本发明涉及农作物病害检测鉴定技术和分子生物学技术领域，具体涉及一种用于链格孢菌lamp快速检测的引物组合物及其应用。
背景技术：
链格孢菌(alternariasp.)是全球分布最广，经济上重要的半知菌类真菌之一。95％以上的种类兼性寄生于植物上，引起多种植物病害，造成全球性的田间和产后巨大的经济损失。有几个链格孢小孢子种可侵染人和动物，引起皮癣、甲癣、颚骨髓炎等疾病。链格孢产生的某些真菌毒素是重要的致癌因素。另一方面，链格孢菌也是有应用潜力的生物资源，某些链格孢种高产纤维素酶或可开发为生防制剂，作为植物内生菌的一些链格孢可产生长春碱、紫杉醇等抗癌药物。
近年来随着分子生物学相关技术的发展，基于pcr的方法已经成功用于检测链格孢菌，尽管以pcr为基础的分子鉴定方法一定程度上克服了传统形态鉴定上的缺陷，但由于检测需要pcr仪、凝胶电泳和成像系统仪等昂贵的专业仪器设备，同时需要操作人员具有一定的分子生物学专业技能，并且只能在实验室条件下完成，需要较长的时间，检测过程复杂，不能满足快速检测的需求，限制了pcr检测方法在生产中的推广应用。
环介导等温扩增技术(loop‐mediatedisothermalamplification,lamp)是notomi等开发的一种恒温扩增方法，该方法针对靶基因的6个位点设计出4条引物，利用一种具有链式置换活性的dna聚合酶(bstdnapolymerase)，在恒温条件下(60℃左右)保温30‐90分钟，即可完成扩增反应。由于该反应过程中产生焦磷酸镁沉淀物，出现浑浊沉淀，因此用肉眼就判定扩增结果，也可通过向其扩增产物中添加荧光染料通过颜色变化来判断，因此不需要专业的仪器设备，在普通水浴锅中或者其他稳定热源即可完成，具有简单、快速、高效、经济等特征。凭借快速灵敏的优越性，lamp技术已在多种花卉、植物、农作物常见病虫害的快速检测中得到了应用，极大的提高了针对植物病虫害的鉴定效率和准确率，为进一步采取适宜的防控措施控制其危害提供了便利，但目前在链格孢菌的检测中尚无相关报道。
技术实现要素：
本发明提供了一种用于链格孢菌lamp快速检测的引物组合物。
本发明还提供该引物组合物的应用。
本发明进一步提供一种链格孢菌lamp快速检测方法。
本发明采用的技术方案如下：
一种用于链格孢菌lamp快速检测的引物组合物，其特征在于：该引物组合物包括一对外引物f3、b3和一对内引物fip、bip，所述引物序列为：
f3：5’-ggctcctttgaatggtaac-3’；
b3：5’-tgtcttcaaccaagcatca-3’；
fip：5’-cgctgcaagtaatctataaatcggattcaataggcaaatgggga-3’；bip：5’-aatggatcaagaacgttcaacgaattggttgtggggtactc-3’。
所述的lamp引物组合物在制备链格孢菌检测试剂中的应用。
所述的lamp引物组合物在检测和/或鉴定链格孢菌中的应用。
一种用于检测链格孢菌的试剂，包含本发明的引物组合物。
一种链格孢菌lamp快速检测方法，包括以下步骤：
(1)提取待检样品dna；
(2)以提取的dna为模板，利用权利要求1所述的lamp引物组合物进行lamp扩增；
(3)lamp扩增反应结束按照以下任意一种方式观察结果：
1)向扩增产物中加入显色剂，轻晃混匀，观察颜色变化；
2)取扩增产物在2％琼脂糖凝胶电泳中电泳，观察扩增结果；
如果lamp扩增产物显示黄绿色，电泳图谱为梯状条带，判定为含有链格孢菌菌株；如果扩增产物为橙红色，电泳图谱无扩增条带，判定为不含有链格孢菌菌株。
所述的检测方法，其特征在于步骤(2)所述lamp扩增反应体系总体积为20μl，由下列浓度体积的组分组成：
用无菌双蒸水补充扩增体系体积至20μl。
步骤(2)所述lamp扩增的反应条件为：65℃保温60min。
所述的显色剂为sybrgreeni。
本发明提供的快速检测链格孢菌的分子生物学方法，具有灵敏度高，特异性强等特点，与现有技术相比，本发明的有益结果是：
1、简便易行：该检测方法通过恒温水浴锅或有稳定热源的设备就能进行实验，通过反应产物颜色变化即可判定结果，省去了昂贵的仪器设备、繁琐的电泳过程；
2、检测高效性：该检测方法所用检测时间不到1小时，而pcr扩增时间较长，一般需要几个小时，这样大大缩短了检测时间，提高了检测效率；
3、特异性强：该方法通过2对引物特异性识别靶序列上的6个独立区域，相对于pcr引物识别靶序列的2个独立区域而言，特异性大大提高，假阳性出现的概率也随之降低；
