促内皮细胞成血管的外泌体活性制剂及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物医药领域，具体涉及促内皮细胞成血管的外泌体活性制剂及其制备方法和应用。
背景技术：
微循环是微动脉与微静脉之间毛细血管中的血液循环,是循环系统中最基层的结构和功能单位，它包括微动脉,微静脉,毛细淋巴管和组织管道内的体液循环。人体每个器官,每个组织细胞均要由微循环提供氧气,养料,传递能量,交流信息,排除二氧化碳及代谢废物，一旦人体的微循环发生障碍,其相应的组织系统或内脏器官就会受到影响而不能发挥正常功能,就容易导致人体的衰老,免疫功能的紊乱以及疾病的发生。微循环障碍是疾病发生和发展的重要病理生理学基础。微循环功能是保证人体脏器发挥正常功能的首要前提，医学已证明：微循环发生障碍会使很多人处于亚健康状态，肿瘤、高血压、糖尿病及许多心脑血管等重大慢病均与微循环障碍有关，因此微循环功能也是人体是否健康的重要标志。故此，改善微循环能够从机体整体的角度提高对疾病治疗的疗效，以及能够通过改善微循环纠正微循环障碍达到辅助治疗疾病的目的。微循环障碍治疗法能迅速改善全身组织的供血供氧功能，降低血脂和血粘度，增加新陈代谢，提高机体免疫力，对心脑血管病、高脂血症等多种疾病有显著的疗效。治疗心梗和脑卒中的基本原则又在于梗死后的侧支通路再建，而侧支的再建主要取决于血管的新生。随着细胞外泌体的研究日益深入，外泌体药物制剂越来越成为疾病治疗研究的热点，外泌体(exosomes)是一种由活细胞分泌并释放到胞外环境中、大小在60--100nm的运输膜泡。外泌体以其天然的物质转运特性、相对较小的分子结构和优良的生物相容性,可递送化学药物、蛋白质及肽配基和基因药物等多种药物,在药物载体的领域具有巨大的潜力。近年来,作为天然的胞间信息载体的外泌体,以其相对较小的分子结构、天然的分子转运特性和良好的生物相容性,在药物载体领域具有巨大的应用潜力。对于药物载体的选择,有两个基本原则:保护内含的药物在体内环境中仍保持活性；在不引发机体对药物载体产生免疫反应的情况下释放内含物。较之现有的药物载体(如人工制造的脂质体),外泌体有其显著的优越性。首先,外泌体有自身天然的内含物,可以转移至受体细胞并功能性改变受体细胞,且不同来源的外泌体表面分子不一样,对受体细胞有一定选择性,在治疗上更有利。其次,相对于脂质体对亲水性物质较低的包装效率,其在递送核酸方面受到限制,而外泌体可以更好地亲和核酸分子,显著提高包装效率。外泌体免疫原性低能够避免与调理素蛋白、抗体、凝血因子等产生相互作用,从而避免了体内产生免疫反应。采用外泌体药物改善微循环就越发具有优势，因为微循环是遍布机体的微小血循环，经血液循环的外泌体药物更容易达到血管细胞，达到治疗目的。心脑血管疾病中，伴随着产生肿瘤坏死因子(tnf-α)等影响血管新生的炎性因子产生，能够在tnf-α等炎性因子环境下形成新的微血管是缺血治疗中的重要内容。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是提供促内皮细胞成血管的外泌体活性制剂及其制备方法和应用。本发明解决上述技术问题的技术方案如下：促内皮细胞成血管的外泌体活性制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)分离原代脐带静脉内皮细胞并进行细胞培养及传代；(2)向传代培养的内皮细胞培养液中加入山莨菪碱对内皮细胞进行预处理，然后更换新的内皮细胞培养液继续培养内皮细胞；(3)自内皮细胞培养后得到的内皮细胞培养液中提取外泌体；(4)外泌体鉴定。进一步，所述传代培养的内皮细胞为3-5代内皮细胞。进一步，所述内皮细胞培养液为基础培养基中添加无外泌体胎牛血清、青霉素、链霉素和内皮生长因子至终浓度分别为0.05mg/ml、0.01mg/ml、0.01mg/ml和0.01mg/ml。进一步，步骤(2)中加入山莨菪碱后的内皮细胞培养液中，所述山莨菪碱的浓度为1.5×10-2―1.5×10-3ng/ml，加入山莨菪碱后，处理的时间为3-5小时，所述内皮细胞更换新的内皮细胞培养液后继续培养的时间为18-30小时。进一步，所述步骤(3)中提取外泌体的具体步骤为：收集步骤(2)中内皮细胞培养后的内皮细胞培养液上清，300g、4℃、离心10分钟，取上清液，16500g、4℃、离心20分钟，取上清液经0.2μm孔径滤膜过滤，取滤液经120000g、4℃、离心2小时，去上清，将沉淀溶于0.01m的pbs缓冲液。进一步，所述所述步骤(4)中外泌体的的鉴定包括观察外泌体透射电镜形态，分析外泌体粒径及外泌体蛋白定量。进一步，本发明提供了用以上制备方法制得的促内皮细胞成血管的外泌体活性制剂。本发明的有益效果是：用本发明制备方法制得的外泌体能够促进内皮细胞成血管，且制备方法简单。进一步，本发明提供了促内皮细胞成血管的外泌体活性制剂在制备治疗微血管损伤、微循环障碍和心脑梗塞药物中的应用。采用上述进一步方案的有益效果是促进内皮细胞成血管对于微循环的改善有重要作用，微循环改善对于心脑血管疾病等有显著疗效，且外泌体药物相比普通药物对受体细胞有一定的选择性且递送效率更高。