流加葡萄糖。(3)避免使用风险前体物质。在生产中，前体物质的添加需考虑成本，法规要求，添加工艺等多方面因素，通过补料可达到相同效果，但工艺要简便得多，成本也可控。(4)产量和纯度高。本发明较佳实施例所得的番茄红素产量较现有技术的产量更高，且其单位含量也更高。具体实施方式为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。下面对本发明实施例的三孢布拉霉发酵产番茄红素的方法及番茄红素进行具体说明。本发明实施例提供的三孢布拉霉发酵产番茄红素的方法包括以下步骤：分别培养三孢布拉霉正菌和三孢布拉霉负菌，培养可参照如下方式：将原始三孢布拉霉正菌和原始三孢布拉霉负菌分别接种于含pda培养基的斜面，于26-30℃(优选为28℃)的条件下培养4-8天(优选为6天)，然后再转接于种子培养基中，于26-30℃、200-240rpm的条件下培养44-52h，培养过程中按1-2vvm的流量通入空气。优选地，接种于种子培养基后，于28℃、220rpm的条件下培养48h，培养过程中按1.5vvm的流量通入空气。作为可选地，上述种子培养基例如可以包括1-3wt％的葡萄糖、2-4wt％的玉米浆干粉、0.5-1.5wt％的酵母浸膏、0.04-0.1wt％的磷酸二氢钾、0.005-0.015wt％的硫酸镁、0.02-0.04wt％的谷氨酸钠以及2-4wt％的葵花籽油溶液。优选地，上述种子培养基可包括2wt％的葡萄糖、3wt％的玉米浆干粉、1wt％的酵母浸膏、0.07wt％的磷酸二氢钾、0.01wt％的硫酸镁、0.03wt％的谷氨酸钠以及3wt％的葵花籽油溶液。将培养的三孢布拉霉正菌和三孢布拉霉负菌均分别分为两部分，一部分用于与性别相反的三孢布拉霉菌同时接种发酵，另一部分则继续培养。作为可选地，同时接种例如可将部分培养的三孢布拉霉正菌以及部分培养的三孢布拉霉负菌按重量比为1：3-7同时接种于含有发酵培养基的发酵罐中。优选地，上述三孢布拉霉正菌与三孢布拉霉负菌的重量比为1：5，通过三孢布拉霉正菌与三孢布拉霉负菌按此比例有性结合，可较其它比例下产生更多的性激素三孢酸，提高番茄红素的代谢通量。较佳地，接种所用的三孢布拉霉正菌及三孢布拉霉负菌的生物量干重均不低于10g/l，以确保发酵过程能够产生较大量的性激素三孢酸。进一步地，同时接种后，可按1-2vvm(优选为1.5vvm)的流量向发酵罐中通入干燥压缩空气，然后于180-220rpm(200rpm)的搅拌转速下进行发酵。发酵过程中发酵体系的生物量干重优选不超过50g/l，以满足好氧需求。由于发酵过程中，发酵体系的ph值会升高，若ph值过高，反而会造成不产生番茄红素的现象。因此，本发明实施例中，发酵过程中加入调节剂以控制发酵体系的ph值为5.8-6.2。较佳地，调节剂为含有po43+且不含金属离子及盐的酸性物质，例如磷酸或植酸，优选为植酸。通过使用含有po43+且不含金属离子及盐的酸性物质，尤其是植酸，可有效控制发酵ph值并提供po43+，避免带入过量的k+，提高磷酸化水平。值得说明的是，发酵过程中的ph值需全程检测，ph值一旦在5.8-6.2范围以外，则及时补充调节剂。作为可选地，上述发酵培养基含有淀粉磷酸酯类物质，优选地，淀粉磷酸酯类物质为磷酸化二淀粉磷酸酯。一方面，淀粉磷酸酯类物质在提供c源(迟效c源)的同时也能提高磷酸化水平，因调节剂(植酸)的加入量不大，淀粉磷酸酯类物质即可作为植酸的补充。另一方面，淀粉磷酸酯类物质含有淀粉，可替代普通淀粉，并且其在发酵过程中可水解为葡萄糖，从而减少普通葡萄糖的用量。此外，将调节剂与淀粉磷酸酯类物质共同使用，可将kh2po4或k2hpo4的用量降至适宜水平，避免k+过量。较佳地，本发明实施例的发酵液中p的含量可维持150ppm以上，以保持底物磷酸化高水平的物质基础。作为可选地，上述发酵培养基例如可以含有0.8-1.2wt％葡萄糖、1.0-3.0wt％磷酸化二淀粉磷酸酯、0.8-1.2wt％酵母浸膏、1.8-2.2wt％玉米浆干粉、0.5-0.9wt％磷酸二氢钾、0.8-1.2wt％硫酸镁、1.8-2.2wt％葵花籽油以及阻断剂。