本发明涉及一种pimt(蛋白异天冬氨酰甲基转移酶，proteinisoaspartyl-methyltransferase,简称pimt)表达质粒，具体涉及一种pimt表达质粒的构建方法及所用扩增引物，以及其在用于制备治疗类风湿性关节炎的药物中的应用，属于基因工程技术领域。
背景技术：
生理条件下，蛋白质中的l-天冬酰胺酰残基(l-asparaginylresidues)和l-天冬氨酰残基(l-aspartylresidues)会自发的脱氨酰或异构化形成异常的l-天冬氨酰(abnormall-isoaspartylresidues，l-isoasp)，这种异常的l-isoasp在蛋白内集聚能改变蛋白质的结构并影响蛋白质功能。蛋白异天冬氨酰甲基转移酶(proteinisoaspartyl-methyltransferase,pimt)是普遍存在于原核细胞与真核细胞中的修复酶，在生理条件下能识别并转移s-腺苷-l-甲硫氨酸(s-adenosyl-l-methionine，adomet)中甲基基团至异常的l-天冬氨酰(l-isoaspartyl)残基中的游离羧基上，修复异常的l-天冬氨酰残基转变成正常的l-天冬氨酰，并恢复蛋白质的结构和功能。体外研究发现，衰老的钙调蛋白不能激活蛋白激酶的原因是l-天冬氨酰残基通过自发的脱氨酰作用转变成为异常的l-天冬氨酰，与pimt酶共孵育后，钙调蛋白的激活作用恢复。衰老的表皮生长因子、细菌荧光载体蛋白、阿尔茨海默尔-淀粉样蛋白、朊病毒蛋白和组织型纤溶酶原激活物等蛋白质中均被证实有异常的l-isoasp集聚和蛋白功能的改变，与pimt酶共孵育后，蛋白质的功能恢复。以上研究显示，pimt能识别并修复蛋白质肽链中异常l-isoasp残基，这种识别修复作用能影响蛋白质的功能。
人pimt基因由蛋白羧基邻甲基转移酶1(proteincarboxyl-o-methyltransferase-1，pcmt-1；ec2.1.1.77)基因编码。人pimt基因位于人染色体6q22.3～6q24上，全长1751bp，包含8个外显子。人pimt是由226个氨基酸组成的分子量为24500da的单体酶，其序列高度保守，含有三个s-腺苷-l-甲硫氨酸(adomet)识别区域，分别位于81～89，150～157和171～181位氨基酸上，n末端含有能被乙酰化修饰的丙氨酸。人pimt有两种亚型，pimt-ⅰ和pimt-ⅱ，二者的结构略有不同，但具有相似的底物特异性，对于位于细胞内的底物，具有相同的催化作用。
pimt基因缺失具有诱导细胞过度增殖和细胞凋亡的作用，研究发现，与正常的小鼠相比较，敲除pimt基因的小鼠其cd4+t淋巴细胞和脾细胞过度增殖，而将这种小鼠的骨髓移植给正常小鼠，会产生抗dna抗体和表现典型红斑狼疮肾炎的病理变化。而在肿瘤细胞中pimt基因的缺失也能引起细胞增殖。进一步的研究显示pimt修复异常l-isoasp残基功能对于维持正常的丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，mapk)信号传导系统十分重要，用sirna抑制pimt基因在hek-293细胞系中表达，会导致异常l-isoasp残基集聚，而用表皮生长因子刺激hek-293细胞，raf-1、mek1/2(mitogen-activatedproteinkinase)和细胞外调节激酶(extracellularregulatingkinase，erk)1/2这三个mapk信号系统级联分子都呈现高度磷酸化，而高磷酸化raf-1,mek1/2和erk1/2均能引起细胞增殖。以上研究结果提示：pimt基因缺失引起细胞增殖可能是通过mapk信号转导通路起作用的。有研究发现，在小鼠皮质神经元细胞和cos1细胞系中，pimt能够保护细胞抵御bax诱导的凋亡，pimt这种抗凋亡作用依赖其腺苷甲硫氨酸结合区域，而这个区域是在所有的甲基转移酶中是高度保守的。将重组pimt转染至内皮细胞中，能抑制由氧化应激诱导的凋亡，且pimt的保护作用是通过其甲基转移酶的功能，而不是其非酶修饰功能；进一步研究显示pimt保护细胞凋亡时的作用底物包括热休克蛋白70，热休克蛋白90，肌动蛋白actin和bcl-xl。以上研究显示：pimt通过其甲基转移酶的功能保护细胞抵御凋亡。
但是，目前尚未有任何关于将pimt表达质粒进行重组构建，用于类风湿性关节炎的治疗方面的报道。
技术实现要素：
本发明的主要目的在于提供一种pimt表达质粒，具体涉及一种pimt表达质粒的构建方法及所用扩增引物，以及其在用于制备治疗类风湿性关节炎的药物中的应用，以克服现有技术中的不足。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例提供了一种pimt表达质粒，其序列如seqidno:1所示。
本发明实施例还提供了一种携带有前述的pimt表达质粒的重组表达载体。
本发明实施例还提供了一种转化或转染有前述重组表达载体的宿主菌。
本发明实施例还提供了前述pimt表达质粒的构建方法，其包括：根据人源pcmt、mrna和pcdna3.1(-)-flag-gfp质粒提供的酶切位点，进行酶切位点选择，其中，所述pcmt的酶切位点包括xhoi和bamhi，获得重组的pimt表达质粒。
本发明实施例还提供了一种用于前述pimt表达质粒的扩增引物，所述扩增引物的序列分别如seqidno:2～seqidno:7所示。
本发明实施例还提供了由前述pimt表达质粒扩增得到的表达蛋白。
