本发明涉及具有呈味效果的肽及其制备方法，具体涉及甜味肽γ-l-glu-d-val及其制备方法与应用。
背景技术：
：呈味肽是重要的滋味物质和风味前体物质之一，按其呈味特性的不同可分为甜味肽、苦味肽、酸味肽、咸味肽和鲜味肽。陆续从奶酪、酒、肉等多种食物中分离鉴定得到确定序列呈苦、鲜、酸、咸、甜等味的呈味肽。自从发现l-天冬氨酞-l-苯丙氨酸甲酯的甜味以来,已有大量的天冬氨酞二肽、三肽、四肽和五肽类似物被合成以用于扩大甜味肽的种类。γ-谷氨酰肽广泛存在于多种动植物和发酵食品中，是一种安全天然、安全的食品成分。其中最为典型的是谷胱甘肽（γ-glu-cys-gly，gsh）。gsh已经是总所周知的具有多种生理功能的小分子肽，但对于它的呈味特性提及甚少。事实上，目前对于此类γ-谷氨酰肽的研究主要主要针对的是l型氨基酸，对于d型氨基酸的研究甚少。迄今为止，尚未见γ-l-glu-d-val具有天然的类似蔗糖的甜味的报道。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术存在的上述不足，提供甜味肽γ-l-glu-d-val及其制备方法与应用。本发明的目的通过以下技术方案实现。一种甜味肽γ-l-glu-d-val，其氨基酸序列为γ-l-glu-d-val。制备所述甜味肽的方法是，将谷氨酰胺与游离缬氨酸按摩尔比为1-2:1，溶于水中得溶液，调节反应ph为8.0-10.0，添加占溶液质量0.02-1%（w/w）的谷氨酰胺酶或γ-谷氨酰胺转肽酶，在25-50℃反应3-12小时，后用盐酸回调ph至6~7之间，灭酶，得到富含二肽γ-l-glu-d-val的反应液。进一步地，溶液中谷氨酰胺和游离缬氨酸的浓度在400-1000mmol/l。进一步优化地，所述方法利用高相液相色谱分离：采用xselecthsst35μm4.6×250mm分析柱，流动相a液为0.1％（v/v）甲酸-水溶液；流动相b液为0.1％(v/v)甲酸-乙腈溶液，柱温为40℃，流速为1ml/min，反应液的进样量10μl，采用高效液相色谱对富含二肽γ-l-glu-d-val的反应液进行梯度洗脱，出峰时间为4.267min的峰即为γ-l-glu-d-val。本发明提供的一种甜味肽γ-l-glu-d-val的应用，具体是在食品中添加500mg/kg以上的γ-l-glu-d-val，以增加或提高甜味。进一步优化地，所述食品中含有1500mg/kg以上的γ-l-glu-d-val。进一步地，溶液中谷氨酰胺和游离缬氨酸的浓度在400-1000mmol/l。进一步地，本发明关键参数还有：所述盐酸浓度为4mol/l盐酸，所述灭酶为90℃灭酶10min，只有在这样的参数下才能取得说明书实施例所述的效果。本发明与现有技术相比，具有如下优点：1）本发明首次公开了γ-l-glu-d-val具有甜味特性，这种γ-谷氨酰胺肽（γ-l-glu-d-val）具有良好的稳定性，具有天然的类似蔗糖的甜味。2）首次公开了利用谷氨酰胺酶或γ-谷氨酰胺转肽酶催化制备γ-l-glu-d-val。附图说明图1为缬氨酸与谷氨酰胺混合物添加酶否呈味特性的差异对比图；图2为反应后混合物的液相色谱图；图3为γ-l-glu-d-val的呈味特性分析图；图4为γ-l-glu-d-val的二级质谱图；图5a~图5b分别为二肽对黑咖啡和红茶的呈味改善效果对比图。具体实施方式以下结合附图和实例对本发明的具体是实施作进一步举例，但本发明的实施和保护不限于此。实施例1将300mm谷氨酰胺与300mm缬氨酸溶于100g水中，用10mol/l的氢氧化钠溶液调节溶液的ph值至10.0，加入0.4g谷氨酰胺酶（日本天野株式会社，活力为100gtu/g），在37℃分别反应12h，后用4mol/l盐酸回调ph至7.0后，90℃灭酶10min，对产物呈味特性进行感官评价，其反应前后呈味特性如图1。由图1可见，反应结束后，反应液的甜味、鲜味都显著提高了。说明反应液物质发生了改变，产生了具有甜味的物质。为了进一步确定物质的改变，将反应液用于高效液相色谱法确定产物。hplc液相对反应产物进行定量分析：分析柱：xselecthsst35μm4.6x250mm；流动相：a液：0.1％（v/v）甲酸-水溶液；b液：0.1％(v/v)甲酸-乙腈溶液；柱温：40℃，流速：1ml/min。进样量10μl。其液相色谱图见图4。流动相进行梯度变化如表1所示。