本发明属于细胞免疫学领域，涉及重组全人源抗破伤风毒素单克隆抗体。
背景技术：
：破伤风(tetanus)是由于感染破伤风梭状芽孢杆菌(clostridiumtetani)而引起的急性、致死性的人畜共患神经系统疾病。破伤风梭状芽孢杆菌广泛存在于人、畜的肠道和土壤中，人群携带率高达25％，不同类型和大小的伤口均可成为破伤风梭状芽孢杆菌入侵的门户。当人被感染后，潜伏期内破伤风梭状芽孢杆菌在厌氧条件下于创口处大量繁殖并释放毒素，破伤风毒素通过破坏人体神经细胞而侵害中枢神经系统，导致机体痉挛、四肢强直、角弓反张等症状，最终使人因窒息或呼吸衰竭而死亡。在战争爆发和自然灾害频发时期，破伤风成为一项严峻的公共卫生问题，任何年龄人群均可能发生破伤风感染，死亡率为20-30％，重症患者以及新生儿的死亡率高达80％。破伤风毒素作用迅速，毒性很强。当患者被确诊为感染破伤风杆菌后，体内一般已存在大量细菌和毒素，使用抗菌素已不能挽救患者生命。预防和治疗破伤风的唯一有效的方法是及时注射抗破伤风毒素抗体中和毒素，并通过抗体受体的介导将毒素从体内清除。近年来出现越来越多关于人-鼠嵌合、人源和全人源抗破伤风毒素单克隆抗体的报道。利用b细胞筛选抗体工程技术对全人源单克隆抗体进行改造制备的基因工程抗体不仅消除了血清蛋白引起的过敏反应，而且克服了人源免疫球蛋白生产过程的弊端，具有较好的发展前景。采用基因重组技术，在基因水平上对抗体分子进行改造，形成嵌合抗体，即将鼠抗可变区基因与人igg恒定区链接；人源化抗体，即将鼠抗可变区的互补决定区移植入人igg的骨架区中，进一步降低了鼠抗引起的免疫反应；完全人源抗体，该类抗体不含任何外来基因，不会造成过敏反应，是目前基因工程抗体研究的热点之一。然而这些报道的抗体虽然能够与破伤风毒素结合，但中和毒素的效价不高，且抗体的产业化生产问题尚未解决。因此，利用先进的技术，制备一种高效安全的抗破伤风毒素单克隆抗体具有重要意义。技术实现要素：为了弥补现有技术的不足，本发明为了弥补现有技术的不足，本发明主要目的在于提供一种无免疫原性、亲和力高、特异性强、效价高的针对破伤风毒素的全人源单克隆抗体，以及编码的序列片段，生产的细胞株和应用进行诊断、预防或治疗的方法和用途。本发明提供的抗体可广泛适用于各种人群，所述制备方法简单高效、适于标准化生产。第一方面，本发明提供了一种重组全人源抗破伤风毒素单克隆中和抗体，所述抗体包括选自下列的重链可变区(vh):(1)如seqidno.1所示的vhcdr1；(2)如seqidno.2所示的vhcdr2；和(3)如seqidno.3所示的vhcdr3；所述抗体包括选自下列的轻链可变区(vl):(1)如seqidno.4所示的vlcdr1；(2)如seqidno.5所示的vlcdr2；和(3)如seqidno.6所示的vlcdr3；进一步，所述的抗体的重链可变区(vh)的氨基酸序列如seqidno.7所示；和/或轻链可变区(vl)的氨基酸序列如seqidno.8所示。进一步，所述抗体包含重链恒定区和/或抗体轻链恒定区的全部或者部分。进一步，所述抗体为全人源化抗体。在一个优选的实施方案中，所述抗体以小于大约10-5m，例如小于大约10-6、10-7、10-8、10-9或10-10m或更小的平衡解离常数与破伤风毒素解离。本发明所述的抗体还包括其功能性变异体。如果抗体的变异体可与本发明的抗体竞争以特异性结合破伤风毒素，则它们被认为是本发明的抗体的功能性变异体。具体地，如果功能性变异体可结合至破伤风毒素，且具有抗所述亚型或片段的中和活性，则该功能性变异体被认为是本发明的功能性变异体。功能性变异体包括(但并不限于)：在一级结构序列中基本类似、但包含本发明的亲本单克隆抗体中没有的例如体外或体内的化学和/或生物化学的改性的衍生物。这些改性包括例如乙酰化、酰化、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、交联、二硫键的形成、糖基化、羟基化、甲基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解处理、磷酸化等。可选择地，功能性变异体可为如下的单克隆抗体：与亲本单克隆抗体的氨基酸序列相比，包括含有一个或多个氨基酸的取代、插入、缺失或其组合的氨基酸序列。进一步地，功能性变异体可在氨基末端或羧基末端的其中一端或两端包括氨基酸序列的截短。与亲本单克隆抗体相比，根据本发明的功能性变异体可能具有相同或不同、较高或较低的结合亲和力，但仍能够键合至破伤风毒素或其片段。例如，与亲本单克隆抗体相比，根据本发明的功能性变异体对破伤风毒素或其片段可具有升高或降低的结合亲和力。