本发明属于基因工程产品制备领域，具体涉及一种制备猪源长效干扰素-λ3（abd-ifnλ3）蛋白的方法和应用。
背景技术：
：
干扰素（interferon，ifn）是一种广谱抗病毒剂，包括i型干扰素（ifnα、ifnβ）、ii型干扰素（ifnγ等）、iii型干扰素（ifnλs，包括ifnλ1、ifnλ2、ifnλ3），其并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，同时还可增强自然杀伤细胞（nk细胞）、巨噬细胞和t淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。目前，国内外学者iii型ifn生物学功能和抗病毒作用已经进行了深入的研究[3-5]，结果表明，相比于i型和ii型干扰素，iii型干扰素ifnλ3可以有效的缓解仔猪腹泻的症状，降低病猪的死亡率。前期研究表明，原核表达iii型猪干扰素均为包涵体形式，需要通过包涵体变性、复性的方法来制备ifnλ3，操作复杂且成本较高[4,6]。采用酵母分泌表达的方式可获得可溶的，表达量的ifnλ3蛋白，但是干扰素半衰期短容易降解，目前已有研究的长效元件abd能有效提高干扰素半衰期，延长干扰素作用时间[2]。
由于干扰素表达过程中易发生断裂，因此用不同连接linker将长效元件abd与ifnλ3连接，能获得不影响表达量且蛋白断裂明显较少的表达菌株。
参考文献：
[1]albuminfusionofinterleukin-28b:productionandcharacterizationofitsbiologicalactivitiesandproteinstability.（plosone，2013）
[2]anti-serumalbumindomainantibodiesinthedevelopmentofhighlypotent,efficaciousandlong-actinginterferon.（proteinengineering,design&selection，2010）
[3]ifn-lambdapreferablyinhibitspedvinfectionofporcineintestinal
epithelialcellscomparedwithifn-alpha.（antiviralresearch，2017）
[4]猪ⅲ型干扰素ifnλ1的克隆、表达和抗病毒活性研究。(华中农业大学硕士学位论文，2017）
[5]shortcommunication:antiviralactivityofporcineifn-λ3againstporcineepidemicdiarrheavirusinvitro.（virusgenes，2016）
[6]长效干扰素研究进展。(中国生物工程杂志,2010）
技术实现要素：
：
为解决现有技术中干扰素表达存在的技术问题，本发明旨在提供一种毕赤酵母表达长效猪源干扰素的方法。
为解决以上技术问题，本发明采用如下技术手段：
一种在毕赤酵母gs115中表达猪源长效ifnλ3的方法，具体步骤如下：1）以合成的猪λ3干扰素基因及长效元件abd为模板，分别用引物λ3-gs-f，λ3-r，abd-f，abd-gs-r扩增含gslinker的目的片段；2）利用引物abd-f和λ3-r通过pcr技术扩增全长含gslinker的猪源abd-gs-ifnλ3基因全长，上游引物abd-f:agagaggctgaagctgaattcaccactatcgacgagtggttgctgaaa（seqidno:3）；下游引物λ3-r:tgtctaaggctacaaactcaatgatgatgatgatgatgaacacacaagtcacca（seqidno:2）；
3）将猪源abd-ifnλ3基因用t5克隆法克隆到酵母ppiczαa载体，获得重组载体ppiczαa-abd-gs-ifnλ3，并转化毕赤酵母gs115，筛选重组酵母表达菌；
4）对3）中阳性克隆子进行诱导表达，筛选干扰素高表达菌株；
5）对4）高表达菌株进行诱导表达并纯化，验证不同linker对长效干扰素表达的影响，进一步制备干扰素样品及活性检测；
6）对5）表达样品，在mdbk及vero细胞水平上评价干扰素活力；
7）对5）表达样品采用细胞病变抑制法检测abd-gs-ifnλ3在猪体内的半衰期；其中λ3-gs-f:ggtggtggaggttccggtggtggaggttccgttccagttccagaagctttgaga（seqidno:1）；λ3-r:tgtctaaggctacaaactcaatgatgatgatgatgatgaacacacaagtcacca（seqidno:2）；abd-f:agagaggctgaagctgaattcaccactatcgacgagtggttgctgaaa（seqidno:3）；abd-gs-r:ccggaacctccaccaccagccttcaatatctcgtcct（seqidno:4）。
一种重组酵母菌株pichiapastorisgs115/ppiczαa-abd-gs-ifnλ3的菌株保藏号为：cctccno.m2018195，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国湖北省武汉市武汉大学，保藏日期为：2018年4月11日。所述重组酵母菌株能够用于制备abd-gs-ifnλ3。
