本发明涉及一种重组表达质粒，还涉及一种含有重组表达质粒的转化子，本发明还涉及该转化子的应用，特别是在发酵生产赖氨酸脱羧酶及发酵生产1,5-戊二胺方面的应用。
背景技术：
在以表达重组蛋白为目的的发酵中，通常使用组成型启动子或诱导型启动子(又称可诱导启动子)来启动重组基因的表达。组成型启动子的表达为持续性表达，无需调控。诱导型启动子又分为阻遏型启动子和激活型启动子。阻遏型启动子与阻遏蛋白(或称转录抑制蛋白)结合，受到抑制；在诱导条件下，阻遏蛋白与启动子序列解离，解除抑制。对于阻遏型启动子而言，当阻遏蛋白缺失时，可视为处于持续诱导状态，也可当成组成型启动子。例如lac启动子受阻遏蛋白laci抑制，是诱导型启动子。但lac启动子在不能表达阻遏蛋白laci的宿主菌中可以组成型表达。激活型启动子在非诱导条件下不能表达或表达效率低；诱导条件下，激活蛋白被激活，并与激活型启动子结合，促使其表达。例如pbad启动子受激活蛋白arac的激活。
诱导型启动子又可以分为利用化合物诱导的启动子，如iptg、单糖或抗生素诱导的启动子，和通过改变培养条件诱导的启动子，如温度诱导的启动子。在大规模的发酵中，向发酵液中添加化合物诱导剂成本巨大。因此利用温控启动子进行重组表达，具有成本上的优势。已公开的热诱导启动子一般受控于一个热不稳定的阻遏蛋白，如tetr的点突变型：g21e，i193n，或a89d(见wissmann等，“selectionfortn10repressorbindingtotetoperatorinescherichiacoli:isolationoftemperature-sensitivemutantsandcombinatorialmutagenesisinthednabindingmotif”，genetics(1991)volume128，pp225-232)，laci的点突变型：s300n或g187s(见miura-onai等，“mutationalstudyatser300positionoftheescherichiacolilactoserepressor”，biochemicalandbiophysicalresearchcommunications(1995)volume209，issue1，pp126-30.)，噬菌体λ阻遏蛋白ci(简称λci)的热不稳定突变型ci857(见valdez-crus等，“productionofrecombinantproteinsine.colibytheheatinducibleexpressionsystembasedonthephagelambdapland/orprpromoters”，microbialcellfactories(2010)9:18)等。λci的热不稳定突变型还包括：i21s，g53s，a62t，v73a，f141i/p153l，n207t，k224e(见jana等，“aminoacidchangesintherepressorofbacteriophagelambdaduetotemperature-sensitivemutationsinitscigeneandthestructureofahighlytemperature-sensitivemutantrepressor”，proteinengineering(1999)volume12，issue3，pp225-233)。热不稳定的阻遏蛋白在较低温度下(如30℃或更低)具有抑制转录的活性，而在较高温度下(如42℃)失去抑制活性，因而其所控制的启动子具有热诱导的特性。
工业规模的发酵对重组质粒的稳定性有很高的要求。专利cn201210177392.x(公开号cn102851307a，公开日2013-01-02)、us9234203b2(公开日：2016-01-12)首次公开了将重组表达质粒转化进蜂房哈夫尼菌(hafniaalvei，h.alvei)使之成为成功的工业发酵用重组菌株的技术。us9234203b2披露了，作为宿主菌，蜂房哈夫尼菌与大肠杆菌有一个显著的不同：组成型表达质粒pplac-cada在无内源性质粒的大肠杆菌中可以在无抗生素筛选的情况下稳定传代1-2次，但在无内源性质粒的蜂房哈夫尼菌中即使在抗生素筛选条件下也不能稳定传代。为了解决重组质粒不稳定的问题，专利中使用了新型毒素/抗毒素基因对，利用解离后致死机制来提高重组质粒的稳定性。
