本发明涉及一种病菌分离方法，具体地说是一种烟草根黑腐病菌的分离方法。
背景技术：
：植物病原真菌的分离、纯化培养不仅是进行病原真菌的形态学观察、致病性测定、生理生态与分子生物学等理论性研究的基础，也是进行品种抗病性鉴定和筛选、病原菌耐（抗）等应用性研究的基础。植物患病组织内的真菌菌丝体，如果给予适宜的环境条件，一般都能恢复生长和繁殖。然而，在自然情况下，病原菌通常是与其他杂菌混生在一起的，从受病组织或其它基物中将病原菌单独分离出来，称作植物病原真菌的分离。植物病原真菌的分离不仅在植物病理学研究工作中具有十分重要的位置，而且对分离到的病原真菌进行保存可以满足植物病理学及微生物学日常的教学需要，使学生对植物病原真菌有更直观的认识。烟草根黑腐病由根串珠霉(thielaviopsisbasicola)侵染引起，在我国云南、贵州、四川、重庆、湖北、河南、山东、安徽、福建和吉林等省也均有发生，重病烟田发病率达30%以上。由于串珠霉与烟草寄生疫霉（phytophthoraspp.）、腐霉菌（pythiumspp.）、镰刀菌（fusariumspp.）、丝核菌（rhizoctoniaspp.）等病原真菌复合侵染引起烟草根茎部病害，给生产上准确诊断病害造成困难，明确本地病原菌的种类及其致病力是指导病害防治以及进行后续研究的基础。目前，从染病植株上分离病原菌通常采用组织分离法，在病株发病部位的病、健交界处切下4-5块3×3mm的组织小块，分离过程中需要依次用70%酒精（或0.1%升汞）及3%-5%次氯酸钠消毒，还需要用无菌水多次清洗，以及用滤纸吸干离。用酒精和次氯酸钠消毒，以及无菌水清洗时都需要用到培养皿，每次消毒及清洗培养皿均需更换一次，1个病株需要5副培养皿才可以分离完毕，操作过程复杂，而且所需耗材及试剂多，成本较高。而且，由于烟草根黑腐病菌属于兼性寄生真菌，且与腐霉菌等其它几类真菌相比生长速度较慢，采用常规的病组织分离法分离极容易被其它真菌掩盖，很难获得纯培养病原物。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是克服常规分离方法所需耗材及试剂多，难以获得纯培养病原物的缺陷，提供一种烟草根黑腐病菌的分离方法。本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种烟草根黑腐病菌的分离方法，采集具有烟草根黑腐病症状的烟草植株的根际土壤，将采集的根际土壤干燥磨碎后粘附于胡萝卜片上，然后将粘附有土壤的胡萝卜片放置在培养皿中培养2—4天，之后用加有50μl/ml青霉素和50μl/ml硫酸链霉素的无菌水冲洗胡萝卜片，继续培养2—4天后，挑取胡萝卜片上具有烟草根黑腐病典型病症的霉层，纯化培养后保存。进一步地，所述的根际土壤为距烟草根系表面2mm以内的土壤。进一步地，所述的胡萝卜片的厚度为4-6mm。进一步地，所述的胡萝卜片为新鲜胡萝卜用浓度75%酒精进行表面消毒后，使用灭菌刀切成的圆片。进一步地，先在培养皿中铺设浸过蒸馏水的脱脂棉及滤纸，然后再将粘附有土壤的胡萝卜片放于其中培养。进一步地，胡萝卜片在培养皿中培养的过程中，保持其处于潮湿状态。进一步地，胡萝卜片在培养皿中培养的过程中，保持培养温度为25℃。进一步地，挑取胡萝卜片上具有烟草根黑腐病典型病症的霉层后，转接至pda平板上，置于25℃恒温培养箱，黑暗条件下纯化培养3-5d后，进行纯化培养2-3次。