4、本发明是国内外首次利用lamp技术对链格孢菌进行检测，这种方法快速简便，对病害的准确诊断、及时了解病原发展动态、指导科学用药，以及降低成本和减少环境污染具有重要的现实意义；
5、本发明所采集的20份梨样品的lamp检测结果与传统分离鉴定及分子生物学鉴定结果完全吻合。
综上所述，本发明所建立的检测方法能准确、快速的检测出链格孢菌菌株，为科学研究和生产实践提供了一种简便、快速、成本低廉的检测技术，也为链格孢菌的早期预警及合理用药提供了理论基础和技术指导，对增加生态社会和经济效益都具有现实而深远的意义。
附图说明
图1链格孢菌lamp检测特异性验证扩增产物电泳谱带图
图中1电泳图谱为梯状条带，表明含有链格孢菌菌株；2-23电泳图谱无扩增条带，表明不含有链格孢菌菌株，其中m：2000bpmarker；1：链格孢菌(alternariaalternata)；2：枇杷褐斑病菌(ascochytaeriobotryae)；3：黑曲霉菌(aspergillusniger)；4：黄曲霉菌(aspergillusflavus)；5：葡萄座腔菌(botryosphaeriadothidea)；6：灰霉病菌(botrytiscinerea)；7：胶孢炭疽菌(colletotrichumgloeosporioides)；8：壳座月孢菌(coniellagranati)；9：葡萄白腐病菌(coniothyriumdiplodiella)；10：尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)；11：炭疽病菌(glomerellaacutata)；12：围小丛壳菌(glomerellacingulata)；13：桃褐腐病菌(moniliniafructicola)；14：黑孢霉菌(nigrosporasphaerica)；15：青霉病菌(penicilliumpurpurogenum)；16：石榴拟盘多毛孢菌(pestalotiopsispunicae)；17：茶拟盘多毛孢菌(pestalotiopsistheae)；18：蓝莓枝枯病菌(pestalotiopsisclavispora)；19：梨干枯病菌(phomopsisfukushii)；20：石榴拟茎点霉(phomopsispunicae)；21：拟茎点霉枝枯病菌(phomopsisamygdalina)；22：霜霉病菌(plasmoparaviticola)；23：核盘菌(sclerotiniasclerotiorum)；n：无菌双蒸水(阴性对照)。
图2lamp检测链格孢菌的灵敏度显色图(模板进行梯度稀释)
图a中1-9表示在20μl的反应体系中分别以10μg、1μg、100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg链格孢菌dna为模板，进行lamp等温扩增反应，分别在扩增产物中加入0.25μl显色剂sybrgreeni，得到的相应的显色图，其中1-8反应管显黄绿色，显阳性；9反应管显橙红色，显阴性，n：无菌双蒸水(阴性对照)，显色结果表明lamp反应的灵敏度达到1pg。
图b为pcr灵敏度检测电泳图，其中m：2000bpmarker；1-9表示在25μl的反应体系中分别以10μg、1μg、100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg的稻曲病菌dna为模板，进行pcr扩增反应，分别取扩增产物在1％的琼脂糖凝胶电泳中电泳，得到的相应的电泳图谱，其中1-5泳道的图谱为有扩增条带，呈阳性反应，表示有扩增；6-9泳道的图谱为无扩增条带，呈阴性反应，表示没有扩增，n为无菌双蒸水(阴性对照)；由图可以看出pcr反应的灵敏度只能达到1ng。
图3为lamp检测技术用于梨样品检测的显色图
1为链格孢菌(alternariaalternata)阳性对照(黄绿色)；2为无菌双蒸水阴性对照(橙红色)；3-22不同梨样品dna，图中3、5、6、9、10、12、14、15、17、18、20、22显黄绿色，表示梨样品中含有链格孢菌；图中2、4、7、8、11、13、16、19、21显橙红色，表示梨样品中不含有链格孢菌。
图4mg2+浓度对lamp反应的影响(n：无菌双蒸水；2：4.8μl；3：4μl；4：3.2μl；5：2.4μl；6：1.6μl)。
图5反应时长对lamp反应的影响(1：30min；2：45min；3：60min；4：75min；5：90min；n：无菌双蒸水)。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1lamp引物的设计