本案发明人首次尝试在蜂房哈夫尼菌中使用温控表达的重组质粒，发现当以无内源性质粒的蜂房哈夫尼菌为宿主菌时，温控重组质粒在重组菌正常生长温度下(如35℃)可以在无抗生素筛选的情况下稳定传代至少5次；温控重组质粒在有内源性质粒的蜂房哈夫尼菌中也同样稳定。而在诱导条件下(如42℃)，温控重组质粒的表达效果与pplac-cada相当。据此，提出了本发明。
技术实现要素：
本发明的第一方面目的在于提出一种重组表达质粒，以解决现在重组质粒在连续传代中出现不稳定的问题。
一种重组表达质粒，所述重组表达质粒是温控重组表达质粒，所述温控重组表达质粒包含受热不稳定阻遏蛋白调控的启动子和编码多肽的聚核苷酸，该多肽的表达受所述启动子控制。
进一步，所述的热不稳定阻遏蛋白包括：热不稳定突变型λ噬菌体阻遏蛋白ci、热不稳定突变型阻遏蛋白tetr或热不稳定突变型阻遏蛋白laci；进一步优选地，所述的热不稳定突变型λ噬菌体阻遏蛋白ci包括ci857，i21s，g53s，a62t，v73a，f141i/p153l，n207t，k224e。
又进一步，所述受热不稳定突变型λ噬菌体阻遏蛋白ci调控的启动子是天然启动子，天然启动子的突变型，或人工构建的启动子；进一步优选地，所述受热不稳定突变型λ噬菌体阻遏蛋白ci调控的启动子为来源于λ噬菌体基因组的l启动子(简称λpl)、r启动子(简称λpr)、l启动子的突变型、r启动子的突变型。
在上述任一技术方案基础上进一步，所述的多肽包括酶或多肽类药物；又进一步优选地，所述的酶包括氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶和连接酶中的至少一种，所述多肽类药物包括激素、抗体和生长因子中的至少一种；更进一步优选地，所述裂合酶包括脱羧酶，更进一步优选地，所述脱羧酶包括氨基酸脱羧酶，特别是赖氨酸脱羧酶、酪氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶或谷氨酸脱羧酶。
又更进一步优选地，编码赖氨酸脱羧酶的聚核苷酸包括cada基因、ldcc基因、haldc基因、cada基因的片段、ldcc基因的片段或haldc基因的片段；或者，所述编码赖氨酸脱羧酶的聚核苷酸包括如seqidno:1所示的dna序列、如seqidno:2所示的dna序列，如seqidno:3所示的dna序列，如seqidno:1所示序列的片段，如seqidno:2所示序列的片段或如seqidno:3所示序列的片段。
本发明的第二方面目的在于提出一种含有重组表达质粒的转化子，以解决现在重组质粒在连续传代中出现不稳定的问题。
本发明通过以下技术方案解决上述技术问题，达到本发明的目的。
一种含有重组表达质粒的转化子，所述转化子的宿主菌为蜂房哈夫尼菌；所述重组表达质粒是温控重组表达质粒，所述温控重组表达质粒包含：受热不稳定阻遏蛋白调控的启动子和编码多肽的聚核苷酸，所述多肽的表达受所述启动子控制。
所述的宿主菌是无内源性质粒的蜂房哈夫尼菌。或者，所述的宿主菌是有内源性质粒的蜂房哈夫尼菌。
所述的温控重组表达质粒是在任何在蜂房哈夫尼菌中可复制的质粒的基础上构建的。所述的在蜂房哈夫尼菌中可复制的质粒包括但不限于puc18、puc19、pbr322、pacyc或它们的衍生质粒。
所述的热不稳定突变型阻遏蛋白包括但不限于：热不稳定突变型阻遏蛋白tetr，热不稳定突变型阻遏蛋白laci，热不稳定突变型λ噬菌体阻遏蛋白ci(简称热不稳定突变型λci)。
本发明所述的热不稳定突变型λci包括但不限于ci857，i21s，g53s，a62t，v73a，f141i/p153l，n207t，k224e。ci857与野生型λci相比第66位氨基酸残基由丙氨酸变为苏氨酸。在本发明的某些实施例中，ci857还可进一步包含其他氨基酸残基位点的突变，所述其他氨基酸残基位点的突变不影响其第66位氨基酸残基突变所导致的热不稳定性。
受所述热不稳定突变型λci调控的启动子可以是天然启动子，天然启动子的突变型，或人工构建的启动子。
在优选的实施例中，所述启动子为来源于λ噬菌体基因组的l启动子、r启动子、l启动子的突变型或r启动子的突变型。
