本发明属于生物化工和生物技术领域，具体涉及一种消除固定化脂肪酶过剩环氧基团的方法。
背景技术：
从20世纪60年代起，酶的固定化研究成为了酶工程领域中最为受关注的研究方向之一，与游离酶相比，固定化酶具有易分离回收、稳定性好、可重复多批次利用等优点，使生物酶的工业应用更为经济可行。酶的固定化方法有很多，常用的有吸附法、包埋法、交联法和共价结合法，其中共价结合法由于其固定化酶通常具有良好的稳定性和可重复利用率而受到了研究者们的青睐。
环氧树脂是一种人工合成的高分子聚合材料，具有多孔立体结构，且在较长的生产周期内具有很强的耐微生物、耐酸碱腐蚀作用和较强的机械性能；同时，环氧基团具有很高的活性和可塑性，在常温下就可以与酶蛋白表面的氨基酸残基(-nh2、-cooh、-hs等)发生温和的开环共价结合，将酶分子固定在载体表面，使得固定化操作简单方便，作为一种新型的固定化载体材料，被广泛应用于生物酶的固定化研究。
利用环氧树脂固定化生物酶，得到的固定化酶的酶活以及稳定性的影响因素有很多，主要包括两方面的操作。一方面，某些生物酶吸附固定后，由于酶和环氧树脂内部的结构有较大的差异，在短时间内并未形成多点共价链接，在碱性条件下孵育一段时间可形成牢固的多点共价链接，从而增加其温度稳定性。torresp等在利用环氧树脂固定化l-阿拉伯异构酶和d-葡萄糖异构酶固定时，两种固定化酶在ph＝8.5的缓冲液中孵育24h后，在50℃条件下的半衰期都有了显著的提高；mateoc等将在青霉素g酰基转移酶固定到eupergitc的试验中也得到了相类似的结果。另一方面，在生物酶的固定化过程中，载体内部的疏水微环境可以促进载体表面与蛋白质表面的接触，这是固定化生物酶所必须的条件，但在某些情况下，这种疏水微环境可能对酶的性质有强烈的负面影响。
目前，用于工业固定化的环氧树脂多为国外公司生产的如eupergitc、eupergitc250l、sepabeadsec-ep等，虽然取得了较好的固定化效果，但是其价格昂贵，难以大规模应用到工业生产中去。
技术实现要素：
本发明的目的是针对脂肪酶固定化过程中，环氧树脂载体过剩环氧基团的疏水作用对酶的性质产生负面影响的问题，提供一种消除固定化脂肪酶过剩环氧基团的方法，可以消除过剩的环氧基团，防止酶与载体继续发生疏水相互作用，从而消除这一负面影响。
本试验采用国产环氧树lxep-120固定化脂肪酶，对阻断脂肪酶与载体继续反应的孵育条件进行优化探索，考察氨基酸溶液的种类、浓度、ph，以及孵育的温度和时间这些因素，对固定化脂肪酶的酶活和温度稳定性的影响，提供性能更为优异的国产环氧树脂固定化脂肪酶。
本发明的第一个目的是提供一种消除固定化脂肪酶过剩环氧基团的方法，包括以下步骤：将固定化脂肪酶置于浓度为0.5～3m、ph为5.5～8.0的氨基酸溶液中，在20～50℃条件下孵育6～48h，然后洗涤、抽滤、干燥。
优选，所述的固定化脂肪酶是按照如下方法制备的：
用1.0mol/l的ph为6.0的磷酸钾缓冲液溶解脂肪酶酶粉制备浓度为2.0mg/ml的酶液，10000r/min离心12min后得到澄清酶液，按照5g：4ml的比例将型号为lxep-120的环氧树脂置于酶液中，在150rpm、22℃条件下固定化12h，然后用1.0mol/l的ph为6.0的磷酸钾缓冲液溶洗涤3次，抽滤，于40℃干燥，得到固定化脂肪酶。
优选，所述的氨基酸溶液为甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸溶液。
