本发明属于代谢工程技术领域，具体涉及一种利用代谢工程改造类球红细菌构建产番茄红素菌株的方法。
背景技术：
番茄红素是一个含有11个碳碳共轭双键和2个非共轭双键的直链多不饱和脂肪烃，其分子结构特性既赋予其鲜艳的红色又使其具备超强的抗氧化性，目前已被广泛应用于功能食品、医药保健和化妆品等领域，国际市场需求日益扩增。
天然番茄红素主要来源于植物和微生物，但植物来源的番茄红素生产成本居高不下，而化学合成的番茄红素生物活性低且安全性备受质疑。微生物发酵法由于易于大规模可持续生产、产率较高和环境友好等特性，且随着现代代谢工程技术的快速发展，利用微生物发酵生产番茄红素已成为必然趋势。
目前，唯一用于工业化生产番茄红素的菌株是三孢布拉霉(blakesleatrispora)，但是三孢布拉霉缺乏有效的分子操作技术，且其菌体分为正负菌，代谢调控复杂，在生产番茄红素时需添加环化酶抑制剂，这无疑增加了生产成本和安全性等问题。类球红细菌(rhodobactersphaeroides)作为一个新的平台细胞生产番茄红素具有许多天然优势：(1)类球红细菌属于光合细菌，具有光合作用基因簇，上面有7个类胡萝卜素合成基因，按照编码顺序依次为crtf、crte、crtd、crtc、crtb、crti和crta，这几乎满足了番茄红素的生物合成；(2)类球红细菌具有丰富的内膜系统，这非常有利于番茄红素这个脂溶性化合物在细胞膜上的积累，同时在黑暗条件下，其细胞膜容易发生褶皱内陷，这又大大增加了番茄红素在细胞膜上的积累空间；(3)类球红细菌的遗传操作方法成熟，目前已经成功的用于辅酶q10、脂肪酸和5-氨基乙酰丙酸等高附加值天然化合物大规模发酵生产，为进一步探索利用类球红细菌生产番茄红素打下了良好的基础；(4)类球红细菌自身可以在厌氧光照条件下合成类胡萝卜素，而利用厌氧光合发酵生产番茄红素和β-胡萝卜素必将是大大节约发酵成本的！
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题在于提供一种高产番茄红素的类球红细菌工程菌株以及该菌株的构建方法。
解决上述技术问题所采用的类球红细菌工程菌株由下述方法构建得到：用深红红螺菌来源的八氢番茄红素四步脱氢酶基因crti4无痕替换类球红细菌内源的八氢番茄红素三步脱氢酶基因crti3，并敲除类球红细菌内源的链孢红素羟基化酶基因crtc和6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因zwf，然后在敲除zwf的位置整合表达类球红细菌内源的1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶基因dxs，得到产番茄红素类球红细菌工程菌。
上述用深红红螺菌来源的八氢番茄红素四步脱氢酶基因crti4无痕替换类球红细菌内源的八氢番茄红素三步脱氢酶基因crti3的方法为：以深红红螺菌atcc11170的基因为模板，利用引物crti4-f和crti4-r，用保真酶pfupcr扩增深红红螺菌atcc11170的八氢番茄红素四步脱氢酶基因crti4；以类球红细菌ath2.4.1的基因为模板，利用引物crti4-up-f和crti4-up-r，用保真酶pfupcr扩增类球红细菌的八氢番茄红素三步脱氢酶基因crti3的上游同源臂，利用引物crti4-down-f和crti4-down-r，用保真酶pfupcr扩增类球红细菌的八氢番茄红素三步脱氢酶基因crti3的下游同源臂；利用引物crti4-up-f与crti4-r，用高保真酶kod-plus通过重叠延伸pcr连接扩增的crti3基因的上游同源臂与crti4基因，再利用引物crti4-up-f与crti4-down-r，用高保真酶kod-plus通过重叠延伸pcr连接扩增的crti3基因的下游同源臂，实现crti3基因的上游同源臂-crti4基因-crti3基因的下游同源臂这三个基因片段的连接，得到△crti3::crti4片段；将△crti3::crti4片段插入到pk18mobsacb质粒的ecorⅰ和hindⅲ双酶切位点，获得质粒pk18-△crti3::crti4，该质粒热激转化进入s17-1感受态，得到供体菌株s17-1com△crti3::crti4，以类球红细菌为受体菌株进行双亲接合，得到菌株rl。