在上述技术方案的基础上进一步，所述转化子含有编码热不稳定突变型λ噬菌体阻遏蛋白ci的聚核苷酸。所述编码热不稳定突变型λ噬菌体阻遏蛋白ci的聚核苷酸在质粒上，或者在宿主基因组中。在一个实施例中，编码热不稳定突变型λ噬菌体阻遏蛋白ci的聚核苷酸在温控重组表达质粒上。
所述的多肽包含酶或多肽类药物。所述的酶包括氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶和连接酶中的至少一种。进一步，所述裂合酶是脱羧酶，更进一步，所述脱羧酶是氨基酸脱羧酶，如是赖氨酸脱羧酶、酪氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶或谷氨酸脱羧酶。所述多肽类药物包括激素、抗体和生长因子等中的至少一种。在一个实施例中，表达的多肽类药物是胰岛素原。
在上述技术方案的基础上进一步，编码赖氨酸脱羧酶的聚核苷酸包括cada基因、ldcc基因、haldc基因、cada基因的片段、ldcc基因的片段或haldc基因的片段；或者，所述编码赖氨酸脱羧酶的聚核苷酸包括如seqidno:1所示的dna序列、如seqidno:2所示的dna序列，如seqidno:3所示的dna序列，如seqidno:1所示序列的片段，如seqidno:2所示序列的片段或如seqidno:3所示序列的片段。
本发明的第三方面目的在于一种发酵生产多肽的方法，以解决现在发酵生产多肽的方法在连续传代中重组质粒出现不稳定的问题。
一种发酵生产多肽的方法，包括以下步骤：
a)培养如上文任一技术方案所述的转化子；
b)从步骤a中得到的菌液或菌体中得到多肽。
优选地，所述的一种发酵生产多肽的方法，是发酵生产赖氨酸脱羧酶的方法，包括以下步骤：
1)培养如上文任一项技术方案所述的转化子(当然，所述技术方案中所述多肽包括赖氨酸脱羧酶)；
2)从步骤1中得到的菌液或菌体中得到赖氨酸脱羧酶。
在上述任一技术方案的基础上进一步，所述转化子在培养过程中通过提高培养温度来提高重组表达，所述培养温度包括任何可以让宿主细胞生长的温度。
本发明的目的的第四方面在于提出一种发酵生产1,5-戊二胺的方法，以解决现在发酵生产1,5-戊二胺的方法在连续传代中重组质粒出现不稳定的问题。
一种发酵生产1,5-戊二胺的方法，包括以下步骤：
i)按照如上文所述的发酵生产赖氨酸脱羧酶的方法的步骤1、2生产赖氨酸脱羧酶；
ii)用步骤i)中得到的菌液或菌体，或用来自菌液、菌体的赖氨酸脱羧酶催化赖氨酸脱羧生成1,5-戊二胺。
本发明的含有重组表达质粒的转化子，使用了本发明的温控重组表达质粒，温控重组表达质粒在连续传代中稳定性好，既能满足对重组质粒稳定性的要求，又能满足对重组蛋白产量的要求，适用于大规模的发酵生产，尤其是发酵生产赖氨酸脱羧酶及进一步生产1,5-戊二胺。
附图说明
图1是实施例1中所述的ppr2-cada重组表达质粒的结构示意图。
图2是实施例1中所述的重组菌ha/puc19(泳道1～3)、ha/pplac-cada(泳道4～6)、ha/ppr2-cada(泳道7～9)和hac/ppr2-cada(泳道10～12)等体积菌液中菌体蛋白电泳图。
图3是实施例1中所述的重组菌ha/pplac-cada，在35℃连续传代培养所得的菌液，梯度稀释以后在lb和lb/amp平板上的菌落生长状况。
图4是实施例1中所述的重组菌hac/pplac-cada，在35℃连续传代培养所得的菌液，梯度稀释以后在lb和lb/amp平板上的菌落生长状况。
图5是实施例1中所述的重组菌ha/ppr2-cada，在35℃连续传代培养所得的菌液，梯度稀释以后在lb和lb/amp平板上的菌落生长状况。
图6是实施例1中所述的重组菌hac/ppr2-cada，在35℃连续传代培养所得的菌液，梯度稀释以后在lb和lb/amp平板上的菌落生长状况。
具体实施方式
下面结合附图，详细说明本发明。
本发明涉及一种含有温控重组表达质粒的转化子，所述转化子的宿主菌为蜂房哈夫尼菌；所述温控重组表达质粒包含：受热不稳定阻遏蛋白调控的启动子和编码多肽的聚核苷酸，所述多肽的表达受所述启动子控制。
本发明所公开的内容包含受热不稳定阻遏蛋白调控的启动子。所述受热不稳定阻遏蛋白调控的启动子序列中、序列上游和/或序列下游含有该阻遏蛋白的操纵位点。操纵位点是一段可与阻遏蛋白结合，起到调节基因表达效果的核苷酸序列。在一个实施例中，受热不稳定突变型阻遏蛋白tetr调节的启动子在其序列中、序列上游和/或序列下游含有tetr操纵位点。在一个实施例中，受热不稳定突变型阻遏蛋白laci调节的启动子在其序列中、序列上游和/或序列下游含有laci操纵位点。在优选的实施例中，受热不稳定突变型λci调节的启动子在其序列中、序列上游和/或序列下游含有λci操纵位点。