从genbank中下载链格孢菌的cytochromeb(登录号：jq437357)基因序列，根据基因序列，采用primerexplorerv4软件设计一种lamp检测引物，包括2条外引物(f3和b3)和2条内引物(fip和bip)，引物序列分别为：
f3：5’-ggctcctttgaatggtaac-3’
b3：5’-tgtcttcaaccaagcatca-3’
fip：5’-cgctgcaagtaatctataaatcggattcaataggcaaatgggga-3’
bip：5’-aatggatcaagaacgttcaacgaattggttgtggggtactc-3’。
所有引物合成量均为1od，用ddh2o溶解后分装，其中f3和b3的终浓度为10μm，fip和bip的终浓度为40μm，4℃保存备用。
实施例2lamp扩增体系的建立，
运用两对特异性引物对待鉴定真菌的基因组dna进行lamp恒温扩增，lamp反应总体积为20μl，反应体系是：
用无菌双蒸水补充扩增体系体积至20μl。
lamp扩增的反应条件为：65℃保温60min。
其中的显色剂为sybrgreeni。
实施例3链格孢菌lamp反应特异性检测
首先用ctab法提取链格孢菌及其他22种常见农作物病原菌基因组dna(见表1)，再以链格孢菌及其他常见农作物病原菌基因组dna为模板，利用实施例2建立的反应体系，分别进行lamp扩增，当模板为链格孢菌时，电泳图谱成梯状条带；当模板为其他常见农作物病原菌时，电泳无条带(见图1)。试验结果验证本发明lamp反应具有很好的特异性。
表1本实施例中用于筛选引物特异性的菌株
上表中：+表示具有lamp引物扩增条带和颜色变化；－表示无扩增条带和颜色变化。
实施例4lamp反应灵敏度检测
为了检测lamp反应的灵敏度，本实验首先用ctab法提取链格孢菌的基因组dna，利用实施例2建立的lamp反应扩增体系，在20μl的反应体系中分别以10μg、1μg、100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg链格孢菌dna为模板，进行lamp等温扩增反应，反应结束后，分别在扩增产物中加入0.25μl显色剂sybrgreeni，得到的相应的显色图(图2a)；再以同样的稀释倍数进行pcr扩增，结果表明lamp技术的最低检测下限为1pg，而普通pcr检测下限仅为1ng(图2b)。
实施例5lamp技术在检测梨样品中的应用
首先用ctab法提取20份梨样品的dna；在利用实施例2建立的lamp反应扩增体系，在25μl的反应体系中分别以20份梨样品的dna为模板，进行lamp等温扩增反应；反应结束后，分别加入荧光染料，观察颜色变化(见图3)，图中1为链格孢菌(alternariaalternata)阳性对照，呈现黄绿色；2为无菌双蒸水阴性对照，呈橙红色；3-24分别为20个不同的梨样品，图中3、5、6、9、10、12、14、15、17、18、20、22显黄绿色，表示梨样品中含有链格孢菌；图中4、7、8、11、13、16、19、21显橙红色，表示梨样品中不含有链格孢菌。
对20份梨样品的lamp检测结果与传统分离鉴定及分子生物学鉴定结果完全吻合，说明该方法检测结果可靠。
序列表
<110>安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所
<120>一种用于链格孢菌lamp快速检测的引物组合物及其应用
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>19
<212>dna
<213>人工序列(alternariaalternata)
<400>1
ggctcctttgaatggtaac19
<210>2
<211>19
<212>dna
<213>人工序列(alternariaalternata)
<400>2
tgtcttcaaccaagcatca19
<210>3
<211>44
<212>dna
<213>人工序列(alternariaalternata)
<400>3
cgctgcaagtaatctataaatcggattcaataggcaaatgggga44
<210>4
<211>41
<212>dna
<213>人工序列(alternariaalternata)
<400>4
aatggatcaagaacgttcaacgaattggttgtggggtactc41