进一步地，纯化培养后，挑取边缘菌落转至pda斜面培养基上，置于25℃恒温培养箱培养，黑暗条件下培养5-7d后，进行菌株保存。进一步地，所述的pda平板及pda斜面培养基中，每100ml的pda培养基中含马铃薯20g，葡萄糖2g，琼脂2g，ph值为7.0，余量为水。本发明的有益效果是：该方法选择在胡萝卜片上培养分离烟草根黑腐病菌，利用胡萝卜片成分对烟草根黑腐病菌和真菌等其它菌的不同影响，诱导烟草根黑腐病菌生长而抑制其它菌的生长，以解决烟草根黑腐病菌易被其它真菌掩盖的问题。本方法分离成功率高，处理后的胡萝卜圆片表面可很快长出菌丝与典型的分生孢子梗、分生孢子及厚垣孢子，转入pda上后也能很快长出烟草根黑腐病菌的典型菌落，成功率达96%以上。本发明的分离方法仅需对发病植株根际进行简单处理，保湿及分离时多个病株用1个培养皿即可，操作中无需酒精（升汞）或次氯酸钠消等化学试剂，所需耗材及试剂很少，节约了试验成本。分离周期与常规组织分离法相比大幅下降，不但省时、操作过程中不使用有害物质，对试验环境安全、对人体无害，可用于大量烟草根黑腐病病株的病原菌分离，为以后的病原菌种类确认、抗病性品种鉴定及药剂筛选等工作提供便利。具体实施方式以下结合具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整的说明。下面实施例所列出的具体内容不限于权利要求记载的技术方案要解决的技术问题所必须的技术特征。同时，所述列举是实施例仅仅是本发明的一部分，而不是全部实施例。本发明所用的烟草根黑腐病菌的分离方法，选择具烟草根黑腐病典型症状的病株，将其拔出后，采集具有烟草根黑腐病症状的烟草植株的根际土壤，具体采集范围为距烟草根系表面2mm以内的土壤。距烟草根系表面2mm以上的土壤先用解剖刀剥离，然后抖落其余土壤作为根际土样收集，不能抖落的粘附在根上的土壤用小毛刷轻轻刷下。采集的根际土壤在室内自然风干，装入纸袋中，编号，保存备用。本发明采用胡萝卜片诱导的方式从根际土壤中分离病原菌，胡萝卜中的营养物质等成分适宜烟草根黑腐病菌生长，相对的能够抑制其它真菌生产，利用胡萝卜片诱导的方式解决烟草根黑腐病菌易被其它真菌掩盖的问题。具体方法为：将根际土壤样品放入研钵中碾碎后，倒入灭菌的培养皿中备用。用75%酒精对新鲜胡萝卜表面进行消毒，使用灭菌刀将其切成约4-6mm厚的圆片。用胡萝卜片均匀蘸取磨碎的根际土壤样品，使根际土壤粘附于胡萝卜片上。然后将粘附有土壤的胡萝卜片放置在培养皿中培养2—4天。之后用加有50μl/ml青霉素和50μl/ml硫酸链霉素的无菌水冲洗胡萝卜片，通过冲洗去除胡萝卜片表面土壤，无菌水中添加的青霉素和硫酸链霉素能够去除培养过程中滋生的细菌而不对烟草根黑腐病菌产生影响。冲洗后继续培养2—4天，挑取胡萝卜片上具有烟草根黑腐病典型病症的霉层，纯化培养后保存。所述培养皿中铺设有浸过蒸馏水的脱脂棉及滤纸。脱脂棉吸水性强，设置在最下层，可以保存较多的水分。滤纸放置在脱脂棉上，隔离脱脂棉和胡萝卜片。胡萝卜片放置在滤纸上后，由其重量压迫使脱脂棉中的水渗出，透过滤纸使胡萝卜片长时间保持湿润。滤纸在能够透过一定水分保持胡萝卜片湿润的同时，可以避免脱脂棉渗出的水过多而浸没胡萝卜片。以上分离过程中，先在培养皿中铺设浸过蒸馏水的脱脂棉及滤纸，然后再将粘附有土壤的胡萝卜片放于其中培养。所述胡萝卜片在培养皿中培养的过程中，保持其处于潮湿状态。培养在恒温箱中进行，保持培养温度为25℃。