附图说明图1a和图1b为本发明实验组n外泌体透射电镜图，其中图1a中的标尺为200nm，图1b中的标尺为100nm；图2a和图2b为本发明用apogee纳米流式细胞仪散射光通道检测外泌体的粒径结果，检测时的设门范围为50～110nm,其中图2a为180nm、240nm、300nm、590nm、880nm和1300nm标准微球混合物的检测结果直方图，图2b为本发明实验组n外泌体检测结果直方图；图3a、图3b、图3c为本发明成血管实验在倒置共聚焦显微镜下的成血管图，其中图3a为对照组con成血管图，图3b为tnf-α组成血管图，图3c为tnf-α+nexo组成血管图；图4为本发明成血管实验使用imagej软件测量每个视野内血管总分支长度结果图。具体实施方式以下结合附图及具体实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例1原代内皮细胞培养及传代培养采集健康产妇脐带，以胶原酶消化方法分离得到原代脐带静脉内皮细胞，进行原代细胞培养。内皮细胞培养液配制方法：内皮细胞基础培养液中加入无外泌体胎牛血清、内皮细胞生长因子、青霉素和链霉素，其中无外泌体胎牛血清、内皮生长因子、青霉素和链霉素的终浓度分别为0.05mg/ml、0.01mg/ml、0.01mg/ml和0.01mg/ml；细胞培养器材：培养瓶、培养皿和培养板，细胞培养条件：无菌、37℃、5％co2、饱和湿度，隔天换液。将原代内皮细胞培养2～3天进行传代，细胞传代消化液包括0.25％胰蛋白酶和0.02％edta。取出细胞培养瓶，拧紧瓶盖，倒置显微镜下观察细胞状态和汇合度，在超净工作台中进行接下来操作，吸弃旧培养基，加入少许pbs润洗两遍，以去掉残留培养基中的血清，吸弃pbs，再加入适量消化液，以覆盖细胞单层为宜，倒置显微镜下观察消化进度，待细胞回缩变圆，呈球状后即吸弃消化液；加入适量完全培养基以中和残留消化液，吸管吹打均匀，倒置显微镜下观察消化后情况；按1:2～1:3比例分瓶传代，并分别补足完全培养基的量，然后拧紧培养瓶盖，将细胞铺散均匀，然后拧松培养瓶半圈，置于co2培养箱中正常培养。实施例2外泌体制备实验分为三组，分别为对照组c和实验组n。取3～5代的内皮细胞至10cm培养皿生长至汇合，其中对照组以内皮细胞培养液培养24小时，实验组n在培养液中加入浓度为1.5×10-2―1.5×10-3的山莨菪碱处理4小时，吸弃上清以去除山莨菪碱，加入内皮细胞培养液继续培养24小时。本实施例中山莨菪碱为购自杭州民生药业有限公司的消旋山莨菪碱片。实施例3外泌体提取纯化收集最后内皮细胞培养的上清液，300g、4℃、离心10分钟，取上清液，16500g、4℃、离心20分钟，取上清液经0.2μm孔径滤膜过滤，取滤液经120000g、4℃、离心2小时，去上清，将沉淀溶于100μl0.01m的pbs缓冲液，得到促内皮细胞成血管的外泌体活性制剂。实施例4采用透射电镜观察外泌体形态，结果如图1a和1b所示，实验组得到的外泌体为形态均一的直径略小于100nm且具有清晰膜的茶杯托样结构的小体，为典型外泌体透射电镜形态。采用apogee纳米流式细胞仪散射光通道检测外泌体粒径，结果如图2a和2b所示，图2b显示得到的外泌体在50-110nm设门范围内只有一个峰，表明得到的外泌体纯度较高，没有杂质。采用bca方法进行外泌体蛋白定量，结果如表1所示，实验组产生的外泌体浓度略低于对照组外泌体的浓度。对照组c实验组n检测浓度(μg/μl)0.1450.047原浓度(μg/μl)1.4510.470表1实施例6不同来源外泌体成血管能力实验使用包被基底膜提取物(bme)的96孔板检测人脐静脉内皮细胞(huvecs)的成管能力。每孔加50μl的bme溶液，在细胞培养箱内37℃放置30min形成胶状物。每孔接种10000个内皮细胞，内皮细胞培养基体积为100μl，实验分为3组：对照组con仅接种细胞不做特殊干预培养；tnf-α组：内皮细胞培养液中加入10ng/mltnf-α干预培养；tnf-α+nexo组：内皮细胞培养液中加入10ng/mltnf-α同时加入实施例5中n组来源的浓度为25μg/ml的外泌体干预培养。每个组做3个重复。根据对成管形态的实时观察当上述各组干预处理至18小时时，各组成管形态均达到最佳观察和定量状态，在倒置共聚焦显微镜下拍照记录成管情况，如图3a、3b、3c所示，使用imagej软件测量每个视野的总分支长度作为评价成管能力的指标。结果显示，与con组相比，使用10ng/mltnf-α干预，可显著抑制内皮细胞成管(p＝0.002,图4)。在tnf-α干预的同时加入25μg/mln组来源的外泌体，可显著减轻tnf-α对内皮细胞成管的抑制(p＝0.037,图4)。tnf-α+nexo组与con组之间无统计学差异(p＝0.375,图4)。根据实施例5以及实施例6的实验结果表明，用实施例1-实施例4制备的外泌体具有促进内皮细胞成血管的作用，可以应用于治疗微血管损伤、微循环障碍和心脑梗塞药物中。以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12