本发明涉及分子生物学
技术领域：
，具体涉及一种西瓜籽粒大小基因及其snp分子标记和应用。
背景技术：
：西瓜的第一用途是鲜食，果肉是食用部分，籽粒偏大影响食用，消费者喜欢无籽或是籽粒较小的西瓜，因此小粒品种是栽培西瓜的育种目标之一。西瓜的另一用途是籽用，种子是籽用西瓜主要的产品。研究表明，籽用西瓜种子是优质的蛋白质和植物油资源，并含有丰富的维生素d，因此，大粒品种是籽用西瓜的主要育种目标。在大量资源搜集和数据采集的过程中，本发明人发现大粒的通常是野生西瓜、粘籽西瓜和地方品种，其品质往往比较差；小粒多为普通栽培西瓜，品质较好，不同品种间种子籽粒大小差异明显，因此籽粒大小也是西瓜的一个主要分类性状。国内外西瓜籽粒大小的研究主要集中在对控制种子大小、千粒重的基因进行传统的遗传分析。weetman(1937)和尚建立等（2015）的研究表明粒重倾向于单基因控制的质量性状。张杨（2013）和周延峰（2014）的研究均表明粒重都是受一对主基因控制。pool等（1941）发现了l和s这一对控制种子长短的等位基因，kensler等（1958）和shimotsuma等（1963）的研究也证实了这一结果。然而，tanaka等（1995）发现了控制小粒的基因ti，与l和s为非等位基因。zhang等（1996）的研究表明tomato西瓜种子由单隐性基因ts控制。虽然采用的试验材料与方法不同，所得结论也不完全一致，但这些研究有一些共同点，都认为种子大小属于质量性状，小粒种子显性于大粒种子，且由单基因控制。另一方面，翟文强等（1995）以粒重具有显著差异的两个西瓜高代自交系为亲本研究杂交后代的粒重，西瓜种子千粒重表现为数量性状遗传的特点。prothro等（2012）利用重组自交系和f2群体研究籽粒大小，表明粒重是典型的数量性状。传统的遗传学采用数理统计的方法，只能将控制质量/数量性状的一个或多个基因作为一个整体进行研究，不能确定单个质量/数量性状基因在染色体上位置及效应(徐云碧,1992)。随着分子标记技术发展和分子数量遗传学的完善，近些年来，一批qtl定位的工作已经进行（范敏等，2000；hawkins等，2001；易克，2002；prothro等，2012；meru和mcgregor，2013），以期揭示西瓜籽粒大小的遗传基础，但是这些研究所定位的区间较大，候选基因多且难以筛选，至今没有一个西瓜籽粒大小基因得以确定。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是提供一种西瓜籽粒大小基因及其snp分子标记和应用，以揭示西瓜籽粒大小的遗传基础，确定西瓜籽粒大小的基因。为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：筛选出一种西瓜籽粒大小基因，命名为clamdtk，其核苷酸序列如seqidno.1所示，其编码的蛋白质序列如seqidno.2所示。设计一种与所述西瓜籽粒大小基因具有90%以上的同源性，且编码相同功能蛋白质的基因。明确一种所述西瓜籽粒大小基因共分离的snp位点，位于西瓜基因组6号染色体5418365bp处，其碱基由g突变为a。设计一种所述snp位点的dcaps分子标记，其上游引物命名为dcaps9_s6f，其核苷酸序列如seqidno.3所示；其下游引物命名为dcaps9_s6r，其核苷酸序列如seqidno.4所示，该引物酶切反应所用限制性内切酶为tagi。设计一种西瓜籽粒大小基因型的鉴定方法，包括以下步骤：a.dna提取：利用ctab法提取西瓜植株总dna；b.pcr扩增：反应体系为：100ng/μl西瓜植株总dna1μl、dcaps9_s6f1μl、dcaps9_s6r1μl、2×powertaqpcrmastermix12.5μl、ddh2o9.5μl；反应程序为：94℃5min，35个循环的94℃20s、55℃1min、72℃30s、72℃5min；c.酶切反应体系和程序：反应体系为：pcr产物5μl，tagi限制性内切酶0.5μl，10xbuffer1.5μl，ddh2o8μl。反应程序为：65℃恒温处理10小时。d.电泳图谱分析：对所述酶切产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳、显影、染色和带型判读，找到目标条带，根据所述扩增产物的条带大小及位置关系确定所属基因型，142bp的条带代表大籽粒基因型，113bp的条带代表小籽粒基因型。将所述西瓜籽粒大小基因或所述基因在西瓜籽粒大小基因克隆或表达中的应用。将所述基因、所述snp位点或所述的dcaps分子标记在西瓜籽粒大小分子标记辅助筛选和育种中的应用。上述应用包括如下步骤：（1）对f2群体每个株系利用所述分子标记进行基因型鉴定；（2）利用上述（1）中f2群体的基因型鉴定结果，根据分子标记的基因型对不同单株进行分类，并利用籽粒表型数据进行鉴定和验证。与现有技术相比，本发明的有益技术效果在于：1.本发明利用正向遗传学的方法首次公开了西瓜多药抗性蛋白基因clamdtk在调控种子大小的功能中的应用。2.本发明设计了一个西瓜籽粒大小基因共分离的分子标记，应用该标记进行分子标记辅助选择育种，能以更快速、准确的进行西瓜籽粒大小的定向遗传改良。