以偶氮键作连接键的具有乏氧、温度双重响应性两亲性嵌段聚合物及其制备方法与流程

本发明属于高分子材料和生物医学工程领域，具体涉及一种以偶氮键作连接键的具有乏氧、温度双重响应性两亲性嵌段聚合物及其制备方法。

背景技术

对羟基偶氮苯(4,4’-azobenzenedihydroxy)具有高度对称的化学结构，两端的羟基作为两个官能团，可分别连接所需性能的大分子，而其对称中心的氮氮双键可在低含氧量环境中失电子断裂。以偶氮键作为乏氧响应官能团，制得的新型两亲性嵌段共聚材料，因其独特的制备方法和优异的性能，引起了人们极大的关注。kulkarnip等(kulkarnip,haldarmk,yous,etal.biomacromolecules,2016,17(8):2507.)合成了以偶氮键为连接键，两端分别连接聚乙二醇与聚乳酸的聚合物，该聚合物具有乏氧响应性，并且具有细胞靶向识别能力，可以用作药物载体，在生物医药领域有广阔的应用前景。

当外界环境发生微小变化时，某些聚合物会相应地迅速发生比较明显的物理或化学变化，这类聚合物被称为环境响应性聚合物，也被称为环境敏感性聚合物或刺激响应性聚合物。一直以来，人们对刺激响应聚合物的普遍研究工作放在温度、ph、紫外、磁等刺激响应因子。专利申请201410209753.3公布了一种温度响应的磁共振造影的超分子纳米胶束的制备方法，所述超分子纳米胶束构筑单元包括桥联三聚b-环糊精、聚乙二醇修饰的金属锰卟啉和金刚烷修饰的聚n-异丙基丙烯酰胺三种组分，并且三种组分通过主-客体包结配位相互作用构筑超分子组装体；该超分子纳米胶束可用于疏水性染料或药物分子的载入和控制释放。而乏氧这一刺激响应因子作为一种新的刺激因素，恰正是肿瘤细胞中最为重要的指标，这是由于唯有乏氧情况的变化表征着肿瘤生长进程。针对乏氧这一新的刺激因子而开发出的新型响应材料已有一部分报道。liuh等(liuh,zhangr,niuy,etal.rscadvances,2015,5(27):20848-20857.)将聚乙二醇-己硫醇和考布他汀a-4通过偶氮苯连接起来，形成纳米胶束，并包裹阿霉素，构筑了一个乏氧响应药物传递系统用于抗癌治疗。

综上所述，单种刺激不能作为复杂的生理系统的特性指标。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明结合肿瘤微环境，公开一种以偶氮键作连接键的具有乏氧、温度双重响应性两亲性嵌段聚合物及其制备方法，用作纳米载体进行抗癌药物的传送。基于此，利用偶氮键作为乏氧响应基团，结合原子转移自由基聚合这种先进的活性聚合方法，在偶氮苯两端分别引入聚乙二醇和2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)与寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯的无规共聚物，该无规共聚物具有低的临界溶解温度，从而制备具有乏氧、温度双重响应性的两亲性嵌段共聚材料，其可在水溶液中自组装形成纳米胶束，这在生物医学、纳米药物载体、诊断呈像等领域将具有广泛应用。

一种以偶氮键作连接键的具有乏氧、温度双重响应性两亲性嵌段聚合物，其特征在于结构式如下所示，分子量为10000～30000，左端是单甲氧基聚乙二醇，中间是偶氮键乏氧响应官能团，右端是温度响应性2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)与寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯的共聚物。

本发明提出的以偶氮键作连接键的具有乏氧、温度双重响应性两亲性嵌段聚合物的制备方法，其特征在于包括如下顺序的步骤：：

(1)将2-溴异丁酸溶解在溶剂a中，将此溶液逐渐滴加到对羟基偶氮苯、n,n’-二环己基碳二亚胺、催化剂b的溶剂a溶液中，反应温度为-10～5℃，反应时间为10～60分钟，将所得到的溶液在室温下搅拌12-36h，反应副产物通过真空过滤除去，溶剂经旋蒸除去，再将产物经柱层析纯化，淋洗剂选择乙醚和己烷的混合溶液，收集产物，在20～70℃的真空烘箱中干燥15～30h；

