本发明涉及杀虫剂领域，具体地说是一种海藻附生真菌来源的杜松烷倍半萜类化合物及其制备方法和在杀虫方面的应用。
背景技术：
随着化学合成农药使用时间的推移，其产生的不良影响已越来越突出。化学农药大规模地生产和无限制地大量使用，使70％-80％的农药直接渗透到环境中，残留非常严重，对土壤、地表水、地下水造成污染，并进一步进入生物链，对生物和人类健康都造成直接和潜在的危害。我国加入世界贸易组织后，因化学农药残留而导致的″绿色壁垒″严重制约着我国农产品的出口，传统农业面临着更大的风险和挑战。农业部已从2001年起在全国范围内实施″无公害食品行动计划″，而使用无公害农药又是实施这一目标的关键措施，于是人们把目光投向对环境更友好的生物农药。与传统的化学合成药物相比，生物农药具有对人畜和非靶标生物安全，环境兼容性好，不易产生抗性等优点。生物农药的开发应用对人类健康，环境保护和农业的可持续发展都具有极其重要的意义。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种杜松烷倍半萜类化合物及其制备和应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种杜松烷倍半萜类化合物，杜松烷倍半萜类化合物结构如式(i)所示
一种杜松烷倍半萜类化合物的制备方法，将绿木霉(trichodermavirens)y13-3接种于真菌培养基中发酵培养，发酵产物经纯化后，即为式(i)所示的杜松烷倍半萜类化合物；所述的绿木霉(trichodermavirens)y13-3于2018年1月10日保存于中国典型培养物保藏中心cctcc，保藏编号为cctccm2018016；
具体制备步骤：
1)将绿木霉(trichodermavirens)y13-3接种于真菌培养基中发酵10-60天，而后经有机溶剂提取并浓缩，即为粗提物；
2)取步骤1)中的粗提物进行硅胶柱层析，用有机溶剂进行梯度洗脱，收集洗脱液，洗脱液经薄层层析检测；
3)收集步骤2)中洗脱组分再依次经反相硅胶柱层析、凝胶柱层析和薄层层析分离纯化，即得如式(i)所示的杜松烷倍半萜类化合物。
所述步骤1)中真菌培养基为马铃薯葡萄糖液体培养基、大米固体培养基、麦芽汁培养基或菊芋葡萄糖液体培养基；优选为：马铃薯葡萄糖液体培养基。
有机溶剂提取液为二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇中一种或几种，优选为：乙酸乙酯。。
所述步骤2)中的有机溶剂为体积比50-0∶1的石油醚-乙酸乙酯、石油醚-乙醇、石油醚-丙醇、石油醚-异丙醇、二氯甲烷-乙酸乙酯、二氯甲烷-甲醇、二氯甲烷-乙醇、二氯甲烷-丙醇、二氯甲烷-异丙醇一组或几组。
所述步骤3)所述反相硅胶柱层析洗脱液为体积比5-0∶1的水-甲醇或水-乙醇；凝胶柱层析洗脱液为体积比2-0∶1的二氯甲烷-甲醇或二氯甲烷-乙醇；薄层层析展开剂为体积比为10-0∶1的石油醚-乙酸乙酯、石油醚-乙醇或二氯甲烷-乙酸乙酯。
所述步骤3)各层析后经tlc检测，均收集红色斑点的组分。
一种杜松烷倍半萜类化合物的应用，所述的杜松烷倍半萜类化合物在用于制备杀虫剂中的应用。
本发明具有以下优点：本发明通过分离于海洋红藻真江蓠表面的绿木霉(trichodermavirens)y13-3发酵经提取、分离获得的杜松烷倍半萜类化合物，经杀虫活性实验得出杜松烷倍半萜类化合物对卤虫的半数致死浓度为21微克/毫升。
具体实施方式：
下面结合实施实例对本发明做进一步阐述。
实施例1
海藻附生真菌来源的杜松烷倍半萜类化合物结构如式(i)所示。
该化合物具有以下理化和波谱特性：
无色油状；比旋光度[α]22d-164(c0.22，meoh)；核磁共振氢谱(溶剂为氘代二甲基亚砜)δh1.80(m)，3.78(td，9.5，6.0)，2.67(dd，17.4，5.5)，1.97(m)，6.78(brs)，1.81(m)，1.35(brt，11.1)，1.77(m)，1.09(qd，12.7，4.4)，2.30(brd，11.5)，1.94(m)，2.12(m)，0.73(d，6.9)，0.91(d，6.9)，4.95(brs)，4.79(brs)；核磁共振碳谱(溶剂为氘代二甲基亚砜)δc50.5(ch)，65.9(ch)，34.8(ch2)，130.5(c)，135.6(ch)，45.3(ch)，45.9(ch)，26.6(ch2)，36.5(ch2)，148.4(c)，168.9(c)，26.5(ch)，14.9(ch3)，21.2(ch3)，106.2(ch2)；高分辨质谱[m]+m/z250.1568，计算值250.1569。
实施例2
如式(i)所示的杜松烷倍半萜类化合物的制备方法：
取平板上生长良好的绿木霉(trichodermavirens)y13-3菌种，切成小块并接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中，每1升三角瓶中放300毫升培养基，共200瓶，室温静止发酵30天，而后用乙酸乙酯提取三次，减压浓缩，浓缩后得粗提物27.2克。