本发明实施例还提供了前述的pimt表达质粒或表达蛋白在调控类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis,ra)滑膜成纤维样细胞(fibroblast-likesynoviocytes，fls)的凋亡和增殖中的应用。
进一步地，本发明实施例还提供了前述的pimt表达质粒或表达蛋白在用于制备治疗类风湿性关节炎的药物中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果至少在于：
本发明通过基因技术构建了重组的pimt表达质粒，可使pimt在ra-fls中的表达量提高，检测量提高，有效调控ra-fls增殖，提高ra-fls细胞的抗侵袭能力，同时，本发明构建的重组pimt表达质粒是建立荧光定量pcr检测pimtmrna的基础，也是进一步研究类风湿性关节炎的基础；并且，本发明构建的pimt表达质粒和表达蛋白可作为药物，用于调控ra-fls的凋亡和增殖，实现对类风湿性关节炎的治疗，应用前景广泛。
附图说明
图1是本发明一典型实施方案中pcdna3_1-多克隆位点示意图。
图2是本发明一典型实施方案中pcdna3_1载体示意图。
图3a-图3b分别是本发明一典型实施方案中pimt在ra患者关节滑膜组织中的表达情况示意图。
具体实施方式
如前所述，鉴于现有技术的诸多缺陷，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案，其主要是通过基因技术构建一种重组的pimt表达质粒，并用于载药治疗类风湿性关节炎的技术方法，其原理在于pimt能够保护细胞抵御bax诱导的凋亡，pimt这种抗凋亡作用依赖其腺苷甲硫氨酸结合区域。
本发明实施例的一个方面提供的一种pimt表达质粒，其序列如seqidno:1所示。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种携带有前述的pimt表达质粒的重组表达载体。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种转化或转染有前述重组表达载体的宿主菌。
本发明实施例的另一个方面还提供了前述pimt表达质粒的构建方法，其包括：根据人源pcmt、mrna和pcdna3.1(-)-flag-gfp质粒提供的酶切位点，进行酶切位点选择，其中，所述pcmt的酶切位点包括xhoi和bamhi，获得重组的pimt表达质粒。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种用于前述pimt表达质粒的扩增引物，所述扩增引物的序列分别如seqidno:2～seqidno:7所示。
进一步地，所述扩增引物包括第一引物组、第二引物组和第三引物组，其中，所述第一引物组中用于xhoi位点的上游引物的序列如seqidno:2所示，用于bamhi位点的下游引物的序列如seqidno:3所示，所述第二引物组中用于xhoi位点的上游引物的序列如seqidno:4所示，用于bamhi位点的下游引物的序列如seqidno:5所示，所述第三引物组中用于xhoi位点的上游引物的序列如seqidno:6所示，用于bamhi位点的下游引物的序列如seqidno:7所示。
本发明实施例的另一个方面还提供了由前述pimt表达质粒扩增得到的表达蛋白。
本发明实施例的另一个方面还提供了前述的pimt表达质粒或表达蛋白在调控类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis,ra)滑膜成纤维样细胞(fibroblast-likesynoviocytes，fls)的凋亡和增殖中的应用。
进一步地，所述pimt表达质粒通过bax/bcl-2凋亡通路调控类风湿性关节炎滑膜成纤维样细胞的凋亡，所述pimt表达质粒通过mapk信号通路调控类风湿性关节炎滑膜成纤维样细胞的增殖。
进一步地，本发明实施例的另一个方面还提供了前述的pimt表达质粒或表达蛋白在用于制备治疗类风湿性关节炎的药物中的应用。
通过以上研究结果显示，本发明通过基因技术构建了重组的pimt表达质粒，可使pimt在ra-fls中的表达量提高，检测量提高，有效调控ra-fls增殖，提高ra-fls细胞的抗侵袭能力，同时，本发明构建的重组pimt表达质粒是建立荧光定量pcr检测pimtmrna的基础，也是进一步研究类风湿性关节炎的基础；并且，本发明构建的pimt表达质粒和表达蛋白可作为药物，用于调控ra-fls的凋亡和增殖，实现对类风湿性关节炎的治疗，应用前景广泛。
以下结合若干较佳实施例对本发明的技术方案作进一步的解释说明，但其中的实验条件和设定参数不应视为对本发明基本技术方案的局限。并且本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
pimt表达质粒的构建
选择homosapiensprotein-l-isoaspartate(d-aspartate)o-methyltransferase(pcmt1),mrna，(ncbireferencesequence:nm_005389.2)
扩增cds:74～757
根据homosapiensprotein-l-isoaspartate(d-aspartate)o-methyltransferase(pcmt1),mrna(ncbireferencesequence:nm_005389.2)和pcdna3.1(-)-flag-gfp质粒提供的酶切位点，进行酶切位点选择，只有xhoi和bamhi可以作为pcmt1的酶切位点，分别设计3对引物进行pcr扩增，并将产物送测序，可参阅图1和图2所示。