较佳地，发酵培养基可含有1wt％葡萄糖、2wt％磷酸化二淀粉磷酸酯、1wt％酵母浸膏、2wt％玉米浆干粉、0.7wt％磷酸二氢钾、1wt％硫酸镁、2wt％葵花籽油以及阻断剂。值得说明的是，上述阻断剂是于发酵开始后的30h加入发酵罐的发酵培养基中，以阻断类胡萝卜素的代谢，使其停留在合成番茄红素上。优选地，阻断剂为含n杂环类物质。随发酵时间的延长，消耗的营养物质逐渐增多，本发明实施例优选于发酵开始后的40-100h期间进行补料。通过补料，以满足菌种生长所需的营养物质等，使其不断生长，不断产生性激素三孢酸。并且，通过补料可与加入前体物质达到相同效果，但工艺要较加入前体物质简便得多，成本也可控。本发明实施中，补料是将除用于接种以外的继续培养所得的三孢布拉霉正菌的上清液和/或除用于接种以外的继续培养所得的三孢布拉霉负菌的上清液补充于发酵体系中。之所以仅补充上清液，其原因在于培养三孢布拉霉后其所产生的激素大部分均存在于上清液中。因三孢布拉霉负菌较三孢布拉霉正菌产生的性激素三孢酸的量更多，故优选地，上述补料是将用于接种以外的继续培养的三孢布拉霉负菌的上清液补充于发酵体系中。较佳地，为使不同阶段的发酵过程中，菌种所获得的营养物质均较充足且均匀，本发明实施例中补料采用馈料式补料法，也即每间隔10h向发酵罐中补入当时发酵液体积为4-6vt％的三孢布拉霉正菌的上清液和/或三孢布拉霉负菌的上清液。对应优选地，补料是每间隔10h向发酵罐中补入当时发酵液体积为5vt％的三孢布拉霉负菌的上清液。接着，继续发酵至120h，放罐。值得说明的是，本发明实施例中，接种和每次补料后，均于剩余的用于继续培养三孢布拉霉正菌和/或三孢布拉霉负菌的种子培养基中补充水和植物油。因接种和补料后，剩余的用于继续培养的体系的体积和c源等营养物质均有所减少，故可分别通过补充水和植物油以补充培养体系的体积及c源。此外，接种和每次补料后，均于剩余的用于继续培养三孢布拉霉正菌和/或三孢布拉霉负菌的种子培养基中加入适量的脱氧胆酸钠，以抑制生物量的增长而保证上清液中激素的浓度，从而可避免带入大量生物量进入发酵罐影响产率。较佳地，以三孢酸为例，加入脱氧胆酸钠后的上清液中激素的浓度不低于1mg/l，生物量低于5g/l。由上述方法较现有技术中通过加入前体物质的方法而言，能够使番茄红素的单位含量从5％左右升高至7％左右，产量从2g/l左右提升至3g/l左右(如2.5-3.5g/l)。以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。实施例1将原始三孢布拉霉正菌和原始三孢布拉霉负菌分别接种于含有pda培养基的斜面，于28℃的条件下培养6天，然后转接于种子培养基，于28℃、220rpm的条件下培养48h，培养过程中按1.5vvm的流量通入空气。将培养的三孢布拉霉正菌和三孢布拉霉负菌均分别分为两部分，一部分用于与性别相反的三孢布拉霉菌同时接种发酵，另一部分则继续培养。其中，同时接种是将培养所得的三孢布拉霉正菌和三孢布拉霉负菌按重量比为1：5的比例接种于含有发酵培养基的发酵罐中。接种时三孢布拉霉正菌与三孢布拉霉负菌的生物量干重均为15g/l。同时接种后，按1.5vvm的流量向发酵罐中通入干燥压缩空气，然后于180rpm的搅拌转速下进行发酵。发酵过程中发酵体系的生物量干重为40g/l。发酵过程中加入植酸以控制发酵体系的ph值为5.8。发酵40h至100h期间，每间隔10h向发酵罐中补入当时发酵液体积的5vt％的除用于接种以外的继续培养所得三孢布拉霉负菌的上清液。继续发酵至120h左右，放罐。接种和每次补料后，均于剩余的用于继续培养三孢布拉霉正菌和/或三孢布拉霉负菌的种子培养基中补充20vt％的水和5wt％的植物油，于0.5vvm和150rpm条件下继续培养，培养过程中加入适量的脱氧胆酸钠以使剩余的上清液中激素的浓度为1.2mg/l，生物量为4.5g/l。