3.本发明在西瓜籽粒大小育种中进行了应用，可为鉴定西瓜籽粒大小提供新手段，进而加速西瓜籽粒大小性状的改良进程，提高育种的准确性和选择效率。附图说明图1为6个差异表达基因rt-pcr验证情况；图2为clamdtk在ril_l和ril_s中不同发育时期的基因表达量；图3为利用籽粒大小标记dcaps9_s6的引物在部分f2群体基因组dna中的扩增结果图；其中，方框中条带为父母本的目的条带，名称皆为品种名称/代号的后两/三位。具体实施方式下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。实施例一：西瓜籽粒大小基因的确定及分子标记的开发1.西瓜籽粒大小主效qtl的精细定位利用西瓜大粒母本“zxg01478”和小粒父本“14cb11”杂交获得f2群体构建的高密度的遗传连锁图谱，对父母本、f1和f2群体的93个单瓜进行籽粒大小的直观鉴定；结合遗传连锁图谱和f2群体表型鉴定结果，利用rqtl-im-binary方法进行qtl初定位，鉴定到籽粒大小的主效qtl，其lod峰值为46.94，解释26.16%的表型变异，置信区间（2-lod）为3.68～31.67cm。2.籽粒大小相关的比较转录组学分析（1）利用西瓜大粒母本“zxg01478”和小粒父本“14cb11”构建重组自交系（rils），筛选其中一份大粒（ril_l）和一份小粒（ril_s）花后7、8、9、10、11、12和13天（daf）的种子进行转录组测序。14个样品转录组测序的基本信息如表1所示。q30都大于90%，且gc含量与西瓜参考基因组基本一致。表1转录组测序的基本信息。（2）分别利用不同发育时期的ril_l和ril_s进行差异表达分析，并随机挑选6个差异表达基因利用rt-pcr进行验证。结果如图1所示，rt-pcr很好的验证了转录组分析的结果，说明转录组测序及分析的结果是可靠的。（3）在已经确定的qtl区域，仅有一基因，clamdtk，编码多药抗性蛋白，在7个不同发育时期都显著的差异表达，其他基因的表达差异都不显著。且clamdtk在ril_l的不同发育时期基本不表达，而在ril_s中随着授粉时间的延长其基因表达量是逐渐降低的趋势（如图2所示）。由此确定控制主效qtl的籽粒大小基因为clamdtk，其核苷酸序列如seqidno.1所示，其编码的蛋白质序列如seqidno.2所示。3.利用“zxg01478”和“14cb11”的重测序挖掘全基因组水平的snp位点，在基因clamdtk附近的发现一个snp位点，该位点位于西瓜基因组6号染色体碱基位置为5418365，碱基变化为g突变为a。4.根据上述snp位点开发一个dcaps分子标记，上游引物命名为dcaps9_s6f，其下游引物命名为dcaps9_s6r，该引物对的核苷酸序列为：dcaps9_s6f：ctaaaaatacaggattaaaattgtacattc；dcaps9_s6r：tgtaaaacacatatataacg。采用的限制性内切酶为tagi。实施例二：西瓜f2群体分子标记分析1.利用ctab法提取西瓜f2群体叶片总dna，具体步骤如下：（1）取1g新鲜叶片放入研钵，加入液氮研成粉末状，随即转入加有1mlctab抽取液的离心管中，使二者充分混匀，然后置于65℃恒温水浴60min，其间颠倒混合2～3次；（2）从水浴锅取出后，8000rpm离心1min；（3）取上清液置于另一离心管中，加等体积的氯仿：异戊醇，轻轻颠倒使其充分混匀；其中氯仿和异戊醇体积比为24：1；（4）10000rpm离心5min，取上清液；（5）加入0.7倍体积的预冷异丙醇混匀后置于-20℃冷冻不超过30min让dna析出；取出后10000rpm离心5min，留沉淀弃上清液；（6）用无水乙醇清洗沉淀数次，倒掉浸泡液，打开离心管盖子晾干；（7）加入200μl的蒸馏水溶解dna；用紫外分光光度计测定dna的浓度，于-20℃冰箱中保存备用。2.pcr反应体系和程序反应体系为：西瓜叶片总dna(100ng/μl)1μl、forwardprimer(10μmol/l)1μl、reverseprimer(10μmol/l)1μl、2×powertaqpcrmastermix12.5μl、ddh2o9.5μl。pcr反应程序为：94℃5分钟，35个循环的94℃20秒钟、55℃1分钟、72℃30秒、72℃5分钟。3.酶切反应体系和程序反应体系为：pcr产物5μl，tagi限制性内切酶0.5μl，10×buffer1.5μl，ddh2o8μl。65℃恒温处理10小时。4.对pcr产物进行8%聚丙烯酰胺凝胶电泳、显影、染色和带型判读。（1）试剂配制：a．5×tbe：取tris-base53.9克、edta3.72克、硼酸27.5克，用蒸馏水定容至1升。b.40%聚丙烯酰胺溶液：取聚丙烯酰胺193.34克、甲叉双丙烯酰胺6.66克，用蒸馏水定容至500毫升。c.8%聚丙烯酰胺凝胶：40%聚丙烯酰胺溶液10毫升，5×tbe5毫升，10%过硫酸铵（aps）200微升，四甲基乙二胺（temed）80微升，蒸馏水22毫升。d.