上述敲除类球红细菌内源的链孢红素羟基化酶基因crtc的方法为：以类球红细菌ath2.4.1的基因为模板，利用引物crtc-up-f和crtc-up-r，用保真酶pfupcr扩增类球红细菌的链孢红素羟基化酶基因crtc的上游同源臂，利用引物crtc-down-f和crtc-down-r，用保真酶pfupcr扩增类球红细菌的链孢红素羟基化酶基因crtc的下游同源臂；利用引物crtc-up-f与crtc-down-r，用高保真酶kod-plus通过重叠延伸pcr连接扩增的crtc基因的上游同源臂与下游同源臂，得到△crtc片段；将△crtc片段插入到pk18mobsacb质粒的ecorⅰ和hindⅲ双酶切位点，获得质粒pk18-△crtc，该质粒热激转化进入s17-1感受态，得到供体菌株s17-1com△crtc，以rl为受体菌株进行双亲接合，得到基础菌株rl1。
上述敲除类球红细菌内源的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因zwf的方法为：以类球红细菌ath2.4.1的基因为模板，利用引物zwf-up-f1和zwf-up-r1，用保真酶pfupcr扩增类球红细菌的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因zwf的上游同源臂，利用引物zwf-down-f1和zwf-down-r1，用保真酶pfupcr扩增类球红细菌的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因zwf的下游同源臂；利用引物zwf-up-f1与zwf-down-r1，用高保真酶kod-plus通过重叠延伸pcr连接扩增的zwf基因的上游同源臂与下游同源臂，得到△zwf片段；将△zwf片段插入到pk18mobsacb质粒的xbaⅰ和hindⅲ双酶切位点，获得质粒pk18-△zwf，该质粒热激转化进入s17-1感受态，得到供体菌株s17-1com△zwf，以rl1为受体菌株进行双亲接合，得到基础菌株rl2。
上述在敲除zwf的位置整合表达类球红细菌内源的1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶基因dxs的方法为：以类球红细菌ath2.4.1的基因为模板，利用引物dxs-f和dxs-r，用保真酶pfupcr扩增类球红细菌内源的1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶基因dxs，利用引物zwf-up-f2和zwf-up-r2，用保真酶pfupcr扩增类球红细菌的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因zwf的上游同源臂，利用引物zwf-down-f2和zwf-down-r2，用保真酶pfupcr扩增类球红细菌的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因zwf的下游同源臂；利用引物zwf-up-f2与dxs-r，用高保真酶kod-plus通过重叠延伸pcr连接扩增的zwf基因的上游同源臂与dxs基因，再利用引物zwf-up-f2与zwf-down-r2，用高保真酶kod-plus通过重叠延伸pcr连接扩增的zwf基因的下游同源臂，实现zwf基因的上游同源臂-dxs基因-zwf基因的下游同源臂这三个基因片段的连接，得到△zwf::dxs片段；将△zwf::dxs片段插入到pk18mobsacb质粒的xbaⅰ和hindⅲ双酶切位点，获得质粒pk18-△zwf::dxs，该质粒热激转化进入s17-1感受态，得到供体菌株s17-1com△zwf::dxs，以rl2为受体菌株进行双亲接合，得到产番茄红素类球红细菌工程菌。
上述各引物序列如下：
crti4-up-f：ccggaattcctctcgtcggccatcttg
crti4-up-r：gagtttcatggcgcgaactcctgc
crti4-f：gttcgcgccatgaaactccacccagcg
crti4-r：ggcaatcatttagaccaggaccgaggc
crti4-down-f：cctggtctaaatgattgcctctgccgatc
crti4-down-r：ccccaagcttcgcccgagaaactgtcgtag
crtc-up-f：ccggaattctcatcatgaacggaccgcc
crtc-up-r：gggatgtcaggaaaaggacacgccgtcgatatacca