本发明还请求保护abd-gs-ifnλ3在制备药物中的应用，所述药物用于治疗或预防病毒感染。所述药物为兽药，用于畜禽。优选的，所述药物用于治疗猪流行性腹泻病毒引起的疾病。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：1）通过密码子优化实现abd-ifnλ3的高效可溶表达。
2）abd融合提高ifnλ3在猪体内的半衰期，有望提高ifnλ3的抗pedv治疗效果。
3）通过linker选择在不影响产量情况下，能减少蛋白断裂。
附图说明
图1：构建含有abd-ifnλ3基因的重组克隆载体的流程图。
图2：不同连接linker长效干扰素表达检测为构建含有不同linker的abd-ifnλ3的sds-page蛋白表达电泳图，其中m：蛋白markers；+：阳性对照；-：阴性对照；1-3：gs连接linker三个阳性克隆子表达上清；4-6：hl连接linker三个阳性克隆子表达上清；7-9：rl连接linker三个阳性克隆子表达上清。
图3：不同连接linker长效干扰素werternbolt表达检测是不同linker的abd-ifnλ3的western-blot图，其中m：蛋白markers；+：阳性对照；-：阴性对照；1-3：gs连接linker三个阳性克隆子表达上清；4-6：hl连接linker三个阳性克隆子表达上清；7-9：rl连接linker三个阳性克隆子表达上清。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限此。实施例1
猪源ifnλ3的制备方法，依次进行以下步骤：
实施例1：构建克隆载体
1）以合成的猪λ3干扰素基因为模板，用2×primestart扩增，分别用λ3-gs-f:ggtggtggaggttccggtggtggaggttccgttccagttccagaagctttgaga（seqidno:1）、
λ3-hl-f：gctgctgctaaggaagctgctgctaaggctgttccagttccagaagcttt（seqidno:5）、
λ3-rl-f：tgaaggctggtccaggtccagttccagttccagaagcttt（seqidno:6）分别和λ3-r:tgtctaaggctacaaactcaatgatgatgatgatgatgaacacacaagtcacca（seqidno:2）进行扩增，反应条件：98℃，5分钟；98℃10秒；56℃，20秒；72℃20秒，25个循环；最后72℃延伸5分钟；
2）以合成的长效元件abd基因为模板，用2×primestart扩增，分别用abd-gs-r:ccggaacctccaccaccagccttcaatatctcgtcct（seqidno:4）、abd-hl-r：gcagcttccttagcagcagcttcagcagccttcaatatctcgtcct（seqidno:7）、
abd-rl-r：tggacctggaccagccttcaatatctcgtcct（seqidno:8）分别和abd-f:5'agagaggctgaagctgaattcaccactatcgacgagtggttgctgaaa3'（seqidno:3）进行扩增，反应条件：98℃，5分钟；98℃10秒；56℃，20秒；72℃20秒，25个循环；最后72℃延伸5分钟；
3）利用引物abd-f和λ3-r通过pcr技术扩增全长含不同linker的猪源abd-ifnλ3基因全长，
上游引物abd-f:5'agagaggctgaagctgaattcaccactatcgacgagtggttgctgaaa3'（seqidno:3）；
下游引物λ3-r:5'tgtctaaggctacaaactcaatgatgatgatgatgatgaacacacaagtcacca3'（seqidno:2）；
4）通过t5克隆将猪源abd-ifnλ3基因克隆入ppiczαa载体、进行测序鉴定，获得正确的重组载体ppiczαa-abd-gs-ifnλ3，ppiczαa-abd-hl-ifnλ3，ppiczαa-abd-rl-ifnλ3。
2．构建表达菌株1)取87μl重组质粒，加入10μl10×cutsmartbuffer，3μlpmei酶，37℃酶切3h，反应结束后以1.0%琼脂糖凝胶于150v电压进行电泳分析。若质粒完全酶切，则用胶回收纯化试剂盒回收重组质粒线性化产物。经1.0%琼脂凝胶电泳进行回收确认后，利用分光光度计在波长260nm测定其od值，换算回收dna浓度；
2)先将线性化质粒、电转杯、感受态细胞冰浴，20μl线性化质粒加入80μl感受态细胞后混匀后冰浴5分钟，随后转入1.0mm电转杯中电转，电转电压为1.5v，电转后立即加入150μl山梨醇，随后转入已加入500μlypd和500μl山梨醇的培养基中，28℃静止培养40分钟，4000rpm离心1分钟，保留40μl上清其余弃掉，用40μl上清将沉淀混匀，将混均匀的菌体涂布含100μg/mlzeocin抗性的ypd平板，28℃静止培养72h；3)挑选上述ypd平板上单菌落，用无菌牙签蘸取少量菌落，置pcr扩增体系中，扩增体系2×primestart5μl，上游引物λ3-f0.4μl，下游引物λ3-r0.4μl，模板1μl，灭菌ddh2o3.2μl。pcr反应参数：98℃预变性5分钟；98℃变性10秒，56℃退火20秒和72℃延伸20秒，共25个循环；72℃延伸10分钟。