(2)将步骤(1)得到的产物、n,n'-二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶溶解在二氯甲烷与二甲基甲酰胺1：1～2的混合溶剂中，将羧基化的单甲基聚乙二醇逐滴加入该溶液中，反应在氮气保护下进行，反应温度为室温，反应时间为16～26小时，副产物通过真空抽滤除去，收集产物在沉淀剂c中进行沉淀，收集沉淀物并真空干燥；

(3)将步骤(2)得到的产物、2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)单体、寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯单体、配位剂n,n,n',n,'n”-五甲基二亚乙基三胺、催化剂溴化亚铜溶解在溶剂无水二甲基甲酰胺中，在冰水浴下，抽真空除氧气，并通入氮气，然后移去冰水浴，调节反应温度为60～100℃，反应时间为15～30小时，待冷却到室温后，将粗产物经透析纯化，冷冻干燥得到终产物。

本发明中，所述溶剂a为二氯甲烷、四氢呋喃、n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二乙基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜中的一种或几种；所述催化剂b为溴化亚铜/联吡啶、氯化亚铜/联吡啶、溴化亚铜/五甲基二乙烯基三胺、氯化亚铜/五甲基二乙烯基三胺、溴化亚铜/三(2-甲氨基乙基)胺、氯化亚铜/三(2-甲氨基乙基)胺、溴化亚铜/六甲基三亚乙基四胺、氯化亚铜/六甲基三亚乙基四胺、溴化亚铜/2-吡啶甲醛缩正丙胺、氯化亚铜/2-吡啶甲醛缩正丙胺中的一种或几种；所述沉淀剂c为环己烷、正己烷、乙醚中的一种或几种。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明采用的原料来源广泛，所用的对羟基偶氮苯、聚乙二醇和2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)单体、寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯单体、催化剂、溶剂等均可工业化生产，合成方法简单易行。并且，所用原料皆具有生物相容性、生物无毒性。合成的以偶氮键作连接键的具有乏氧、温度双重响应性两亲性嵌段聚合物材料具有乏氧和温度双重响应性，在乏氧环境与酶促作用下，偶氮键断裂，体现乏氧响应性，且其随着环境温度的不同而呈现不同的分子链形态，其临界溶解温度可以通过合成时改变2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)单体和寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯单体的投料比来调控。由于聚乙二醇具有亲水性，聚2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)-寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯具有疏水性，所以该嵌段共聚材料在水中可以自组装形成胶束，胶束粒径可以通过改变共聚物的链段长度进行调节。所得以偶氮键作连接键的具有乏氧、温度双重响应性两亲性嵌段聚合物在生物医学、纳米药物载体、诊断呈像等领域将具有广泛应用。

附图说明：

图1：实施例1制备的一种以偶氮键作连接键的具有乏氧、温度双重响应性两亲性嵌段聚合物的结构示意图。

图2：实施例1制备的一种以偶氮键作连接键的具有乏氧、温度双重响应性两亲性嵌段聚合物的h-nmr图。

图3：实施例1制备的一种以偶氮键作连接键的具有乏氧、温度双重响应性两亲性嵌段聚合物的药物释放效率图。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是限制本发明的范围。

该以偶氮键作连接键的具有乏氧、温度双重响应性两亲性嵌段聚合物材料的分子结构用核磁共振分析仪(nmr)测定。

实施例1：

(1)称取5.4g2-溴异丁酸，溶解在溶剂二氯甲烷中，将此溶液逐渐滴加到7.5g对羟基偶氮苯、7.05gn,n’-二环己基碳二亚胺、0.32g催化剂二甲基甲酰胺的二氯甲烷溶液中，反应温度为0℃，反应时间为30分钟，将所得到的溶液在室温下搅拌。反应副产物通过真空过滤除去，溶剂经旋蒸除去。再将产物经柱层析纯化，淋洗剂选择乙醚和己烷的混合溶液，收集产物，在50℃的真空烘箱中干燥15h；