crtc-down-f：atcgacggcgtgtccttttcctgacatcccggcc
crtc-down-r：ccccaagcttgccttcaacacgctctggac
zwf-up-f1：ctagtctagatgatcgagatggcgggagg
zwf-up-r1：ggcctctcagcggataaccatgggctctcccgc
zwf-down-f1：ggagagcccatggttatccgctgagaggccgccg
zwf-down-r1：ccccaagcttggtgatgaggacatggatggc
zwf-up-f2：ctagtctagatgatcgagatggcgggaggc
zwf-up-r2：gtcggtcatgggctctcccgctgcct
dxs-f：gagagcccatgaccgacagaccctgcac
dxs-r：ggcggcctcttccgatcgccctcctc
zwf-down-f2：cgatcggaagaggccgccgggc
zwf-down-r2：ccccaagcttggtgatgaggacatggatggc
本发明的有益效果如下：
1、本发明选用并克隆深红红螺菌的八氢番茄红素四步脱氢酶基因crti4，通过接合转移的方法无痕替换类球红细菌内源的八氢番茄红素三步脱氢酶crti3，在类球红细菌中构建了番茄红素合成通路。
2、本发明通过敲除类球红细菌的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因zwf，同时整合表达类球红细菌mep途径的1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶基因dxs，使类球红细菌生产番茄红素的含量达到10.32mg/gdcw，这是目前报道中利用光合细菌生产番茄红素含量最高的。
3、本发明所有遗传操作均在类球红细菌的染色体上进行基因的无痕替换或完全缺失，构建的产番茄红素工程菌株不需要抗性的维持，且菌株稳定性强。
附图说明
图1是构建类球红细菌生物合成番茄红素工程菌株整体代谢流程图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。
实施例中所用的dnamaker(makerⅲ、makerⅳ)、细菌基因组dna提取试剂盒、快速质粒小提试剂盒(离心柱型)及普通琼脂糖凝胶dna回收试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司；pcr所用的tap、pfu酶类购自北京汇天东方科技有限公司，高保真酶kod-plus购自日本toyobo公司；限制性内切酶类和pmd19-t载体、pk18mobsacb质粒均购自takara公司；引物合成均由上海invitrogen|thermofisherscientific完成；dna测序由北京擎科新业生物技术有限公司完成。
实施例中各引物序列如下：
crti4-up-f：ccggaattcctctcgtcggccatcttg
crti4-up-r：gagtttcatggcgcgaactcctgc
crti4-f：gttcgcgccatgaaactccacccagcg
crti4-r：ggcaatcatttagaccaggaccgaggc
crti4-down-f：cctggtctaaatgattgcctctgccgatc
crti4-down-r：ccccaagcttcgcccgagaaactgtcgtag
crtc-up-f：ccggaattctcatcatgaacggaccgcc
crtc-up-r：gggatgtcaggaaaaggacacgccgtcgatatacca
crtc-down-f：atcgacggcgtgtccttttcctgacatcccggcc
crtc-down-r：ccccaagcttgccttcaacacgctctggac
zwf-up-f1：ctagtctagatgatcgagatggcgggagg
zwf-up-r1：ggcctctcagcggataaccatgggctctcccgc
zwf-down-f1：ggagagcccatggttatccgctgagaggccgccg
zwf-down-r1：ccccaagcttggtgatgaggacatggatggc
zwf-up-f2：ctagtctagatgatcgagatggcgggaggc