银染液：取硝酸银1克、冰醋酸5毫升、无水乙醇50毫升，用去离子水定容至500毫升。e.显影液：取氢氧化钠15克、甲醛（37%）2.5毫升，用去离子水定容至500毫升。（2）凝胶板准备：玻璃板用蒸馏水洗净、晾干后，用浸泡过无水乙醇的脱脂棉球擦拭，晾干。将凹板和平板叠合紧密后放入制胶器中压紧并扣好其两边的夹子。在洗瓶内配置8%聚丙烯酰胺凝胶溶液，混匀后快速注入两板中间的缝隙内，注满后插入有齿的梳子；若此时液面有所下降，可用移液器吸取未凝固的溶液来补充。等待溶液充分凝固。（3）电泳：将制胶器支架从底座上取下，直接放入配套的电泳槽中，在电泳槽底部及支架上两块玻璃板中间倒入适量的1×tbe缓冲液。在pcr产物中加入0.2倍体积的6×dnaloadingbuffer，混匀后取0.8微升加入点样孔内，260伏电泳35分钟。（4）染色和显影：电泳完成后，从电泳槽中取出玻璃板，撬去凹板，凝胶会贴附于平板上，凝胶面向上将平板放入银染液中，置于脱色摇床上轻摇15分钟，凝胶会自动脱落下来；银染完毕，将凝胶取出放入去离子水中清洗10秒；清洗完毕后将凝胶转入显影液中，轻摇摇床，待条带清晰后取出凝胶，放置在阅片器上肉眼观察条带的位置差异，并拍照保存。（5）带型判读：将显影后自然干燥好的玻璃板置于阅片台上，肉眼观察两亲本条带的位置差异。利用dcaps9_s6分子标记在f2群体中的基因型鉴定的结果如图3所示，名称皆为品种名称/代号的后两或三位，父母本方框中条带为目的条带，母本目的片段大小为142bp，父本目的片段大小为113bp。实施例三：f2群体基因型分析经实施例二进行dcaps9_s6分子标记在由“zxg01478”和“14cb11”构建f2群体中的基因型鉴定后，检查dcaps9_s6分子标记的两种基因型在93个f2群体中的分布情况，发现dcaps9_s6的基因型与籽粒大小表型完全共分离。结果如表2所示，其中a代表母本带型，b代表父本带型，h代表杂合基因型。分子标记dcaps9_s6的基因型在69份小粒（千粒重<37g）株系中24份为b（113bp），44份为h。而在24份大粒株系中全部为a（142bp）。分子标记indel14_s6的基因型为a的24个株系全部是大粒株系，而在基因型为b的24个株系都是小粒株系。其基因型鉴定的准确率为100%。表2dcaps9_s6在f2群体中的鉴定和验证品种名称/代号dcaps9_s6千粒重（g）分类母本a93.5大粒父本b20.8小粒f1h30.1小粒13qb135-001h30.3小粒13qb135-002h26.3小粒13qb135-003h29小粒13qb135-004h29.2小粒13qb135-005a110.6大粒13qb135-006a141.7大粒13qb135-007a86.8大粒13qb135-008b16.8小粒13qb135-009h32小粒13qb135-010h32.9小粒13qb135-011h28.8小粒13qb135-013a90.4大粒13qb135-014a101.2大粒13qb135-015h29小粒13qb135-016b19.5小粒13qb135-017h24.8小粒13qb135-018h25.4小粒13qb135-019b16.6小粒13qb135-020h27.4小粒13qb135-021h24.5小粒13qb135-022h27.8小粒13qb135-023b18.2小粒13qb135-024a116大粒13qb135-025b18.8小粒13qb135-026a95.6大粒13qb135-027b23.5小粒13qb135-028h31.6小粒13qb135-029h20小粒13qb135-030a113.2大粒13qb135-031b20.3小粒13qb135-032h28.9小粒13qb135-033h33.3小粒13qb135-034b23小粒13qb135-035b19.7小粒13qb135-036h28.8小粒13qb135-037h32.2小粒13qb135-038h25.4小粒13qb135-040h21.5小粒13qb135-041a97.9大粒13qb135-042h26.8小粒13qb135-043a118.9大粒13qb135-044h29.3小粒13qb135-045b20.8小粒13qb135-046b20.2小粒13qb135-047a90.3大粒13qb135-048h27小粒13qb135-049a99.3大粒13qb135-050h25.5小粒13qb135-051b23.1小粒13qb135-052b22.4小粒13qb135-053b17.8小粒13qb135-054h31.8小粒13qb135-055h29.9小粒13qb135-056b18.8小粒13qb135-057b20.9小粒13qb135-058h27.1小粒13qb135-059h30.3小粒13qb135-060h30.4小粒13qb135-061h31.2小粒13qb135-062h27.6小粒13qb135-064a93.7大粒13qb135-066h25.8小粒13qb135-067b20.4小粒13qb135-068b18.6小粒13qb135-