优选，所述的氨基酸溶液为浓度为2.5m、ph为7.0的甘氨酸溶液。
优选，所述的孵育温度为25℃、孵育时间为24h。
优选，所述的消除固定化脂肪酶过剩环氧基团的方法，包括以下步骤：
按1g：1ml的比例将固定化脂肪酶浸置于浓度为2.5m、ph为7.0的甘氨酸溶液中，150rmp，25℃条件下孵育24h，然后用1.0mol/l的ph为6.0的磷酸钾缓冲液溶洗涤，抽滤、干燥。
本发明的第二个目的是提供根据所述的消除固定化脂肪酶过剩环氧基团的方法制备得到的固定化脂肪酶。
本发明制备的固定化脂肪酶的酶活约为420u/g，酶活回收率约为93％，最反应适ph为8.0，最适反应温度为40℃。在稳定性方面，甘氨酸孵育后得到的固定化脂肪酶热稳定性显著提高，在80℃处理6h后仍保存60％左右的酶活，而相同条件下处理后的未经孵育的固定化脂肪酶只剩下45％左右的相对酶活；而ph稳定性、操作稳定性和储存稳定性与未孵育的固定化脂肪酶基本一致，在4℃条件下储存一个月后仍保持80％左右的酶活，该重复操作10次后，固定化脂肪酶的酶活力保留原来的70％左右。
附图说明
图1是不同氨基酸孵育对固定化脂肪酶酶活和热稳定性的影响；
图2是甘氨酸浓度对固定化脂肪酶酶活和热稳定性的影响；
图3是甘氨酸ph对固定化脂肪酶酶活和热稳定性的影响；
图4是孵育温度对固定化脂肪酶酶活和热稳定性的影响；
图5是孵育时间对固定化脂肪酶酶活和热稳定性的影响；
图6是固定化脂肪酶的最适反应ph；
图7是固定化脂肪酶的最适反应温度；
图8是固定化脂肪酶的ph耐受性；
图9是固定化脂肪酶的温度耐受性；
图10是固定化脂肪酶的操作稳定性；
图11是固定化脂肪酶的储存稳定性。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例中所采用的脂肪酶(acs号：001-62-1，植物来源脂肪酶)，购自深圳恒生生物有限公司。该脂肪酶可以水解甘油三酯等酯类生产甘油和脂肪酸，在食品、农业、制药和环保等领域具有重要的工业应用价值，可以催化甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应。
脂肪酶活力测定：①依次在试管中加入1.0ml橄榄油底物乳化液，1.25ml磷酸缓冲液(ph＝8.0)，于40℃恒温水浴5min。②迅速加入0.05g固定化脂肪酶，置于摇床中反应15min，反应条件为40℃，200r/min。③反应15min后迅速加入6mol/l的盐酸溶液0.5ml，95％的乙醇3ml终止反应，混合均匀后加入1.5ml异辛烷溶液，在涡旋振荡器上震荡90s，60℃水浴条件下静置10min，然后常温水浴中冷却5min。④移取0.5ml上层异辛烷溶液，加入异辛烷2ml，铜盐显色剂0.5ml，于涡旋振荡器震荡90s，然后室温静置直到上层溶液澄清。5○取上层澄清溶液100ul于酶标仪在714nm波长条件下测定吸光度。对照实验为底物反应15min后加入乙醇和盐酸溶液后，再加入相同体积的酶液，其它操作皆与实验组相同。
所述的橄榄油底物乳化液的配置：称取40gpva(聚合度为1750+50)，加入800ml去离子水，置于沸水浴中搅拌加热，直到全部溶解，除去少数不溶物质后冷却，然后定容到1000ml，得到4％的pva溶液。取30ml制备好的4％的pva溶液，加入10ml橄榄油，摇匀后用超声破碎仪分散10min。超声工作条件为：功率36％，工作6s，暂停4s。重复3次操作，得到乳白色的橄榄油底物乳化液。
