本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种高效快速获取植物rna病毒末端序列的race方法。
背景技术：
race(rapidamplificationofcdnaends)技术是一种通过pcr克隆cdna序列末端的方法，cdna全长序列对基因结构、蛋白质表达和基因功能的研究至关重要。目前，市场上流通的商品化race试剂盒有以下缺点：1)对核酸纯度要求高，一般需用trizol法甚至核酸抽提试剂盒才能达到要求；2)受rna结构影响，需进行去磷酸化或去帽前处理，步骤较繁琐；3)实验需要多次纯化操作，大大降低了核酸的浓度和质量；4)对特异性引物要求较高，特异性目的条带不易获得；5)成本高。
race试剂盒高成本、程序复杂、低成效率的特点使国内大多数实验室对race技术望而却步，心有余而力不足，从而延缓了我国科学研究中rna完整序列的获得。
技术实现要素：
本发明的目的在于针对上述技术问题，提供一种低成本、程序简单、特异性高的高效快速获取植物rna病毒末端序列的race方法。
本发明实现其目的的技术方案为：
一种高效快速获取植物rna病毒末端序列的race方法，包括如下步骤：
1)感染目标病毒的植物的总rna抽提；
2)对提取的总rna加poly(a)尾；
3)对加poly(a)尾的rna进行提纯；
4)一步法rt-pcr：将加poly(a)尾提纯后的总核酸作为模板，上游通用引物为m4tm，使用软件设计目标病毒的特异性下游引物gsp1，利用引物m4tm和gsp1进行扩增，m4tm序列如seqidno:33所示；对rt-pcr的扩增产物进行纯化、连接、转化和克隆验证。
在上述技术方案中，还包括步骤5)巢式pcr：设计目标病毒巢式pcr下游引物gsp2，以步骤4)一步法rt-pcrpcr产物为模板，利用引物m4tm和gsp2进行巢式pcr，将目的条带纯化并进行连接、转化和克隆验证。当步骤4)扩增不出特异条带时就继续进行步骤5)。
所述步骤2)对提取的总rna加poly(a)尾的反应体系为：10mmatp4μl，polyapolymerse2μl，总rna5μg，10×polyareactionbuffe4μl，rnase-freeddh2o补齐到40μl；37℃反应30min。
所述步骤4)中的pcr反应程序为：55℃30min；94℃3min；94℃30s，x1℃45s，72℃y1s，35个循环；72℃7min；其中，退火温度x1由引物gsp1的tm值决定，延伸时间y1由扩增片段的长度决定，1kb/min。
所述步骤5)中的pcr反应程序为：95℃3min；95℃30s，x2℃45s，72℃y2min，30个循环；72℃10min；其中退火温度x2由引物gsp2的tm值决定，延伸时间y2由扩增片段的长度决定，1kb/min。
在上述技术方案中，采用步骤1)至4)进行race方法的植物rna病毒为柑橘衰退病毒或者柑橘囊胶病毒。
在上述技术方案中，采用步骤1)至5)进行race方法的所述植物rna病毒为柑橘叶斑病毒或者柑橘鳞皮病或者莴苣褪绿病毒或者苹果胶木病毒或者苹果黄症相关病毒或者柑橘黄化脉明病毒。
本发明的有益效果是：本发明的race-pcr方法是申请人首次建立的。总核酸即可作为模板，此方法利用rna病毒在植物体内呈双链结构的特质，同时直接在正负义链的3’序列末端加上poly(a)尾巴，通过常规一步法rt-pcr或者进一步的巢式pcr即可获得末端序列，5’和3’末端无区别操作，步骤较简单。实验中仅进行一次核酸洗涤纯化，保证了核酸的浓度和质量。另外，下游引物gsp设计要求较低：碱基gc含量为45％-55％且分布均匀，退火温度介于50-60℃之间即可。此方法特异性与成功率较其他方法高，所用试剂及试剂盒普遍易购得且价格低廉，成本大大低于使用市面race试剂盒成本。
附图说明
图1是1.5％凝胶电泳检测lcv的rna链的race结果图，其中，图a为一步法pcr产物，图b为巢式pcr产物。