分析结果与预期大小相符则为阳性克隆；4)猪源ifnλ3核苷酸序列如下（seqidno:9）：gttccagttccagaagctttgagagctttgccaggtgctagaggttgtcacttggctcaattcaagtctttgtccccacaagccttgcaggcttttaagagagctaaggacgctttcgaagagtccttgttggaggactggaactgttcctccagaatcttcccaagatccagagacttgaagcagttgcaggtttgggaaagaccagttgctttggaagctgaggttgctttgaccttgtctgtcttgggttctttggctaactcttccttgcactcctctttggaccaaccattgcacaccttgagacacattcacgctcagttgcaagcttgtgttccagctcaacctatggctggtccaagaccaagaggtagattgcatcattggctgcacagattgcaagaggcccaaaagaaagagccacagtcttgtttggaggcttccgtcatgttcaacctgttcagattgctgacccgtgacttgaagtgtgttgcttctggtgacttgtgtgtt5)猪源ifnλ3氨基酸序列如下（seqidno:14）：vvaragargchakssaakrakdasdwncssrrsrdkvwrvaavatsvgsansshssdhtrhhaacvamagrrgrhhwhrakkscasvmnrtrdkcvasgdcv。6)长效元件abd核苷酸序列如下（seqidno:10）：
actatcgacgagtggttgctgaaagaggctaaagagaaggccatcgaggaattgaagaaggctggtatcacttccgactactacttcgacttgatcaacaaggccaagaccgttgagggtgttaacgctttgaaggacgagatattgaaggct7)长效元件abd氨基酸序列如下（seqidno:15）：
tdwkakkakkagtsdyydnkaktvgvnakdka
8)linker核苷酸序列如下：
gs:ggtggtggaggttccggtggtggaggttcc（seqidno:11）
hl:gctgaagctgctgctaaggaagctgctgctaaggct（seqidno:12）
rl:ggtccaggtccaggtcca（seqidno:13）9)linker氨基酸序列如下：
gs:ggggsggggs（seqidno:16）
hl:aeaaakeaaaka（seqidno:17）
rl:gpgpgp（seqidno:18）
3．重组蛋白的表达1)挑取单菌落接种于含50μg/mlzeocin的ypd培养基中，30℃振荡培养过夜。取10ml接种至100ml的bmgy，30℃振荡培养。当od600约为6时，3000转/分钟，离心5分钟收集菌体转接至100ml的bmmy培养基中，加入1ml的甲醇，开始诱导表达，每隔24h加1ml的甲醇诱导。诱导至120小时，8000转/分钟，离心20分钟收集上清，置4℃暂存。
2)取100μl上清加等体积2×凝胶上样缓冲液（1mtris-hcl，β-巯基乙醇1.0ml，sds0.6g，甘油2.0ml，0.1%溴酚蓝1.0ml，蒸馏水3.5ml），煮沸5分钟，15%聚丙烯酰胺凝胶进行sds-page，考马斯亮蓝染色，脱色液脱色至条带清晰为止，检测蛋白表达情况。
实施例2：本发明实施例1制备的猪源ifnλ3的活性检定
1．以mdbk细胞（mdbk牛肾细胞）/vsv（水泡性口腔炎病毒）模型检测实施例1制备的猪源长效ifnλ3的活性。将抑制50%细胞病变（cpe）的干扰素的最高稀释度定义为一个干扰素单位（u）。活性检测结果表明，猪源ifnλ3的生物学活性为2×106u/mg。目前所有表达的i、ii型干扰素都是以mdbk细胞/vsv来检测干扰素的表达活性，所以我们也先以该系统分析我们表达的abd-ifnλ3是否有生物活性，然后再分析抗其他病毒的活性，结果见表1；
表1：mdbk/vsv活性检测数据:
2．以vero细胞/pedv（cv777疫苗株）为模型检测实施例1制备的猪源长效ifnλ3的活性。将抑制50%细胞病变（cpe）的干扰素的最高稀释度定义为一个干扰素单位（u）。活性检测结果表明，猪源长效ifnλ3的生物学活性为2.7×106u/mg。结果见表2：
表2：pedv/cv777活性检测数据:
实施例3：实施例1中制备的abd-gs-ifnλ3猪源长效ifnλ3在猪体内的半衰期的测定
细胞病变抑制法测定猪源长效ifnλ3的血药浓度与时间关系，取六只体重相近的仔猪（雌雄各三只），分为肌肉注射2ml浓度为2mg/ml的猪源长效ifnλ3，之后分别在1h、2h、4h、8h、16h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h静脉采血，血样4℃，3500rpm低温离心10min分离血清，各时间点采的猪血清样品与-20℃保存待测。采用细胞病变抑制法测定血清样品中猪源长效ifnλ3的浓度，用das药动学软件进行曲线拟合并计算参数。参数计算结果见表3。
表3猪源长效ifnλ3肌肉注射后血清中主要动力学参数
序列表
<110>武汉中拓康明生物科技有限公司
<120>一种毕赤酵母表达长效猪源干扰素的方法
<160>18
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>54
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