优选地，包括但并不限于构架区域、高可变区域、尤其是cdr3区域的可变区域的氨基酸序列被改性。通常，轻链或重链区域包括三个高可变区域(包括三个cdr)和更保守的区域(所谓的构架区域(fr))。高可变区域包括来自cdr的氨基酸残基和来自高可变环的氨基酸残基。意于落入本发明的范围内的功能性变异体与本文所定义的亲本单克隆抗体具有至少大约50～99％、优选至少大约60～99％、更优选至少大约80～99％、甚至更优选至少大约90～99％、尤其至少大约95～99％，且特别至少大约97～99％的氨基酸序列同源性。可将本领域技术人员已知的计算机算法诸如gap或bestfit用于最优化地比对要对比的氨基酸序列，且定义相似或相同的氨基酸残基。可通过本领域已知的通用的分子生物学方法(包括pcr、寡核苷酸定点诱变(oligonucleotide-directedmutagenesis)和定点诱变(site-directedmutagenesis))改变亲本单克隆抗体或其部分，或通过有机合成方法获得功能性变异体。本发明的抗体还包括人源与非人源抗体，以及具有与本发明所述抗体相同功能或改造以及优化的一切抗体。第二方面，本发明提供了一种核酸分子，所述核酸分子包含编码本发明第一方面所述的抗体的核苷酸序列。第三方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包含本发明第二方面所述的核酸分子。本发明中的表达载体包括(但不限于)市场上可广泛买到的pcdna载体；f、r1、rp1、col、pbr322、tol、ti载体；粘粒；噬菌体；植物病毒等。本发明中可使用本领域技术人员已知的各种表达载体的任意一种，且表达载体的选择依赖于所选择的宿主细胞的性质。宿主细胞中载体的导入可通过(但并不限于)磷酸钙转染、病毒感染、deae-葡聚糖介导的转染、脂质体转染或电穿孔实现，且本领域的任何技术人员可选择和使用适用于所用的表达载体和宿主细胞的导入方法。优选地，上述载体包含一种或多种选择标记，但并不限于此，且还可使用不包含选择标记的载体。选择标记的选择可依赖于选择的宿主细胞(如本领域的技术人员公知的)，但这对于本发明并不是关键性的。为了促进本发明的核酸分子的纯化，可将标签(tag)序列插入表达载体中。标签的实例包括(但不限于)六个组氨酸标签、血凝素标签、myc标签或flag标签。可在本发明中使用本领域的技术人员已知的促进纯化的任何标签。第四方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如第二方面所述的核酸子和/或如第三方面所述的表达载体。可用于本发明的宿主细胞包括但不限于微生物，例如可以是经含有抗体编码序列的重组噬菌体dna、质粒dna或粘粒dna表达载体转化的细菌(大肠杆菌(e.coli)、枯草芽孢杆菌(b.subtilis))；经含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母菌(酵母属(saccharomyces)、毕赤酵母属(pichia))；经含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；经重组病毒表达载体(花椰菜花叶病毒(camv)、烟草花叶病毒(tmv))感染的或经含有抗体编码序列的重组质粒表达载体(ti质粒)转化的植物细胞系统；或携带含有来源于哺乳动物细胞基因组的启动子(金属硫蛋白启动子)、来源于哺乳动物病毒的启动子(腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5k启动子)的重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(cos、cho、bhk、293、3t3细胞)。在本领域中可使用本领域的技术人员已知的可用作哺乳动物宿主细胞的任何细胞。进一步，还提供了制备本发明的抗体的方法，其包括，在合适的条件下培养本发明的宿主细胞，和从细胞培养物中回收本发明的单克隆抗体。进一步，所述制备方法包括如下步骤：(1)采集注射了破伤风疫苗的志愿者的血液样本；(2)分离外周血单个核细胞(pbmc)；(3)利用流式细胞仪进行pbmc细胞分选，首先去除细胞碎片、黏连细胞和死细胞，通过荧光抗体染色特异性标记荧光素的抗原得到靶细胞。(4)利用单细胞rt-pcr扩增步骤(2)获得的单个b细胞中的抗体轻链和重链可变区的核苷酸片段；(5)将步骤(3)获得的抗体轻链和重链可变区的核苷酸片段融合到含有人类抗体恒定区的表达载体中形成重组表达载体，之后导入宿主细胞表达；(6)筛选获得具有结合活性和中和活性的本发明的抗体。