图2是采用本发明方法获得的lcv末端核苷酸序列与ncbi中病毒已知序列比对图。
图3是1.5％凝胶电泳检测ccgav的rna链的第一次race-pcr产物。
图4是采用本发明方法获得的ccgav末端核苷酸序列与ncbi中病毒已知序列比对图。
具体实施方式
本发明所用材料和试剂来源如下：
polyapolymerse(货号：m0276l，biolabs公司)
10×polyareactionbuffer(货号：b0276s，biolabs公司)
musselglycogen(货号：r00551，thermoscientific公司)
one-steprt-pcrkitver.2试剂盒(货号：rr055a，takara公司)
2×taqmastermix(novoprotein公司)
实施例1本发明的高效快速获取植物rna病毒末端序列的race方法
本发明的高效快速获取植物rna病毒末端序列的race方法的操作步骤如下：
一、总核酸(tna，totalnucleotideacid)抽提
用ctab法提取感染目标病毒的植物叶片叶片总核酸tna或者使用trizol法或试剂盒提取rna。
二、rna加poly(a)尾
将装有植物总rna的pcr管置于冰上，加入以下物质并混匀：
反应条件为：37℃反应30min。
三、对加poly(a)尾的rna进行提纯
1)向上述反应液中加入60μlrnase-freeddh2o使体系为100μl(v)，转移至1.5ml离心管中；
2)加入100μl(v)氯仿/异戊醇(24:1)，1,3000rpm离心10min，吸取上清至新管中；
3)依次加入200μl(2v)100％乙醇、10μl(1/10v)3m醋酸钠溶液和2μl肌糖原(musselglycogen)，吹打混匀，置于-80℃冷冻30min(或-20℃保存2小时)；
4)1,3000rpm，4℃离心20min，弃上清；
5)加入500μl70％乙醇溶液，1,3000rpm，4℃离心2min；弃上清，短暂离心，吸弃上清。
6)将沉淀置于通风橱干燥10min，加入50μlrnase-freeddh2o溶解。
四、一步法rt-pcr
将加poly(a)尾提纯后的总核酸作为模板，上游通用引物为m4tm：5'-gtcacagtcacgactttttttttttttttttt-3'(seqidno:33)，使用软件dnaman设计目标扩增病毒的特异性下游引物gsp1，depc水溶解至浓度10μmol/l(后述引物反应浓度均为此浓度)，利用引物m4tm和gsp1进行扩增，反应程序参照one-steprt-pcrkitver.2试剂盒说明书进行，反应体系及参数如下：
将pcr管置于冰上，加入以下物质并混匀：
94℃预变性5min，迅速置于冰上冷却2min，瞬时离心后，加入以下物质：
pcr反应程序如下：
其中退火温度x1由引物gsp1的tm值(50-60℃为宜)决定，延伸时间y1由扩增片段的长度决定，1kb/min。
1.5％琼脂糖凝胶中电泳检测pcr产物，若有特异性目的条带则纯化进行连接、转化、克隆和测序；若无特异性目的条带，则进行下一个步骤五“巢式pcr”。
五、巢式pcr
设计目标病毒巢式pcr下游引物gsp2，以稀释100倍的步骤“四、一步法rt-pcr”的pcr产物为模板进行巢式pcr，向pcr管中加入以下物质并混匀：
pcr反应程序如下：
其中退火温度x2由引物gsp2的tm值(50-60℃为宜)决定，延伸时间y2由扩增片段的长度决定，1kb/min。
1.5％琼脂糖凝胶中电泳检测pcr产物。将特异性目的条带纯化并进行连接、转化和克隆，选取10个阳性克隆测序，验证是否为目标片段。
实施例2采用本发明方法获取不同植物rna病毒末端序列
采用实施例1的方法，获取了不同植物rna病毒的末端序列：
一、莴苣褪绿病毒(lettucechlorosisvirus，lcv)
根据深度测序(ngs)序列分析结果，设计lcv的race引物信息如表1，由于lcv有两条rna链，因此针对每条rna的5’和3’末端设计了相应的引物。
表1lcvrace-pcr所用引物序列