具体纯化和保存的方法为：挑取胡萝卜片上具有烟草根黑腐病典型病症的霉层后，转接至pda平板上，置于25℃恒温培养箱，黑暗条件下纯化培养3-5d后，进行纯化培养2-3次。纯化培养后，挑取边缘菌落转至pda斜面培养基上，置于25℃恒温培养箱培养，黑暗条件下培养5-7d后，进行菌株保存。所述的pda平板及pda斜面培养基中，每100ml的pda培养基中含马铃薯20g，葡萄糖2g，琼脂2g，ph值为7.0，余量为水。实施例1一种烟草根黑腐病菌的分离方法，其操作步骤为：步骤一：试验样品采集选择具烟草根黑腐病典型症状的病株拔出，用解剖刀将距根系表面2mm以上的土壤轻轻剥离，抖落其余土壤作为根际土样收集，不能抖落的粘附在根上的土壤用小毛刷轻轻刷下，室内自然风干，装入纸袋中，编号，保存备用。步骤二：胡萝卜圆片诱导将根际土壤样品放入研钵中碾碎后，倒入灭菌的培养皿中。用75%酒精对新鲜胡萝卜表面进行消毒，使用灭菌刀将其切成约5mm厚的圆片，均匀蘸取磨碎的样品后，置于铺有浸过蒸馏水的脱脂棉及滤纸的培养皿中，于25℃恒温培养箱培养，期间及时观察并维持样品潮湿，3d后，用加有50μl/ml青霉素和50μl/ml硫酸链霉素的无菌水冲去胡萝卜圆片表面土壤后，将胡萝卜圆片继续置于25℃条件下培养3d。步骤三：菌株纯化挑取胡萝卜圆片表面灰黑色霉层，在10×40光学显微镜下镜检观察根串珠霉的分生孢子梗、分生孢子与厚垣孢子。用接种针挑取胡萝卜圆片表面具典型病症的霉层，转接至pda平板上，置于25℃恒温培养箱，黑暗条件下纯化培养5d后，进行纯化培养3次。步骤四：菌种保存用接种针从菌落边缘挑取小块菌落，转至pda斜面培养基上，置于25℃恒温培养箱培养，黑暗条件下培养7d天后，进行菌株保存，即分离出烟草根黑腐病菌。所述pda培养基，每100mlpda培养基中含马铃薯20g，葡萄糖2g，琼脂2g，ph值为7.0，余量为水。实施例2一种烟草根黑腐病菌的分离方法，其操作步骤为：步骤一：试验样品采集选择具烟草根黑腐病典型症状的病株拔出，用解剖刀将距根系表面2mm以上的土壤轻轻剥离，抖落其余土壤作为根际土样收集，不能抖落的粘附在根上的土壤用小毛刷轻轻刷下，室内自然风干，装入纸袋中，编号，保存备用。步骤二：胡萝卜圆片诱导将根际土壤样品放入研钵中碾碎后，倒入灭菌的培养皿中。用75%酒精对新鲜胡萝卜表面进行消毒，使用灭菌刀将其切成约6mm厚的圆片，均匀蘸取磨碎的样品后，置于铺有浸过蒸馏水的脱脂棉及滤纸的培养皿中，于25℃恒温培养箱培养，期间及时观察并维持样品潮湿，2d后，用加有50μl/ml青霉素和50μl/ml硫酸链霉素的无菌水冲去胡萝卜圆片表面土壤后，将胡萝卜圆片继续置于25℃条件下培养2d。步骤三：菌株纯化挑取胡萝卜圆片表面灰黑色霉层，在10×40光学显微镜下镜检观察根串珠霉的分生孢子梗、分生孢子与厚垣孢子。用接种针挑取胡萝卜圆片表面具典型病症的霉层，转接至pda平板上，置于25℃恒温培养箱，黑暗条件下纯化培养4d后，进行纯化培养2次。步骤四：菌种保存用接种针从菌落边缘挑取小块菌落，转至pda斜面培养基上，置于25℃恒温培养箱培养，黑暗条件下培养6d天后，进行菌株保存，即分离出烟草根黑腐病菌。所述pda培养基，每100mlpda培养基中含马铃薯20g，葡萄糖2g，琼脂2g，ph值为7.0，余量为水。