其中，种子培养基含有2wt％葡萄糖、3wt％玉米浆干粉、1wt％酵母浸膏、0.07wt％磷酸二氢钾、0.01wt％硫酸镁、0.03wt％谷氨酸钠和3wt％葵花籽油溶液。发酵培养基含有1wt％葡萄糖、2wt％磷酸化二淀粉磷酸酯、1wt％酵母浸膏、2wt％玉米浆干粉、0.7wt％磷酸二氢钾、1wt％硫酸镁、2wt％葵花籽油以及阻断剂，阻断剂于发酵开始后的30h加入发酵罐的发酵培养基中。实施例2将原始三孢布拉霉正菌和原始三孢布拉霉负菌分别接种于含有pda培养基的斜面，于26℃的条件下培养8天，然后转接于种子培养基，于26℃、200rpm的条件下培养52h，培养过程中按1vvm的流量通入空气。将培养的三孢布拉霉正菌和三孢布拉霉负菌均分别分为两部分，一部分用于与性别相反的三孢布拉霉菌同时接种发酵，另一部分则继续培养。其中，同时接种是将培养所得的三孢布拉霉正菌和三孢布拉霉负菌按重量比为1：3的比例接种于含有发酵培养基的发酵罐中。接种时三孢布拉霉正菌与三孢布拉霉负菌的生物量干重均为12g/l。同时接种后，按1vvm的流量向发酵罐中通入干燥压缩空气，然后于180rpm的搅拌转速下进行发酵。发酵过程中发酵体系的生物量干重为45g/l。发酵过程中加入植酸以控制发酵体系的ph值为6.2。发酵40h至100h期间，每间隔10h向发酵罐中补入当时发酵液体积的4vt％的除用于接种以外的继续培养所得三孢布拉霉负菌的上清液。继续发酵至120h左右，放罐。接种和每次补料后，均于剩余的用于继续培养三孢布拉霉正菌和/或三孢布拉霉负菌的种子培养基中补充20vt％的水和5wt％的植物油，于0.5vvm和150rpm条件下继续培养，培养过程中加入适量的脱氧胆酸钠以使剩余的上清液中激素的浓度为1mg/l，生物量为4.2g/l。其中，种子培养基含有1wt％葡萄糖、2wt％玉米浆干粉、0.5wt％酵母浸膏、0.04wt％磷酸二氢钾、0.005wt％硫酸镁、0.02wt％谷氨酸钠和2wt％葵花籽油溶液。发酵培养基含有0.8wt％葡萄糖、1wt％磷酸化二淀粉磷酸酯、0.8wt％酵母浸膏、1.8wt％玉米浆干粉、0.5wt％磷酸二氢钾、0.8wt％硫酸镁、1.8wt％葵花籽油以及阻断剂，阻断剂于发酵开始后的30h加入发酵罐的发酵培养基中。实施例3将原始三孢布拉霉正菌和原始三孢布拉霉负菌分别接种于含有pda培养基的斜面，于30℃的条件下培养4天，然后转接于种子培养基，于30℃、240rpm的条件下培养44h，培养过程中按2vvm的流量通入空气。将培养的三孢布拉霉正菌和三孢布拉霉负菌均分别分为两部分，一部分用于与性别相反的三孢布拉霉菌同时接种发酵，另一部分则继续培养。其中，同时接种是将培养所得的三孢布拉霉正菌和三孢布拉霉负菌按重量比为1：7的比例接种于含有发酵培养基的发酵罐中。接种时三孢布拉霉正菌与三孢布拉霉负菌的生物量干重均为10g/l。同时接种后，按2vvm的流量向发酵罐中通入干燥压缩空气，然后于220rpm的搅拌转速下进行发酵。发酵过程中发酵体系的生物量干重为50g/l。发酵过程中加入植酸以控制发酵体系的ph值为6.0。发酵40h至100h期间，每间隔10h向发酵罐中补入当时发酵液体积的6vt％的除用于接种以外的继续培养所得三孢布拉霉负菌的上清液。继续发酵至120h左右，放罐。接种和每次补料后，均于剩余的用于继续培养三孢布拉霉正菌和/或三孢布拉霉负菌的种子培养基中补充20vt％的水和5wt％的植物油，于0.5vvm和150rpm条件下继续培养，培养过程中加入适量的脱氧胆酸钠以使剩余的上清液中激素的浓度为1.5mg/l，生物量为4.8g/l。其中，种子培养基含有3wt％葡萄糖、4wt％玉米浆干粉、1.5wt％酵母浸膏、0.1wt％磷酸二氢钾、0.015wt％硫酸镁、0.04wt％谷氨酸钠和4wt％葵花籽油溶液。发酵培养基含有1.2wt％葡萄糖、3wt％磷酸化二淀粉磷酸酯、1.2wt％酵母浸膏、2.2wt％玉米浆干粉、0.9wt％磷酸二氢钾、1.2wt％硫酸镁、2.2wt％葵花籽油以及阻断剂，阻断剂于发酵开始后的30h加入发酵罐的发酵培养基中。