zwf-up-r2：gtcggtcatgggctctcccgctgcct
dxs-f：gagagcccatgaccgacagaccctgcac
dxs-r：ggcggcctcttccgatcgccctcctc
zwf-down-f2：cgatcggaagaggccgccgggc
zwf-down-r2：ccccaagcttggtgatgaggacatggatggc
△crti3::crti4-f：cgatcatgtgcgagatgg
△crti3::crti4-r：tgttggtgagctgcatgg
实施例1
根据图1所示的类球红细菌中番茄红素生物合成途径，构建产番茄红素的类球红细菌工程菌株，具体构建方法如下：
1、深红红螺菌的crti4基因替换类球红细菌自身的crti3基因
以深红红螺菌atcc11170(ncbi网址为：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/nc_007643.1)的基因为模板，根据重叠延伸pcr引物设计原则设计引物crti4-f和crti4-r，利用保真酶pfupcr扩增深红红螺菌atcc11170的八氢番茄红素四步脱氢酶基因crti4，pcr扩增体系为：2×pfupcrmix10μl、crti4-f(10μm)1μl、crti4-r(10μm)1μl、深红红螺菌基因(20μg/μl)1μl、ddh2o7μl，反应程序为：94℃变性3min，然后94℃变性30s、62℃退火30s、72℃延伸3min共35个循环后，72℃延伸10min。用普通琼脂糖凝胶dna回收试剂盒回收crti4基因片段(1524bp)。
以野生型类球红细菌(rhodobactersphaeroides)ath2.4.1(ncbi网址为：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/cp000143.2)的基因为模板，根据重叠延伸pcr引物设计原则设计引物crti4-up-f和crti4-up-r，利用保真酶pfupcr扩增类球红细菌的八氢番茄红素三步脱氢酶基因crti3的上游同源臂，pcr扩增体系为：2×pfupcrmix10μl、crti4-up-f(10μm)1μl、crti4-up-r(10μm)1μl、类球红细菌基因(20μg/μl)1μl、ddh2o7μl，反应程序为：94℃变性3min，然后94℃变性30s、62℃退火30s、72℃延伸1min共35个循环后，72℃延伸10min。用普通琼脂糖凝胶dna回收试剂盒回收crti3的上游同源臂基因片段(441bp)。
以野生型类球红细菌(rhodobactersphaeroides)ath2.4.1的基因为模板，根据重叠延伸pcr引物设计原则设计引物crti4-down-f和crti4-down-r，利用保真酶pfupcr扩增类球红细菌的八氢番茄红素三步脱氢酶基因crti3的下游同源臂，pcr扩增体系为：2×pfupcrmix10μl、crti4-down-f(10μm)1μl、crti4-down-r(10μm)1μl、类球红细菌基因(20μg/μl)1μl、ddh2o7μl，反应程序为：94℃变性3min，然后94℃变性30s、64℃退火30s、72℃延伸1min共35个循环后，72℃延伸10min。用普通琼脂糖凝胶dna回收试剂盒回收crti3的下游同源臂基因片段(397bp)。
利用引物crti4-up-f与crti4-r，用高保真酶kod-plus通过重叠延伸pcr连接扩增的crti3基因的上游同源臂与crti4基因，重叠延伸pcr扩增反应体系为：10×pcrbufferforkod-plus5μl、dntps(2mm)5μl、mgso4(25mm)2μl、crti4-up-f(10μm)1.5μl、crti4-r(10μm)1.5μl、crti4基因片段(20μg/μl)2μl、crti3的上游同源臂基因片段(20μg/μl)2μl、kod-plus(1u/μl)1μl、ddh2o30μl，反应程序为：94℃变性2min，然后94℃变性15s、64℃退火30s、68℃延伸2min共35个循环后，68℃延伸10min。用普通琼脂糖凝胶dna回收试剂盒回收crti3基因的上游同源臂-crti4基因连接片段。