(2)称取1.12g对羟基偶氮苯、0.65gn,n'-二环己基碳二亚胺、0.13g4-二甲氨基吡啶溶解在二氯甲烷与二甲基甲酰胺1：1的混合溶剂中，称取2.004g羧基化的单甲氧基聚乙二醇逐滴加入该溶液中，反应在氮气保护下进行，反应温度为室温，反应时间为24小时。副产物通过真空抽滤除去，收集产物在沉淀剂乙醚中进行沉淀，收集沉淀物并真空干燥；

(3)称取2.5g步骤(2)得到的产物、7.9g2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)单体、1.76g寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯单体、0.283g配位剂n,n,n',n,'n”-五甲基二亚乙基三胺、0.19g催化剂溴化亚铜溶解在溶剂无水二甲基甲酰胺中，在冰水浴下，抽真空除氧气，并通入氮气，然后移去冰水浴，调节反应温度为100℃，反应时间为30小时，待冷却到室温后，将粗产物经透析纯化，冷冻干燥得到终产物。

一种以偶氮键作连接键的具有乏氧、温度双重响应性两亲性嵌段聚合物的h-nmr图见附图2。

实施例2：

(1)称取5.0g2-溴异丁酸溶解在溶剂四氢呋喃中，将此溶液逐渐滴加到7.2g对羟基偶氮苯、6.98gn,n’-二环己基碳二亚胺、0.29g催化剂氯化亚铜的溶剂四氢呋喃溶液中，反应温度为5℃，反应时间为20分钟，将所得到的溶液在室温下搅拌12h，反应副产物通过真空过滤除去，溶剂经旋蒸除去，再将产物经柱层析纯化，淋洗剂选择乙醚和己烷的混合溶液，收集产物，在70℃的真空烘箱中干燥15h；

(2)称取0.93g对羟基偶氮苯、0.54gn,n'-二环己基碳二亚胺、0.09g4-二甲氨基吡啶溶解在二氯甲烷与二甲基甲酰胺1：2的混合溶剂中，称取1.84g羧基化的单甲氧基聚乙二醇逐滴加入该溶液中，反应在氮气保护下进行，反应温度为室温，反应时间为16小时，副产物通过真空抽滤除去，收集产物在沉淀剂乙醚中进行沉淀，收集沉淀物并真空干燥；

(3)称取2.0g步骤(2)得到的产物、7.54g2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)单体、1.72g寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯单体、0.376g配位剂n,n,n',n,'n”-五甲基二亚乙基三胺、0.17g催化剂溴化亚铜溶解在溶剂无水二甲基甲酰胺中，在冰水浴下，抽真空除氧气，并通入氮气，然后移去冰水浴，调节反应温度为80℃，反应时间为15小时，待冷却到室温后，将粗产物经透析纯化，冷冻干燥得到终产物。

实施例3：

(1)称取4.8g2-溴异丁酸溶解在溶剂n,n-二甲基甲酰胺中，将此溶液逐渐滴加到6.8g对羟基偶氮苯、6.65gn,n’-二环己基碳二亚胺、0.26g催化剂氯化亚铜的溶剂n,n-二乙基甲酰胺溶液中，反应温度为5℃，反应时间为40分钟，将所得到的溶液在室温下搅拌26h，反应副产物通过真空过滤除去，溶剂经旋蒸除去，再将产物经柱层析纯化，淋洗剂选择乙醚和己烷的混合溶液，收集产物，在50℃的真空烘箱中干燥24h；

(2)称取1.58g对羟基偶氮苯、0.72gn,n'-二环己基碳二亚胺、0.21g4-二甲氨基吡啶溶解在二氯甲烷与二甲基甲酰胺1：2的混合溶剂中，将2.14g羧基化的单甲氧基聚乙二醇逐滴加入该溶液中，反应在氮气保护下进行，反应温度为室温，反应时间为20小时，副产物通过真空抽滤除去，收集产物在沉淀剂环己烷中进行沉淀，收集沉淀物并真空干燥；