069a111.6大粒13qb135-071a129.4大粒13qb135-075b23.5小粒13qb135-076b17小粒13qb135-078h27.4小粒13qb135-079h27.5小粒13qb135-080h28.9小粒13qb135-081a123.6大粒13qb135-083h25小粒13qb135-086h31.2小粒13qb135-087b21.8小粒13qb135-090h28.6小粒13qb135-094h33.6小粒13qb135-095a98.7大粒13qb135-097a100.6大粒13qb135-099h24小粒13qb135-100a122.8大粒13qb135-101h26.9小粒13qb135-103a92.6大粒13qb135-104a108.8大粒13qb135-105b18.6小粒13qb135-106h31.1小粒13qb135-107b23.7小粒13qb135-109b18.3小粒13qb135-111h35.5小粒13qb135-113a100大粒13qb135-115b20.4小粒13qb135-118a105.4大粒13qb135-122a97.8大粒上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属
技术领域：
的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。sequencelisting<110>中国农业科学院郑州果树研究所<120>西瓜籽粒大小基因及其snp分子标记和应用<130>2018<160>4<170>patentinversion3.2<210>1<211>1533<212>dna<213>watermelon<400>1atgcttgcagaagagaagtcccaaaagtacccgacaatgccagaggtccttgaagagctg60aagcaaatggctgacattggtttccctgttttggcaatgggcttagtgggttatctcaaa120aatatgatctctgttatttgcatgggcagacttggaactcttcatctcgctgctggttct180ttggccattggtttcactaatatcactggctattcagttctttcaggcttggctatgggc240atggagccactctgtagtcaagcttttggttctcataattcttccattgcctttctcact300ttgcaaagaacggttcttattttgctttttgctactattcccattgggtttctttggcta360aatttggagcctcttatgttggttctacatcagaacccagaaatcactagaattgcaact420gtttattgccgttttgcagttcctgatttggtattgaatagccttttacatcctttgcgt480atttaccttagaaacaaaggcaccacgtggattgtcatgtggtgcaatttgttggctatt540ctcctacatgttcccatcgctattttcttgacttttcctcttgatcttggaatccgtggg600attgctatctccaattttatagctaatttcaatacccttttcttccttttactctatttg660atattctgtactcgtactactttttcctcctcttcttctaaggaggctaatctgtttgtg720ccactgaaaagcagcaccgtggttagcgccgctacggttggggaggaatggggaatgctg780atcaagttggccattcctagctgtcttggagtttgcttggaatggtggtggtatgagttc840atgaccattctcactggctacctttataacccgcggattgcactcgccacttcaggcatt900gtaatccaaacaacttcactaatgtacacattaccaatggctctcagtgccgctgtctcg960actagagttggtcacgagctcggcgctggtcggcccaaaaaggctcgactagcggcggtg1020gtggcgataggattggccttggtgggctcattgatgggactctcactaaccaccattggc1080agaaggacatggggaagagttttcacaaaagatgaggaaattctagagctgacaatggcg1140gttctgcccataatcgggctgtgcgagctagcaaattgcccgcaaacaacaagctgcggg1200attctgaggggaagtgcaaggccggggatcggagcaggaataaacttctgttcattttac1260atggtgggggcgccgatggccgtcttgtcggcgtttgtttggaaatctgggttcgtgggt1320ctttgctacgggcttttggcagcccagatggcatgtgtggtctcaatcttaatagtggtc1380ttcaacacagattgggaaatggagtcaatcaaagccgaagacttagtaggcaaaaacacc1440aataacgtctttgcacatgcaatccacacagccatacgtgaggaaggtcctgaattcctc1500aaagaatcacctgttgaaagacaagacacataa1533<210>2<211>510<212>prt<213>watermelon<400>2metleualagluglulysserglnlystyrprothrmetprogluval151015leuglugluleulysglnmetalaaspileglypheprovalleuala202530metglyleuvalglytyrleulysasnmetileservalilecysmet354045glyargleuglythrleuhisleualaalaglyserleualailegly505560phethrasnilethrglytyrservalleuserglyleualametgly65707580metgluproleucysserglnalapheglyserhisasnserserile859095alapheleuthrleuglnargthrvalleuileleuleuphealathr100105110ileproileglypheleutrpleuasnleugluproleumetleuval115120125leuhisglnasnprogluilethrargilealathrvaltyrcysarg130135140phealavalproaspleuvalleuasnserleuleuhisproleuarg145150155160iletyrleuargasnlysglythrthrtrpilevalmettrpcysasn165170175leuleualaileleuleuhisvalproilealailepheleuthrphe180185190proleuaspleuglyileargglyilealaileserasnpheileala195200205asnpheasnthrleuphepheleuleuleutyrleuilephecysthr210215220argthrthrpheserserserserserlysglualaasnleupheval225230235240proleulysserserthrvalvalseralaalathrvalglygluglu245250255trpglymetleuilelysleualaileprosercysleuglyvalcys260265270leuglutrptrptrptyrgluphemetthrileleuthrglytyrleu275280285tyrasnproargilealaleualathrserglyilevalileglnthr290295300thrserleumettyrthrleuprometalaleuseralaalavalser305310315320thrargvalglyhisgluleuglyalaglyargprolyslysalaarg325330335leualaalavalvalalaileglyleualaleuvalglyserleumet340345350glyleuserleuthrthrileglyargargthrtrpglyargvalphe355360365thrlysaspglugluileleugluleuthrmetalavalleuproile370375380ileglyleucysgluleualaasncysproglnthrthrsercysgly385390395400ileleuargglyseralaargproglyileglyalaglyileasnphe405410415cysserphetyrmetvalglyalaprometalavalleuseralaphe420425430valtrplysserglyphevalglyleucystyrglyleuleualaala435440445glnmetalacysvalvalserileleuilevalvalpheasnthrasp450455460trpglumetgluserilelysalagluaspleuvalglylysasnthr465470475480asnasnvalphealahisalailehisthralailearggluglugly485490495proglupheleulysgluserprovalgluargglnaspthr500505510<210>3<211>30<212>dna<213>人工合成<400>3ctaaaaatacaggattaaaattgtacattc30<210>4<211>20<212>dna<213>人工合成<400>4tgtaaaacacatatataacg20当前第1页12