实施例1：甘氨酸孵育的固定化脂肪酶的获得
首先制备得到固定化脂肪酶：
利用1.0mol/l的ph为6.0的磷酸钾缓冲液溶解脂肪酶酶粉制备浓度为2.0mg/ml的酶液，10000r/min离心12min后得到澄清酶液，准确称取5.0g型号为lxep-120的环氧树脂，置于4ml酶液中，在150rpm、22℃条件下固定化12h，然后用1.0mol/l的ph为6.0的磷酸钾缓冲液溶洗涤3次，抽滤，于40℃干燥，得到固定化脂肪酶。
1.1不同氨基酸孵育对固定化脂肪酶的影响
配置1.5mol/l的丙氨酸、丝氨酸和甘氨酸溶液，分别取一定体积的溶液(1ml/g固定化脂肪酶)加入到制备好的固定化脂肪酶中，放入25℃摇床中，150r/min条件下孵育24h。由图1可知，在相同条件下使用不同氨基酸溶液孵育固定化脂肪酶后，甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸孵育后得到的固定化脂肪酶的酶活与对照组相比基本没有损失。同时，经70℃保温处理6h后，这三个固定化脂肪酶的残余酶活基本保持相同。基于以上结果，结合经济角度以及氨基酸的溶解度考虑，选择甘氨酸作为孵育的溶液继续后续试验。
1.2甘氨酸浓度对固定化脂肪酶的影响
配置浓度为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0m的甘氨酸溶液，分别取一定体积的溶液(1ml/g固定化脂肪酶)加入到制备好的固定化脂肪酶中，放入25℃摇床中，150r/min条件下孵育24h。由图2可知，在不同浓度甘氨酸溶液中孵育24h后，其中甘氨酸浓度为2.5m时固定化脂肪酶有最大酶活，且此条件下制备的固定化脂肪酶同样也表现出较好的温度耐受性(70℃保温处理6h)。
1.3甘氨酸ph对固定化脂肪酶的影响
配置ph为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的甘氨酸溶液，分别取一定体积的溶液(1ml/g固定化脂肪酶)加入到制备好的固定化脂肪酶中，放入25℃摇床中，150r/min条件下孵育24h。由图3可知，利用中性或碱性(ph大于6.5)的甘氨酸溶液孵育固定化脂肪酶后，得到的固定化脂肪酶酶活较高，其中当ph＝7.0时最佳；利用中性酸性(ph小于7.5)的甘氨酸溶液孵育后，得到的固定化脂肪酶的温度耐受性(70℃保温处理6h)相对较好，其中当ph＝7.0时最佳。
1.4孵育温度对固定化脂肪酶的影响
配置2.5mol/l、ph为7.0的甘氨酸溶液，取一定体积的溶液(1ml/g固定化脂肪酶)加入到制备好的固定化脂肪酶中，分别置于20、25、30、35、40、45、50℃摇床中，150r/min条件下孵育24h。由图4可知，25℃条件下孵育后得到的固定化脂肪酶酶活最高，之后随着温度的上升，固定化脂肪酶逐渐失活，当温度超过40℃后酶活急剧下降。对于温度耐受性，在20～40℃条件下孵育得到的固定化脂肪酶没有较大差异；而当孵育温度高于40℃后，固定化脂肪酶在70℃下的耐受性显著增强。
1.5孵育时间对固定化脂肪酶的影响
配置2.5mol/l、ph为7.0的甘氨酸溶液，取一定体积的溶液(1ml/g固定化脂肪酶)加入到制备好的固定化脂肪酶中，放入25℃摇床中，150r/min条件下，分别孵育0、6、12、18、24、30、36、48h。由图5可知，在25℃条件下，孵育24h后得到的固定化脂肪酶酶活和温度耐受性都较好，且随着孵育时间的增加，固定化脂肪酶的温度耐受性(70℃保温处理6h)随之提高，但固定化脂肪酶的酶活也随之降低。