实施例4本发明实施例与实施例1的区别在于：调节剂为磷酸。实施例5本发明实施例与实施例1的区别在于：补料所用的上清液同时含有三孢布拉霉正菌的上清液以及三孢布拉霉负菌的上清液。实施例6本发明实施例与实施例1的区别在于：补料所用的上清液为三孢布拉霉正菌的上清液。试验例1重复实施上述实施例1-6，得到足够多的番茄红素。以通过现有普遍加入前提物质类似物β-紫罗兰酮的方法生产而得的番茄红素为对照，对比所得的番茄红素的单位含量及产量，其结果如表1所示。表1番茄红素的单位含量(％)及产量(g/l)由表1可以看出，实施例1-6所得的番茄红素较对照组所得的番茄红素无论是在单位含量还是产量上均更高，说明本发明实施例提供的三孢布拉霉发酵产番茄红素的方法效果较佳。对比实施例1及实施例5-6可以看出，实施例1所得的番茄红素的单位含量及产量均高于实施例5-6，说明实施例1的生产条件最优。实施例5所得的番茄红素的单位含量及产量均高于实施例6，说明补料过程中所用的上清液在补料量相等的情况下，仅含三孢布拉霉负菌的上清液较单独含有三孢布拉霉正菌的上清液或同时含有三孢布拉霉正菌的上清液以及三孢布拉霉负菌的上清液更利于提高番茄红素的单位含量及产量。试验例2以实施例1为例，设置对照组1-4，对照组1与实施例1的区别在于补料于发酵开始后的20-100h进行，对照组2与实施例1的区别在于补料于发酵开始后的40-110h进行，对照组3与实施例1的区别在于补料于发酵开始后的50-110h，对照组4与实施例1的区别在于补料于发酵开始后的30-90h，对比所得的番茄红素的单位含量及产量，其结果如表2所示。表2番茄红素的单位含量(％)及产量(g/l)实施例1对照组1对照组2对照组3对照组4单位含量7.16.46.97.05.9产量3.52.83.13.32.7由表2可以看出，实施例1所得的番茄红素较对照组1-4所得的番茄红素无论是在单位含量还是产量上均更高，一方面说明在补料时长较40-100h更短或更长均更差；另一方面说明在相同的补料时长内，补料时间设置在发酵开始后的40-100h最佳。试验例3以实施例1为例，设置对照组5和6，对照组5与实施例1的区别在于发酵过程中未加入植酸，对照组6与实施例1的区别在于发酵培养基中不含磷酸化二淀粉磷酸酯，对比所得的番茄红素的单位含量及产量，其结果如表3所示。表3番茄红素的单位含量(％)及产量(g/l)实施例1对照组5对照组6单位含量7.15.55.0产量3.52.12.3由表3可以看出，实施例1所得的番茄红素较对照组5和6所得的番茄红素无论是在单位含量还是产量上均更高，说明本发明实施例发酵过程中加入植酸以及发酵培养基中含有磷酸化二淀粉磷酸酯均有利于提高番茄红素的单位含量及产量。试验例4以实施例1为例，设置对照组7和8，对照组7与实施例1的区别在于接种所用的三孢布拉霉正菌及三孢布拉霉负菌的生物量干重均为8g/l，对照组8与实施例1的区别在于发酵过程中发酵体系的生物量干重为55g/l，对比所得的番茄红素的单位含量及产量，其结果如表4所示。表4番茄红素的单位含量(％)及产量(g/l)实施例1对照组7对照组8单位含量7.16.25.1产量3.53.02.7由表4可以看出，实施例1所得的番茄红素较对照组7和8所得的番茄红素无论是在单位含量还是产量上均更高，说明本发明实施例将接种所用的三孢布拉霉正菌及三孢布拉霉负菌的生物量干重控制在均不低于10g/l以及将发酵过程中发酵体系的生物量干重控制在不超过50g/l均有利于提高番茄红素的单位含量及产量。综上所述，本发明实施例提供的三孢布拉霉发酵产番茄红素的方法，此方法简单，成本低廉，通过用含有po43+且不含金属离子及盐的酸性物质控制发酵ph值并提供po43+，避免带入过量的k+，加之配合使用淀粉磷酸酯类物质，以提高番茄红素的产量。由上述三孢布拉霉发酵产番茄红素的方法生产而得的番茄红素产量较高，适于工业化生产。以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。当前第1页12