第五方面，本发明提供了一种用于治疗或预防破伤风的药物组合物，所述药物组合物包括有效量的本发明的结合分子。本发明还提供了一种包括前面所述抗体的破伤风毒素检测产品。所述检测产品包括但不限于检测试剂、试剂盒、芯片或试纸。凡是包括前面所述结合分子的能够检测出破伤风毒素的检测产品均包括在本发明的范围之内。本发明还提供一种非诊断目的的检测破伤风毒素水平的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)获取含有破伤风毒素的样品；(2)将步骤(1)获取的样品与第一方面所述的抗体接触；(3)检测样品与抗体的结合情况。本发明还提供了前面所述的抗体在制备破伤风毒素检测产品中的应用。本发明还提供了前面所述的抗体在制备所述的药物组合物中的应用。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：(1)本发明的中和抗体对破伤风毒素具有很强的结合活性和亲和力；(2)本发明的中和抗体纯度高、无免疫原性、成分清晰，不存在病原体污染等潜在风险；(3)本发明的制备中和抗体的方法标准可控、成本低廉、简单高效、适于标准化生产。附图说明图1为本发明trn1014抗体的sds-page图，其中，第1泳道为非还原的抗体，第2泳道为蛋白分子量，第3泳道为还原的抗体；图2为本发明trn1014抗体与破伤风标准毒素的中和活性检测结果图；图3为本发明trn1014抗体与破伤风标准毒素的亲和活性检测图；图4为本发明trn1014抗体在20倍ld50剂量下在小鼠体内的中和试验结果图。具体实施方式为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。实施例使用的术语“kd”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。通常，抗体以小于10-5m的解离平衡常数(kd)与抗原结合，例如可以小于10-6m、10-7m、10-8m、10-9m或10-10m，kd采用表面等离子体共振术(spr)利用biacore仪测定。实验材料(1)健康志愿者注射1500iu破伤风类毒素疫苗后，分别于第0、14和21天采集血液样本15ml，抗凝；(2)试剂：破伤风疫苗，ficoll淋巴细胞分离液(cedarlane公司)，tat-fitc，tat-fitc-isotype，引物(invitrogen)，superscriptiii反转录酶，hotstartaqplus酶(invitrogen，carlsbad，ca)，琼脂糖，tris，lb培养基，氨苄青霉素，polyfect转染试剂(qiagen，valencia，ca)，fcs，dmem培养基，pbs缓冲液，bsa，hbsag试剂盒等；(3)载体：pcdna3.3；(4)菌株：大肠杆菌dh5α；(5)细胞：293t。实施例1单个核细胞分离和浆细胞分选(1)分别于第0、14和21天从注射了1500iu破伤风类毒素疫苗的健康志愿者的血液中采集15ml血液样本于含有肝素的抗凝管中，用ficoll分离，吸取单个核细胞(pbmc)层悬液，用pbs洗涤3次，吸弃上清；(2)用40μm滤膜过滤，细胞计数后利用bdfacsria流式细胞仪从pbmc分选出目标细胞群，挑选形态完好的单个细胞置于96孔pcr板中(每孔20μl单细胞裂解液)，使每个孔含有一个b细胞，-80℃冰箱保存备用。实施例2利用rt-pcr从单个b细胞中分离抗体可变区基因(1)rt-pcr：向含有单个b细胞的96孔板中加入0.5μm不同亚型重链与轻链的恒定区引物(引物采用常规方法在特定位点设计)和superscriptiii反转录酶，37℃孵育1小时，按以下条件进行pcr扩增：95℃15min；95℃1min，55℃1min，72℃1min，30个循环；72℃10min；4℃5min；获得的产物cdna于-20℃保存；(2)pcr：50μl体系中含有5μl反转录产物、hotstartaqplus酶、dntps、和0.5μm的不同亚型重链与轻链可变区的特异性引物(引物采用常规方法在特定位点设计)，按以下条件进行pcr扩增：预变性94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃50s，35个循环；72℃7min；获得的pcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。