实施例3一种烟草根黑腐病菌的分离方法，其操作步骤为：步骤一：试验样品采集选择具烟草根黑腐病典型症状的病株拔出，用解剖刀将距根系表面2mm以上的土壤轻轻剥离，抖落其余土壤作为根际土样收集，不能抖落的粘附在根上的土壤用小毛刷轻轻刷下，室内自然风干，装入纸袋中，编号，保存备用。步骤二：胡萝卜圆片诱导将根际土壤样品放入研钵中碾碎后，倒入灭菌的培养皿中。用75%酒精对新鲜胡萝卜表面进行消毒，使用灭菌刀将其切成约4mm厚的圆片，均匀蘸取磨碎的样品后，置于铺有浸过蒸馏水的脱脂棉及滤纸的培养皿中，于25℃恒温培养箱培养，期间及时观察并维持样品潮湿，4d后，用加有50μl/ml青霉素和50μl/ml硫酸链霉素的无菌水冲去胡萝卜圆片表面土壤后，将胡萝卜圆片继续置于25℃条件下培养4d。步骤三：菌株纯化挑取胡萝卜圆片表面灰黑色霉层，在10×40光学显微镜下镜检观察根串珠霉的分生孢子梗、分生孢子与厚垣孢子。用接种针挑取胡萝卜圆片表面具典型病症的霉层，转接至pda平板上，置于25℃恒温培养箱，黑暗条件下纯化培养3d后，进行纯化培养2次。步骤四：菌种保存用接种针从菌落边缘挑取小块菌落，转至pda斜面培养基上，置于25℃恒温培养箱培养，黑暗条件下培养5d天后，进行菌株保存，即分离出烟草根黑腐病菌。所述pda培养基，每100mlpda培养基中含马铃薯20g，葡萄糖2g，琼脂2g，ph值为7.0，余量为水。对比试验：发明人分批次从多地采集烟草根黑腐病病株，共采集18批，每批选择具有烟草根黑腐病典型症状的病株6株，其中3株留作用常规组织分离作为对比例。另外3株作为实验例，用解剖刀将距根系表面2mm以上的土壤轻轻剥离，抖落其余土壤作为根际土样收集，不能抖落的粘附在根上的土壤用小毛刷轻轻刷下，装入纸袋中，编号保存。共收集对比例病株样品54株；实验例根际土壤样品54份。采用本发明实施例1的方法（胡萝卜圆片诱导法）从根际土壤中分离病原菌菌。对比例的病株样品采用常规组织分离法进行，具体方法为：在病株茎基腐烂部位或须根的病健交界处切取适当大小的组织块，用75％酒精消毒30s，0.1％升汞消毒1~2min，再用无菌水清洗3次，无菌吸水纸吸干组织块表面水分后接种于含50μl/ml硫酸链霉素和50μl/ml青霉素的pda培养基平板上，25℃恒温培养5~7d，待组织块周围长出菌落后转接至pda培养基平板上继续培养，3d后在光学显微镜下镜检培养物产生分生孢子情况，选取产生分生孢子的培养物进行单孢纯化以获得纯菌株。统计结果见表1。表1组织分离法与胡萝卜圆片诱导法的比较样品数量目标菌菌株数分离成功率（%）组织分离法54株00胡萝卜圆片诱导法54份5296.29结果表明，组织分离法单个病株分离周期较长，需要2-3周，本次实验组织分离法没有获得目标菌株。分析原因，可能是由于组织分离法操作要求高，如酒精与升汞消毒时间不易把握，易将目标菌株也杀死。而且由于根串珠霉生长太慢，极易被快速生长的非目标菌所掩盖。本发明的胡萝卜圆片诱导法分离成功率达96%以上，操作过程中不使用有害物质，安全，可用于大量拟似烟草根黑腐病病株的病原菌分离。以上对具体实施方式的说明只是用于帮助理解本发明的技术构思及其核心思想，尽管本文使用了特定的优选实施例对技术方案进行了描述和说明，但其不应理解为对本发明自身的限制。本领域技术人员在不脱离本发明技术构思的前提下，可对其在形式上和细节上做出各种变化。这些轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。当前第1页12