其中，引物组序列1分别为：
pcmt1-xhoi-684f：taactcgagaccatggcctggaaatccggcg
pcmt1-bamhi-684r：taaggatcctcacttccacctggaccactgc
引物组序列2分别为：
pcmt-xhoi-858-f：tatctcgagatgccgggagcgcgcagt
pcmt-bamhi-858-r：tgtggatcctcacttccacctggaccactg
引物组序列3分别为：
pcmt1-xhoi-855f：taactcgagaccatgccgggagcgcgcagt
pcmt1-bamhi-855r:taaggatcccttccacctggaccactgcttttctttatctg
经测序，3号引物扩增产物序列(即pcdna-pimt质粒序列)与genebank中的pimt序列基本一致，但在565bp处c转变为t，经blast比对，此处为snp位点(rs17355457)。
性能检测：pimt与类风湿性关节炎的关系
本案发明人经研究发现蛋白异天冬氨酰甲基转移酶(proteinisoaspartyl-methyltransferase,pimt)在类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis,ra)滑膜成纤维样细胞(fibroblast-likesynoviocytes，fls)中表达显著下降。
①ra患者体内pimt表达水平降低：与正常体检者比较，pimtmrna在ra患者的外周血单个核细胞内的表达明显降低(参见图3a，健康志愿者pimt的mrna表达明显高于ra患者的mrna表达，p<0.01)；对ra和oa患者关节滑膜组织的免疫组化结果显示pimt在ra患者关节滑膜组织中表达降低(参见图3b，在ra和oa滑膜组织中，pimt蛋白在细胞质中表达，但在ra滑膜组织中，pimt阳性细胞显著低于oa滑膜组织)；
②pimt通过bax/bcl-2通路调控ra-fls凋亡：特异性sirna降低pimt的表达，ra-fls增值增加，凋亡减少；在ra-fls中过表达pimt，导致ra-fls凋亡降低；检测凋亡相关蛋白，发现pimt是通过bax/bcl-2凋亡通路调控ra-fls的凋亡；
③pimt通过mapk信号通路调控ra-fls细胞的增值：在ra-fls中过表达pimt质粒，测定mapk信号通路中相关蛋白，发现pimt通过mapk信号通路调控ra-fls细胞的增值；
④pimt对ra-fls细胞中细胞因子的影响：过表达pimt后，ra-fls细胞中il-1b、il-6、il-8、il-17、tnf-α和vegf表达下降，il-10表达增高；特异性sirna下调pimt的表达后，ra-fls细胞中的il-10表达降低；
⑤pimt表达下降导致ra-fls细胞侵袭能力降低：特异性sirna降低pimt在ra-fls中的表达，ra-fls细胞侵袭能力降低；
⑥在ii型胶原诱导的大鼠ra模型的rat-fls中验证了pimt能通过bax/bcl-2凋亡通路调控rat-fls的凋亡和通过mapk信号通路调控ra-fls细胞的增值。
而在本发明的实际临床试验中，由本发明的pimt表达质粒和表达蛋白作为药物，用于调控ra-fls的凋亡和增殖，均起到了显著的效果，可使pimt在ra-fls中的表达量提高，检测量提高，有效调控ra-fls增殖，提高ra-fls细胞的抗侵袭能力，实现对类风湿性关节炎的治疗，应用前景广泛。
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
本领域技术人员应当理解，以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所作出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110>江苏天瑞精准医疗科技有限公司
<120>一种pimt表达质粒、扩增引物、构建方法及应用
<160>7
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>906
<212>dna
<213>人工序列(人工序列)
<400>1
actcttgggaaaactgctgggcaccgtcgtcgcgctgaaggtggttctgtacctgctccg60
agtgtgcttagcgatggcctggaaatccggcggcgccagccactcggagctaatccacaa120
tctccgcaaaaatggaatcatcaagacagataaagtatttgaagtgatgctggctacaga180
ccgctcccactatgcaaaatgtaacccatacatggattctccacaatcaataggtttcca240
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<213>人工序列(人工序列)
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<213>人工序列(人工序列)
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<213>人工序列(人工序列)
<400>4
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<213>人工序列(人工序列)
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