实施例3构建重组抗体的表达载体将凝胶电泳鉴定为阳性、且重链与轻链可匹配成对的抗体可变区基因的pcr产物利用ta克隆的方法连接到pcdna3.3载体上，构建抗破伤风毒素全人源单克隆抗体的表达载体，然后将表达载体转化dh5α感受态细菌，在含有氨苄青霉素的平板上37℃培养过夜，挑取10个单菌落用特异性引物进行pcr，反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸100s，28个循环；72℃延伸5min。取5μlpcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。结果显示，在阳性转化子中鉴定出了含有抗体重链和轻链基因的转化子。实施例4抗体表达将阳性质粒转化dh5α进行大量扩增，快速提取重组质粒后，与转染试剂polyfect共转染293细胞，转染后6-8小时换大量新鲜培养基，并在37℃8％co2培养箱中培养96小时，收集细胞上清进行检测。实施例5表达抗体的筛选检测利用包被液将破伤风类毒素10倍稀释后，向96孔elisa板加入100μl/每孔，4℃过夜包被，封闭液常温封闭2小时；加入100μl瞬时转染上清(一抗)37℃孵育2小时，再加入hrp/anti-his-tag(1:2000稀释，二抗)37℃孵育1小时，加入底物显色液100μl/孔，常温避光放置5min后，用2m硫酸中止反应，在450nm波长下进行比色检测。实施例6抗体的表达与纯化将中和实验鉴定的有中和活性的抗体重链与轻链的表达载体(其中，重链可变区的氨基酸序列如seqidno:7所示，轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:8所示)共转染293细胞，转染后6-8小时换大量新鲜培养基，并在37℃8％co2培养箱中培养96小时；收集转染上清，4000rpm离心1小时，利用蛋白a亲和层析法进行纯化；利用sds-page检验抗体的表达及纯化情况。结果如图1所示，得到蛋白纯度高，可清晰观察到解链后的轻链和重链。共转染表达质粒载体的293细胞成功表达全人源抗体，能有效识别破伤风类毒素抗原，而未转染表达质粒的293细胞培养上清不能识别破伤风类毒素抗原，即瞬时转染293成功表达了能特异性识别破伤风类毒素的抗破伤风毒素全人源抗体。实施例7单抗中和活性检测用前文提到的相同的elisa方法对表达纯化的抗体的中和活性进行检测：利用包被液将破伤风类毒素10倍稀释后，向96孔elisa板加入100μl/每孔，4℃过夜包被，封闭液常温封闭2小时；加入100μl表达纯化的抗体作为一抗，37℃孵育2h，再加入hrp/anti-his-tag(1:2000稀释)作为二抗37℃孵育1h，加入底物显色液100μl/孔，常温避光放置5min后，用2m硫酸中止反应，用450nm波长下进行比色检测。结果如图2所示，稀释浓度大于50,000倍的trn1014抗体(抗体浓度约为0.0005μg/ml)依然可以与抗原中和，具有极强的中和活性。实施例8单抗亲和活性检测抗体亲和力测试采用捕获法，缓冲液为hbs-ep，cm5芯片先用proteina进行偶联。然后稀释捕获抗体使其浓度为1μg/ml，结合时间为50s。将分析物破伤风素素以逐渐增高的浓度依次流过芯片，分别得到信号曲线。每个浓度作为1个循环，完成1次循环后用3mmgcl2再生芯片以回复到原始未捕获抗体的状态，再生时间为30s。用biacorex-100system软件对得到的信号曲线进行分析，得到本发明实施例提供的中和抗体与破伤风毒素的亲和活性检测图。结果如图3和表1所示，全人源抗破伤风毒素中和抗体的平衡常数(kd)达1.10e-9m，表明该抗体对破伤风毒素具有很高的亲和力；其解离常数(kd)为6.07e-05s-1，解离的速率(kd)达5.51e+04ms-1，表明了该抗体与破伤风类毒素(抗原)结合具有很好的稳定性。表1全人源抗破伤风毒素单克隆抗体的亲和力测定结果抗体名称ka(1/ms)kd(1/s)kd(m)trn10145.51e+046.07e-051.10e-0.9实施例9体内中和试验(1)半数致死量(ld50)的测定按照2015版《中国生物制品规程》制备标准抗毒素和毒素稀释，将配制好的毒素用稀释液进行梯度稀释(10,20,40,80,160,320,640,1280,2560,5120和10240倍)，取0.2ml注射小鼠，每组4只，观察5天，根据实验结果计算出ld50，实验组使用20倍×ld50量。(2)单抗效价测定用稀释液将待检单抗稀释成100μg/ml(单抗浓度＞1mg/ml)，即与毒素等量混合后每0.4ml注射量中单抗的浓度为50μg/ml。混合定量吸取已稀释的标准抗毒素和待检单抗分别装入小试管中，每管加入等量之稀释试验毒素，混合均匀，加塞，37℃孵育1小时，立即注射。