实施例2：甘氨酸孵育后固定化脂肪酶与未孵育固定化脂肪酶的酶学性质比较
按1g：1ml的比例将固定化脂肪酶浸置于浓度为2.5m、ph为7.0的甘氨酸溶液中，150rmp，25℃条件下孵育24h，然后用1.0mol/l的ph为6.0的磷酸钾缓冲液溶洗涤，抽滤、干燥，得到甘氨酸孵育后的固定化脂肪酶，酶活约为420u/g，酶活回收率约为93％。
2.1固定化脂肪酶的最适反应ph
40℃条件下，采用不同ph(6.0～10.0)的缓冲液测定甘氨酸孵育后的固定化脂肪酶和未孵育固定化脂肪酶的酶活，研究ph对其酶活力大小的影响。由图6可知，甘氨酸孵育后的固定化脂肪酶和未经孵育的固定化脂肪酶在不同ph缓冲液中的反应趋势基本一致，最适反应ph都是8.0，在ph为6.0～9.0范围内的相对酶活都在75％以上，说明甘氨酸孵育不改变固定化脂肪酶的对反应环境ph的敏感性。
2.2固定化脂肪酶的最适反应温度
在最适反应ph条件下，不同温度条件下测定甘氨酸孵育后的固定化脂肪酶和未孵育固定化脂肪酶的酶活，研究温度对其酶活力大小的影响。由图7可知，总体上固定化脂肪酶孵育前后在不同反应温度中的酶活变化趋势基本一致，最适反应温度都是45℃。但是当反应温度大于55℃之后，孵育后的固定化脂肪酶的相对酶活比未孵育的高，且随着温度的不断升高，这种趋势越明显。
2.3固定化脂肪酶的ph稳定性
分别将甘氨酸孵育后的固定化脂肪酶和未孵育的固定化脂肪酶放置在ph为4、5、6、7、8、9、10的0.5m的缓冲液中，室温处理6h，然后在最适反应条件下测定剩余酶活，对照组不做处理。由图8可知，两种固定化脂肪酶在不同ph缓冲液中都表现出良好的耐受性，在ph为5～9范围内处理6h后，都保持90％以上的相对酶活。其中孵育后的固定化脂肪酶在ph为8时耐受性最好，未孵育的固定化脂肪酶在ph＝7时耐受性最好。
2.4固定化脂肪酶的温度稳定性
称取一定质量的甘氨酸孵育后的固定化脂肪酶和未孵育的固定化脂肪酶，在40～80℃(间隔5℃)条件下处理6h，然后测定残余酶活，对照组是放置在4℃的固定化脂肪酶。由图9可知，相较于未经孵育的固定化脂肪酶，甘氨酸孵育后的固定化脂肪酶显示出良好的温度耐受性。在80℃处理6h后仍保存60％左右的酶活，而相同条件下处理后的未经孵育的固定化脂肪酶只剩下45％左右的相对酶活。说明甘氨酸孵育固定化脂肪酶可以提高固定化脂肪酶的温度耐受性。
2.5固定化脂肪酶的操作稳定性
称取一定质量的甘氨酸孵育后的固定化脂肪酶和未孵育的固定化脂肪酶，在40℃，
ph＝7.0条件下连续不间断反应10次，以第一次反应测得的酶活为100％。固定化脂肪酶的操作稳定性是衡量其是否具有工业使用价值的一个重要指标，因此试验比较了孵育后固定化脂肪酶和未孵育的固定化脂肪酶的操作稳定性。由图10可知，两种固定化脂肪酶的操作稳定性基本相似，在连续反应10批次后，酶活都保持在初始酶活的70％以上，说明甘氨酸孵育对固定化脂肪酶的操作稳定性没有负面影响。
2.6固定化脂肪酶的储存稳定性
将抽滤干燥后的固定化脂肪酶密封保存在4℃冰箱中，每隔一段时间测定其酶活(45℃、ph＝8.0)，以第一次反应测得的酶活为100％。由图11可知，两种固定化脂肪酶在4℃储存10天左右酶活基本没有损失，储存4周后保持80％以上的酶活，说明该固定化脂肪酶较易储存；同时，甘氨酸孵育不影响固定化脂肪酶的储存稳定性。