表1time/min05101520a/%9085209090图2中,出峰时间为4.267对应的峰4为γ-l-glu-d-val，对峰4进行收集，冷冻干燥得到γ-l-glu-d-val，并进行感官评价。称取0.01gγ-l-glu-d-val，以及0.5g食盐和0.3g味精，溶解于100g水中，并和空白样（0.5g食盐和0.3g味精溶于100g水中）进行感官评价。感官评价实验由30-41岁有感官评价经验的7位男性和9位女性组成，感官评价结果见图3。由图3可见，添加0.01gγ-l-glu-d-val的样品与对照相比，显著地赋予空白溶液甜味特性。利用uplc-ms/ms对产物进行结构分析：包括：anagilent1290seriesuplcsystem(agilenttechnologies)用于分离各γ-glu-peptides,带有anelec-trosprayionization(esi)的质谱系统（q-tofms/ms，brukerdaltonics)进行定性分析。色谱柱为：agilentzorbaxrrhdsb-c18(2.1x50mm,1.8μm)。进样量为5μl。液相条件为：溶液a为0.1%甲酸-水溶液，和溶液b为0.1%甲酸-乙腈溶液，梯度洗脱程序为：0–10%b,0-5.0min;10-15%b,5.0-10.0min;然后100%b,10.0-12.0min。ms条件：ionization(离子化)：正离子模式；dryinggas(干燥气体)：350℃下10l/min；nebulizer(喷雾器压力)：25psig；fragmentor(毛细管电压)：30v。采用uplc-ms/ms对峰6，其检测结果如图4。由图4可知，图中碎片离子主要为谷氨酸和缬氨酸残基。利用从头测序方法确定目标产物一级结构为γ-l-glu-d-val。实施例2将0.01g纯化过的γ-l-glu-d-val加入含有适量无糖奶粉的黑咖啡溶液或者红茶中，对产品进行感官评价。感官评价实验由30-41岁有感官评价经验的7位男性和9位女性组成，感官评价结果见图5a和图5b。由图5a可知，将此甜味肽添加至含有奶粉的黑咖啡中，对照空白组而言，溶液的甜味明显增加，苦味、酸味明显降低，说明了此甜味肽产生了类似于蔗糖等咖啡伴侣的作用，赋予了黑咖啡甜味。如图5b，对于红茶而言，添加甜味肽后出现出现了类似奶茶的口感，甜味、丝滑感增加。由此两种应用可以判断，此甜味肽可用于取代蔗糖。实施例3将解淀粉芽孢杆菌（bacillusamyloliquefaciens）swjs22（中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.8425）以1%的接种量接种于发酵培养基（发酵培养基的组成为：4%豆粕、2%麸皮、2%玉米粉）中，37~39℃发酵培养30h。将发酵液于4℃，10000r/min条件下高速离心10min，过滤得上清液，即谷氨酰胺酶粗酶液。将600mm谷氨酰胺和300mm缬氨酸溶于100g水中，分别调节溶液的ph值至9.0，加入1g粗酶液，在40℃分别反应12h后，用4mol/l盐酸回调ph至7.0后，90℃灭酶10min，得到γ-l-glu-d-val的反应液。采用xselecthsst35μm4.6x250mm分析柱，流动相a液为0.1％（v/v）甲酸-水溶液；流动相b液为0.1％(v/v)甲酸-乙腈溶液，柱温为40℃，流速为1ml/min，反应液的进样量10μl，采用高效液相色谱对反应液进行梯度洗脱，第四个峰即为甜味肽γ-l-glu-d-val。实施例4将枯草芽胞杆菌atcc6633以1%的接种量接种于发酵培养基（发酵培养基的组成为：4%豆粕、2%麸皮、2%玉米粉）中，37~39℃发酵培养48h。将发酵液于4℃，10000r/min条件下高速离心10min，过滤得上清液，即γ-谷氨酰胺转肽酶粗酶液。将600mm谷氨酰胺和400mm缬氨酸溶于100g水中，分别调节溶液的ph值至8.0，加入1gγ-谷氨酰胺转肽酶粗酶液，在40℃分别反应6h后，用4mol/l盐酸回调ph至7.0后，90℃灭酶10min，得到含有γ-l-glu-d-val的反应液。采用xselecthsst35μm4.6x250mm分析柱，流动相a液为0.1％（v/v）甲酸-水溶液；流动相b液为0.1％(v/v)甲酸-乙腈溶液，柱温为40℃，流速为1ml/min，反应液的进样量10μl，采用高效液相色谱对反应液进行梯度洗脱，第四个峰即为γ-l-glu-d-val。当前第1页12