取28只体重为18-22g的健康实验小白鼠，每组4只，分为7组。将混合物(空白对照组包括0.2ml毒素(toxin20ld50)；阴性对照组包括0.2ml毒素+0.2ml硼酸盐缓冲盐水(20ld50+pab)和阴性抗体对照组(20ld50+trn006)；阳性对照组包括0.2ml毒素+0.2ml抗毒素；实验组包括0.2ml毒素+0.2ml单抗(20ld50+trn1014))皮下注射小白鼠腹部，每只注射0.4ml。每日上、下午各观察一次，连续一周，记录小白鼠发病与死亡情况。结果如图4所示，阴性对照组和阴性抗体的小白鼠于48小时之内全部死亡，在20倍半数致死量(ld50)的毒素攻击下，50μg/ml剂量的单抗实验组小鼠全部存活。表明当本发明的单抗在50μg/ml剂量时，与标准抗毒素的效价(10iu/ml)相当，能有效保护动物防御致死剂量破伤风毒素的攻击，与标准抗毒素的保护性基本一致。同时，本发明单抗的实际用量远远低于标准抗毒素，表明本发明的全人源抗破伤风毒素单克隆抗体具有极强的效价作用。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属
技术领域：
的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。sequencelisting<110>暨南大学珠海泰诺麦博生物技术有限公司广州泰诺迪生物科技有限公司<120>重组全人源抗破伤风毒素单克隆抗体<130>20180427<160>8<170>patentinversion3.3<210>1<211>8<212>prt<213>人工合成<400>1glyphethrpheargasntyrtrp15<210>2<211>8<212>prt<213>人工合成<400>2ilelysaspaspglythrgluser15<210>3<211>20<212>prt<213>人工合成<400>3thrargvalglyglyphetyrpheglysergluargtyrtyrlysgly151015glyaspaspval20<210>4<211>6<212>prt<213>人工合成<400>4glnthrileserasntyr15<210>5<211>3<212>prt<213>人工合成<400>5alaalaser1<210>6<211>9<212>prt<213>人工合成<400>6glnglnsertyrserserproargthr15<210>7<211>127<212>prt<213>人工合成<400>7gluvalglnleuvalgluserglyglyaspleuvalproproglygly151015serleuargleusercysvalalaserglyphethrpheargasntyr202530trpmetasntrpvalargglnalaproglyglnglyleuglntrpval354045alaserilelysaspaspglythrgluserglntyrleugluserval505560lysglyargphethrileserargaspasnalalysasnserleuser65707580leuglnmetaspserleuargalagluaspthralaleutyrphecys859095thrargvalglyglyphetyrpheglysergluargtyrtyrlysgly100105110glyaspaspvaltrpglyglnglythrthrvalthrvalserser115120125<210>8<211>107<212>prt<213>人工合成<400>8aspilevalleuthrglnserproserserleuseralaservalgly151015aspargvalthrphethrcysargalaserglnthrileserasntyr202530leuhistrptyrglnglnlysproglyglnalaprogluleuleuile354045phealaalaserasnargglnglyglyvalproserargphearggly505560serglyserglythraspphethrleuthrileserproleugluala65707580aspaspphealathrtyrtyrcysglnglnsertyrserserproarg859095thrpheglyglnglythrlysleugluilelys100105当前第1页12