注：lcv-rna1-5'gsp1表示针对lcv的第一条rna链5’末端设计的gsp1，lcv-rna1-5'gsp2表示针对lcv的第一条rna链5’末端设计的gsp2，lcv-rna1-3'gsp1表示针对lcv的第一条rna链3’末端设计的gsp1，lcv-rna1-3'gsp2表示针对lcv的第一条rna链3’末端设计的gsp2。其余引物含义类推。
采用实施例1的方法进行扩增，发现一步法rt-pcr电泳条带(如图1a所示)特异性不强，巢式pcr后的条带(如图1b所示)较特异。
lcv基因组rna5'末端和3'末端阳性克隆的测序获得长度见表1，利用clcgenomicsworkbench9.5(qiagen)软件将测序结果与ncbi中病毒已知序列进行比对分析，可以清楚地看出(如图2所示)，通过此方法可以获得完整的lcvrna链的5'和3'末端序列。
二、柑橘囊胶病毒(citrusconcavegum-associatedvirus，ccgav)
根据深度测序(ngs)序列分析结果，设计ccgav的两条rna链的race引物，引物序列如表2所示。
表2ccgavrace-pcr所用引物序列
一步法rt-pcr即可得到较好的特异性电泳条带(如图3所示)。ccgav基因组rna5'末端和3'末端阳性克隆的测序获得长度见表2，利用clcgenomicsworkbench9.5(qiagen)软件将测序结果与ncbi中病毒已知序列进行比对分析，可以清楚地看出(如图4所示)，通过此方法可以获得完整的5'和3'末端序列。一步法rt-pcr即能得到ccgav的末端序列，不需要再进行下一步的巢式pcr。
三、柑橘鳞皮病(citruspsorosisvirus，cpsv)
根据深度测序(ngs)序列分析结果，设计cpsv的race引物如表3所示。采用本发明方法发现一步法rt-pcr即可得到较好的特异性电泳条带。
表3cpsvrace-pcr所用引物序列
cpsv基因组rna5'末端和3'末端阳性克隆的测序获得长度见表3，利用clcgenomicsworkbench9.5(qiagen)软件将测序结果与ncbi中已知cpsv序列进行比对，分析证明通过此方法可以获得cpsv的完整的5'和3'末端序列。四、柑橘叶斑病毒(citrusleafblotchvirus，clbv)
根据深度测序(ngs)序列分析结果，设计clbv的race引物如表4所示。一步法rt-pcr得到电泳条带具有好的特异性。
表4clbvrace-pcr所用引物序列
clbv基因组rna5'末端和3'末端阳性克隆的测序获得长度见表4，利用clcgenomicsworkbench9.5(qiagen)软件将测序结果与ncbi中已知clbv序列进行比对，分析证明通过此方法可以获得完整的5'和3'末端序列。
五、柑橘衰退病毒(citrustristezavirus，ctv)
根据深度测序(ngs)序列分析结果，设计ctv的race引物如表4所示。一步法rt-pcr得到电泳条带具有好的特异性。
表5ctvrace-pcr所用引物序列
ctv两个分离物基因组rna5'末端和3'末端阳性克隆的测序获得长度见表4，利用clcgenomicsworkbench9.5(qiagen)软件将测序结果与ncbi中已知ctv序列进行比对，分析证明通过此方法可以获得完整的5'和3'末端序列。
六、其它植物rna病毒
通过实验证明，此种race方法也可应用于苹果胶木病毒(applerubberywoodvirus，arwr)、苹果黄症相关病毒(apple-associatedluteovirus，aalv)、柑橘黄脉病(citrusyellowveinclearingvirus，cyvcv)，这三种病毒均采用了巢式pcr，均能得到目标条带。
序列表
<110>西南大学
<120>高效快速获取植物rna病毒末端序列的race方法
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