所述启动子包括天然启动子、天然启动子的突变型或人工构建的启动子。在优选的实施例中，所述启动子是受热不稳定突变型λci调控的启动子。在某些实施例中，所使用的启动子为天然启动子，所述天然启动子包含但不限于λpl，λpr。在某些实施例中，所使用的启动子为天然启动子的突变型，如在天然启动子核苷酸序列中出现一个或多个碱基置换、插入或删除。在某些实施例中，所使用的启动子为λpr的突变型。某些实施例中，所使用的启动子突变型为λpra-32g或λprt-41c。在某些实施例中，所使用的启动子为人工构建的合成启动子，包含将1个、2个、3个、4个、5个或6个λci操纵位点与任一具有启动转录功能的启动子序列结合所构建的合成启动子。所述λci操纵位点包含但不限于位于λ噬菌体基因组中的操纵位点ol1(tatcaccgccagtggta)，ol2(caacaccgccagagata)，ol3(tatcaccgcagatggtt)，or1(tacctctggcggtgata)，or2(taacaccgtgcgtgttg)，or3(tatcaccgcaagggata)，或在上述位点的核苷酸序列中出现碱基置换、删除或插入得到的突变型。
在进一步优选的实施例中，所述的热不稳定突变型λ噬菌体阻遏蛋白ci是ci857，i21s，g53s，a62t，v73a，f141i/p153l，n207t，k224e。ci857与野生型λci相比在第66位氨基酸残基位点上由丙氨酸变为苏氨酸。在某些实施例中，ci857进一步包含其他氨基酸残基位点的突变，所述其他氨基酸残基位点的突变不影响其第66位氨基酸残基位点突变所导致的对温度敏感的特性。
编码ci857蛋白的聚核苷酸可以在质粒上，也可以在宿主基因组中。在一个实施例中，编码ci857蛋白的聚核苷酸在所述温控重组表达质粒上。
本发明中所述的温控重组表达质粒是在任何在蜂房哈夫尼菌中可复制的质粒的基础上构建的，所述在蜂房哈夫尼菌中可复制的质粒包括但不限于puc18、puc19、pbr322、pacyc中的任一质粒或其衍生质粒。
本发明中所述的多肽包括酶或多肽类药物。所述的酶包括氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶和连接酶中的至少一种。在某些实施例中，所述裂合酶是脱羧酶，更进一步是氨基酸脱羧酶，如是赖氨酸脱羧酶、酪氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶或谷氨酸脱羧酶。所述的多肽类药物包括激素、抗体、生长因子等中的至少一种。在一个实施例中，表达的多肽类药物是胰岛素原。
在优选的实施例中，表达的是赖氨酸脱羧酶。编码赖氨酸脱羧酶的聚核苷酸包括但不限于cada基因、ldcc基因、haldc基因、cada基因的片段、haldc基因的片段、或haldc基因的片段。或者，所述的重组表达载体包含如seqidno:1所示的dna序列，如seqidno:2所示的dna序列，如seqidno:3所示的dna序列，如seqidno:1所示序列的片段，如seqidno:2所示序列的片段，或seqidno:3所示序列的片段。
本发明使用的宿主菌为蜂房哈夫尼菌(h.alvei)。在某些实施例中，宿主菌含有内源性质粒；在某些实施例中，宿主菌天然不含有内源性质粒或消除了原有的内源性质粒。作为宿主的h.alvei菌株可以从任何已知的h.alvei株中选择。例如，无内源性质粒的h.alvei株，有palva内源性质粒的h.alvei株和其质粒消除株(palva-株)，有palvb内源性质粒的h.alvei株和其质粒消除株(palvb-株)。
本发明还涉及一种发酵生产多肽的方法，包括以下步骤：
a)培养如上文所述的转化子；
b)从步骤a中得到的菌液或菌体中得到多肽。
在一个实施例中，所述一种发酵生产多肽的方法是发酵生产赖氨酸脱羧酶的方法，包括以下步骤：
1)培养如上文任一项技术方案所述的转化子(当然，所述技术方案中所述多肽包括赖氨酸脱羧酶)；
2)从步骤1中得到的菌液或菌体中得到赖氨酸脱羧酶。