(3)称取2.4g(2)得到的产物、6.89g2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)单体、1.65g寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯单体、0.32g配位剂n,n,n',n,'n”-五甲基二亚乙基三胺、0.18g催化剂溴化亚铜溶解在溶剂无水二甲基甲酰胺中，在冰水浴下，抽真空除氧气，并通入氮气，然后移去冰水浴，调节反应温度为100℃，反应时间为15小时，待冷却到室温后，将粗产物经透析纯化，冷冻干燥得到终产物。

实施例4：

(1)称取4.6g2-溴异丁酸溶解在溶剂n,n-二甲基乙酰胺中，将此溶液逐渐滴加到对羟基偶氮苯、n,n’-二环己基碳二亚胺、催化剂氯化亚铜的溶剂n,n-二甲基乙酰胺溶液中，反应温度为5℃，反应时间为30分钟，将所得到的溶液在室温下搅拌20h，反应副产物通过真空过滤除去，溶剂经旋蒸除去，再将产物经柱层析纯化，淋洗剂选择乙醚和己烷的混合溶液，收集产物，在45℃的真空烘箱中干燥30h；

(2)称取1.84g对羟基偶氮苯、0.82gn,n'-二环己基碳二亚胺、0.24g4-二甲氨基吡啶溶解在二氯甲烷与二甲基甲酰胺1：1.5的混合溶剂中，将2.23g羧基化的单甲氧基聚乙二醇逐滴加入该溶液中，反应在氮气保护下进行，反应温度为室温，反应时间为26小时，副产物通过真空抽滤除去，收集产物在沉淀剂乙醚中进行沉淀，收集沉淀物并真空干燥；

(3)称取2.87g步骤(2)得到的产物、8.04g2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)单体、2.14g寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯单体、0.412g配位剂n,n,n',n,'n”-五甲基二亚乙基三胺、0.20g催化剂溴化亚铜溶解在溶剂无水二甲基甲酰胺中，在冰水浴下，抽真空除氧气，并通入氮气，然后移去冰水浴，调节反应温度为100℃，反应时间为24小时，待冷却到室温后，将粗产物经透析纯化，冷冻干燥得到终产物。

实施例5：

(1)称取5.8g2-溴异丁酸溶解在溶剂二氯甲烷中，将此溶液逐渐滴加到对羟基偶氮苯、n,n’-二环己基碳二亚胺、催化剂溴化亚铜的溶剂二甲基亚砜溶液中，反应温度为0℃，反应时间为60分钟，将所得到的溶液在室温下搅拌36h，反应副产物通过真空过滤除去，溶剂经旋蒸除去，再将产物经柱层析纯化，淋洗剂选择乙醚和己烷的混合溶液，收集产物，在70℃的真空烘箱中干燥20h；

(2)称取1.94g对羟基偶氮苯、0.91gn,n'-二环己基碳二亚胺、0.36g4-二甲氨基吡啶溶解在二氯甲烷与二甲基甲酰胺1：1的混合溶剂中，将2.4g羧基化的单甲基聚乙二醇逐滴加入该溶液中，反应在氮气保护下进行，反应温度为室温，反应时间为26小时，副产物通过真空抽滤除去，收集产物在沉淀剂正己烷中进行沉淀，收集沉淀物并真空干燥；

(3)称取2.61g步骤(2)得到的产物、8.12g2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)单体、2.26g寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯单体、0.45g配位剂n,n,n',n,'n”-五甲基二亚乙基三胺、0.24g催化剂溴化亚铜溶解在溶剂无水二甲基甲酰胺中，在冰水浴下，抽真空除氧气，并通入氮气，然后移去冰水浴，调节反应温度为70℃，反应时间为30小时，待冷却到室温后，将粗产物经透析纯化，冷冻干燥得到终产物。

以偶氮键作连接键的具有乏氧、温度双重响应性两亲性嵌段聚合物材料的结构式如图1所示。在温度低于33℃～37℃的乏氧环境中，胶束出现解离，药物进行有效释放，12h后释放速率为90～96％，见附图3。

上述描述仅是对本发明较佳实施例的描述，并非是对本发明范围的任何限定。任何熟悉该领域的普通技术人员根据上述揭示的技术内容做出的任何变更或修饰均应当视为等同的有效实施例，均属于本发明技术方案保护的范围。