再利用引物crti4-up-f与crti4-down-r，用高保真酶kod-plus通过重叠延伸pcr连接扩增的crti3基因的下游同源臂，重叠延伸pcr扩增反应体系为：10×pcrbufferforkod-plus5μl、dntps(2mm)5μl、mgso4(25mm)2μl、crti4-up-f(10μm)1.5μl、crti4-down-r(10μm)1.5μl、crti3基因的上游同源臂-crti4基因连接片段(20μg/μl)2μl、crti3的下游同源臂基因片段(20μg/μl)2μl、kod-plus(1u/μl)1μl、ddh2o30μl，反应程序为：94℃变性2min，然后94℃变性15s、64℃退火30s、68℃延伸150s共30个循环后，68℃延伸10min。重叠延伸pcr结束后，向pcr反应体系中加入10μltaqmix酶，混匀后继续72℃pcr延伸30min，用普通琼脂糖凝胶dna回收试剂盒回收crti3基因的上游同源臂-crti4基因-crti3基因的下游同源臂这三个基因的连接片段，得到△crti3::crti4片段。
将△crti3::crti4片段连接到pmd19-t载体上，连接体系为：solutioni5μl、△crti3::crti4片段4.5μl、pmd19-t载体0.5μl，反应条件：16℃40min。将连接产物热激转化进入dh5α感受态，转化操作方法为：用移液枪取10μl连接产物与dh5α感受态细胞轻轻混匀，冰浴静置30min，42℃金属浴热激90s，冰浴2min；然后在超净台中加入1ml无抗液体lb，37℃、200rpm复壮45min；取50μl复壮液均匀涂布于含50μg/mlkm抗性的lb固体平板上，37℃倒置培养过夜。之后用taq酶与crti4-up-f、crti4-down-r这对引物菌落pcr验证转化子单菌落，选阳性转化子提质粒送测序或酶切验证，验证正确的转化子提质粒pmd19-t-△crti3::crti4，用ecorⅰ和hindⅲ双酶切后经t4连接酶连接到pk18mobsacb质粒的ecorⅰ和hindⅲ双酶切位点，双酶切反应体系为：10×mbuffer5μ、lecorⅰ2.5μl、hindⅲ2.5μl、pmd19-t-△crti3::crti4/pk18mobsacb40μl，反应条件为：37℃酶切2h。用普通琼脂糖凝胶dna回收试剂盒回收目的片段，用t4连接酶连接△crti3::crti4到pk18mobsacb，获得质粒pk18-△crti3::crti4，将该质粒按上述同样的方法热激转化进入s17-1感受态，得到供体菌株s17-1com△crti3::crti4，以类球红细菌为受体菌株进行双亲接合(接合方法参照博士论文《类球红细菌中辅酶q10的代谢工程研究及应用》,浙江大学,2014.)。设计类球红细菌crti3基因上下游同源臂以外的基因组上的引物(避免假阳性)△crti3::crti4-f和△crti3::crti4-r，利用taq酶菌落pcr验证接合双交换单菌落，取一个阳性样品送测序进一步验证。最后分离纯化该双交换正确的重组菌株，得到菌株rl，保存菌种。
2、敲除crtc基因阻断番茄红素代谢消耗途径
按照步骤1中构建菌株rl的方法，以野生型类球红细菌ath2.4.1的基因为模板，利用引物crtc-up-f和crtc-up-r，用保真酶pfupcr扩增类球红细菌的链孢红素羟基化酶基因crtc的上游同源臂(427bp)，利用引物crtc-down-f和crtc-down-r，用保真酶pfupcr扩增类球红细菌的链孢红素羟基化酶基因crtc的下游同源臂(428bp)，pcr扩增反应程序为：94℃变性3min，然后94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸1min共35个循环后，72℃延伸10min。利用引物crtc-up-f与crtc-down-r，用高保真酶kod-plus通过重叠延伸pcr连接扩增的crtc基因的上游同源臂与下游同源臂，重叠延伸pcr扩增反应程序为：94℃变性2min，然后94℃变性15s、60℃退火30s、68℃延伸60s共35个循环后，68℃延伸10min，得到△crtc片段；将△crtc片段插入到pk18mobsacb质粒的ecorⅰ和hindⅲ双酶切位点，获得质粒pk18-△crtc，该质粒热激转化进入s17-1感受态，得到供体菌株s17-1com△crtc，以rl为受体菌株进行双亲接合，得到基础菌株rl1。
3、敲除中心代谢途径关键基因zwf阻断磷酸戊糖途径对碳源的竞争