所述马铃薯葡萄糖液体培养基组成为每升含100克土豆的煮汁500毫升，葡萄糖20克，蛋白胨5克，酵母浸粉5克，陈海水500毫升。
绿木霉(trichodermavirens)y13-3菌种于2018年1月10日保存于中国典型培养物保藏中心cctcc，地址：中国武汉大学，保藏编号为cctccm2018016，分类命名为trichodermavirens，株号为y13-3。
将粗提物经200-300目的硅胶柱层析，依次用石油醚-乙酸乙酯以体积比50∶1、20∶1、10∶1、5∶1、2∶1到1∶1和二氯甲烷-甲醇20∶1、10∶1、5∶1到1∶1的梯度进行洗脱，分别收集洗脱液，收集的各组分再用薄层层析(tlc)检测(体积比20-0∶1的石油醚-乙酸乙酯展开，茴香醛-硫酸作为显色剂)，根据rf值来判断、合并相同或类似部分，获得10个组分(1-10)。
将rf值为0.5-0.6(乙酸乙酯，硫酸-茴香醛显色)组分6，即以体积比1∶1的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱下的组分再依次经反相c18硅胶柱、sephadexlh-20凝胶柱和薄层层析分离。反相c18硅胶柱层析洗脱液为体积比1∶1的水-甲醇，tlc检测(体积比1∶1的石油醚-乙酸乙酯展开，硫酸-茴香醛显色)，收集红色斑点的组分；收集组分经sephadexlh-20凝胶柱层析时洗脱液为甲醇，tlc检测(体积比1∶1的石油醚-乙酸乙酯展开，硫酸-茴香醛显色)，收集红色斑点的组分；收集组分经制备薄层层析，体积比1∶1的石油醚-乙酸乙酯为展开剂，收集rf值为0.5-0.6的组分，即为式(i)所示化合物(6.7毫克)，经tlc检测(乙酸乙酯，硫酸-茴香醛显色)，呈单个、均匀红色斑点，确定为纯化合物。经波谱分析，其结构鉴定为一种新的杜松烷倍半萜类化合物，结构式如(i)所示。
实施例3
与实施例2不同之处在于
取平板上生长良好的绿木霉(trichodermavirens)y13-3菌种，切成小块并接种于菊芋葡萄糖液体培养基中，每1升三角瓶中放300毫升培养基，共100瓶，室温静止发酵40天，过滤并分别收集菌丝体和发酵液。
所述菊芋葡萄糖液体培养基组成为每升含100克菊芋块茎的煮汁500毫升，葡萄糖20克，蛋白胨5克，酵母浸粉5克，陈海水500毫升。
收集发酵液约30升，用乙酸乙酯萃取三次，减压浓缩；菌丝体干燥并粉碎后用乙酸乙酯提取三次，减压浓缩；浓缩物经薄层层析(tlc)检测(体积比20-0∶1石油醚-乙酸乙酯展开，硫酸-茴香醛显色)其结果相似，合并发酵液和菌丝体两部分的浓缩物为粗提物18.0克。
将粗提物经200-300目的硅胶柱层析，依次用石油醚-乙醇以体积比50∶1、30∶1、15∶1、10∶1、5∶1、2∶1、1∶1到0∶1的梯度进行洗脱，分别收集洗脱液，再用薄层层析检测(体积比20-0∶1的石油醚-乙酸乙酯展开，硫酸-茴香醛显色)，根据rf值来判断、合并相同或类似部分，获得8个组分(1-8)。
将rf值为0.5-0.6(乙酸乙酯，硫酸-茴香醛显色)组分4即以体积比10∶1的石油醚-乙醇梯度洗脱下的组分再依次经反相c18硅胶柱、sephadexlh-20凝胶柱和薄层层析分离。反相c18硅胶柱层析洗脱液为体积比1∶1的水-乙醇，tlc检测(体积比1∶1的石油醚-乙酸乙酯展开，硫酸-茴香醛显色)，收集红色斑点的组分；收集组分经sephadexlh-20凝胶柱层析时洗脱液为乙醇，tlc检测(体积比1∶1的石油醚-乙酸乙酯展开，硫酸-茴香醛显色)，收集红色斑点的组分；收集组分经制备薄层层析，体积比8∶1的石油醚-乙醇为展开剂，收集rf值为0.5-0.6的组分，得式(i)所示杜松烷倍半萜类化合物。
实施例4
杀虫活性实验：
卤虫(artemiasalina)，又称盐水丰年虫或盐水丰年虾。在分类上属节肢动物门，甲壳亚门，鳃足纲，无甲目，盐水丰年虾虫科，卤虫属。卤虫作为杀虫活性筛选模型，是一种良好的实验动物材料。
卤虫卵的孵化：取卤虫卵100毫克置于500毫升烧杯中，加入人工海水400毫升，用一小充气泵缓缓充气，室温孵化24小时，除去卵壳及未孵化的卵，卤虫幼虫继续培养24小时，备用。
卤虫生物致死法：依照solis的改良法，取96孔细胞培养板，每孔加195微升含15个左右卤虫幼虫的人工海水液，制成测试培养板。空白对照组和每个浓度的样品组各设三个平行孔，空白对照组加5微升溶剂二甲基亚砜(dmso)，样品组加入含浓度分别为4，2，1，0.5，0.25毫克/毫升式(i)所示的杜松烷倍半萜化合物5微升dmso溶液。室温培养24小时后，在双目解剖镜下检测计数卤虫死亡个体数目。
卤虫生物致死活性以校正死亡率表示，计算公式如下：校正死亡率＝(对照组存活率-处理组存活率)/对照组存活率×100％
实验结果：上述实施例中的获得的杜松烷倍半萜类化合物对卤虫的半数致死浓度ld50值为21微克/毫升。