按照步骤1中构建菌株rl的方法，以野生型类球红细菌ath2.4.1的基因为模板，利用引物zwf-up-f1和zwf-up-r1，用保真酶pfupcr扩增类球红细菌的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因zwf的上游同源臂(582bp)，利用引物zwf-down-f1和zwf-down-r1，用保真酶pfupcr扩增类球红细菌的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因zwf的下游同源臂(639bp)，pcr扩增反应程序为：94℃变性3min，然后94℃变性30s、66℃退火30s、72℃延伸1min共35个循环后，72℃延伸10min。利用引物zwf-up-f1与zwf-down-r1，用高保真酶kod-plus通过重叠延伸pcr连接扩增的zwf基因的上游同源臂与下游同源臂，重叠延伸pcr扩增反应程序为：94℃变性2min，然后94℃变性15s、67℃退火30s、68℃延伸40s共35个循环后，68℃延伸10min，得到△zwf片段；将△zwf片段插入到pk18mobsacb质粒的xbaⅰ和hindⅲ双酶切位点，获得质粒pk18-△zwf，该质粒热激转化进入s17-1感受态，得到供体菌株s17-1com△zwf，以rl1为受体菌株进行双亲接合，得到基础菌株rl2。
4、整合表达mep途径限速基因dxs提高番茄红素直接前体物质的供应
按照步骤1中构建菌株rl的方法，以野生型类球红细菌ath2.4.1的基因为模板，利用引物dxs-f和dxs-r，用保真酶pfupcr扩增类球红细菌内源的1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶基因dxs(1953bp)，pcr扩增反应程序为：94℃变性3min，然后94℃变性30s、68℃退火30s、72℃延伸4min共30个循环后，72℃延伸10min。利用引物zwf-up-f2和zwf-up-r2，用保真酶pfupcr扩增类球红细菌的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因zwf的上游同源臂(560bp)，利用引物zwf-down-f2和zwf-down-r2，用保真酶pfupcr扩增类球红细菌的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因zwf的下游同源臂(614bp)，pcr扩增反应程序为：94℃变性3min，然后94℃变性30s、68℃退火30s、72℃延伸1min共35个循环后，72℃延伸10min。利用引物zwf-up-f2与dxs-r，用高保真酶kod-plus通过重叠延伸pcr连接扩增的zwf基因的上游同源臂与dxs基因，再利用引物zwf-up-f2与zwf-down-r2，用高保真酶kod-plus通过重叠延伸pcr连接扩增的zwf基因的下游同源臂，实现zwf基因的上游同源臂-dxs基因-zwf基因的下游同源臂这三个基因片段的连接，重叠延伸pcr扩增反应程序为：94℃变性2min，然后94℃变性15s、68℃退火30s、68℃延伸100s共35个循环后，68℃延伸10min，得到△zwf::dxs片段；将△zwf::dxs片段插入到pk18mobsacb质粒的xbaⅰ和hindⅲ双酶切位点，获得质粒pk18-△zwf::dxs，该质粒热激转化进入s17-1感受态，得到供体菌株s17-1com△zwf::dxs，以rl2为受体菌株进行双亲接合，得到红素类球红细菌工程菌。
发明人采用实施例1得到的类球红细菌工程菌进行发酵培养，发酵培养基的组成为：葡萄糖30g/l、玉米浆干粉3g/l、谷氨酸钠3g/l、nacl2.8g/l、(nh4)2so43g/l、kh2po43g/l、mgso46.3g/l、caco32g/l、烟酸1mg/l、烟酸硫胺1mg/l、生物素15μg/l，按2％的接种量转接至50％装液量的发酵培养基中，34℃150rpm黑暗培养。在红素类球红细菌工程菌早期发酵阶段(0-48h)，发酵液为淡黄色牛奶状，然后渐渐地变为粉色(48-72h)、红色(72-96h)直至深红色(96-168h)。类球红细菌工程菌发酵168h时，生物量达到6.4g/l，经hplc定量分析，番茄红素含量为10.32mg/gdcw。