在上述发酵生产多肽的优选的实施例中，转化子在培养过程中通过提高培养温度来提高重组蛋白表达。所述培养温度包括任何可以让宿主细胞生长的温度。较适宜的温度在约10℃至45℃。在某些实施例中，转化子在16℃至37℃生长至指数中期，指数后期，稳定期初期或稳定期，然后将温度提高至38℃至42℃，继续培养至发酵结束。
转化子可以在含有碳源和非碳营养源的培养基中培养。碳源包含但不限于碳水化合物(如糖，如葡萄糖和果糖)，油和/或脂肪，脂肪酸，和/或其衍生物。油和脂肪包括十碳以上的饱和和/或不饱和脂肪酸，如椰油，棕榈油，棕榈仁油等。脂肪酸可以是饱和和/或不饱和脂肪酸，如己酸，辛酸，癸酸，月桂酸，油酸，棕榈酸，亚油酸，亚麻酸，肉豆蔻酸等。脂肪酸衍生物包括但不限于脂肪酸酯和脂肪酸盐。非碳营养源包括但不限于氮源，无机盐和其他有机营养源。
例如，培养基包含转化子可吸收的碳源，还可以包含一种或一种以上的其他营养源，如氮源、无机盐和其他有机营养源。在某些实施例中，培养基中氮源的重量百分比占0.01至0.1％。氮源包括氨，铵盐(如氯化铵，硫酸铵和磷酸铵)，蛋白胨，肉类提取物，酵母提取物等。无机盐包括但不限于，磷酸二氢钾，磷酸氢二钾，磷酸镁，硫酸镁，氯化钠等。其他有机营养源包括，但不限于，氨基酸(如甘氨酸，丙氨酸，丝氨酸，苏氨酸和脯氨酸)，维生素(如维生素b1，维生素b12和维生素c)，等等。
在一个实施例中，转化子的培养基含有肽，蛋白胨，维生素(如b族维生素)，微量元素(如氮，硫，镁)，和矿物质。这样的培养基包括，但不限于众所周知的lb培养基(由胰蛋白胨、酵母提取物和nacl溶解于水(如蒸馏水或去离子水)制成)。
本发明所公开的内容，还包括用生物法制备1,5戊二胺的方法。
本发明还涉及一种发酵生产1,5-戊二胺的方法，包括以下步骤：
a)按照如上文所述的发酵生产赖氨酸脱羧酶的方法的步骤1生产赖氨酸脱羧酶；
b)用步骤a中得到的菌液或菌体，或用来自菌液、菌体中的赖氨酸脱羧酶催化赖氨酸脱羧生成1,5-戊二胺。
以下结合具体的实施例对本发明做进一步说明，应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。对于本领域的技术人员来说，在本发明范围内所做的任何变更、修改、或直接采用实施例中的同等条件而实施的例子，都应理解为在本发明的涵盖范围内。此外，正如本发明所阐述的，本发明所引用的所有参考文献都是完整形式纳入本发明中的。
以下实施例中提到的pcr扩增、质粒提取、酶切、酶切产物连接的具体步骤、条件参数等均按所购相关酶和试剂的说明书建议的条件进行。
实施例1
1.1温控cada重组表达质粒的构建
以λ-hindiiidigestdna(购自宝生物工程(大连)有限公司)为模板，用引物1和2(引物1的序列见seqid:no4，引物2的序列见seqid:no5)扩增含部分ci857基因的序列；用引物3和4(引物3的序列见seqid:no6，引物4的序列见seqid:no7)扩增含部分ci857基因和λpr启动子的序列。再用overlappcr方法，以上述两pcr产物为模板，用引物1和4扩增含有ci857基因和λpr启动子的序列，用内切酶bamhi和bglii(均购自宝生物工程(大连)有限公司)酶切该overlappcr产物。以pplac-cada质粒(制备方法见中国发明专利申请cn201210177392.x的实施例1，公开号cn102851307a，公开日2013-01-02)为模板，用引物5和6(引物5的序列见seqid:no8，引物6的序列见seqid:no9)扩增含载体骨架和cada基因的序列，同样用bamhi和bglii酶切。将两酶切产物连接，转化大肠杆菌jm109(购自北京博迈德基因技术有限公司)，得到质粒ppr-cada。
为了去除cada基因上游的bglii酶切位点，以ppr-cada为模板，用引物7和8(引物7的序列见seqid:no10，引物8的序列见seqid:no11)进行pcr复制。用内切酶dpni(购自宝生物工程(大连)有限公司)和bglii处理pcr产物。将pcr产物转化jm109。提取转化子质粒，用引物9(引物9的序列见seqid:no12)对cada基因上游序列测序。测序检验正确(去除bglii位点)的质粒命名为ppr2-cada(图1)。
将ppr2-cada转化进h.alvei菌株(具体而言，是蜂房哈夫尼菌cgmcc1.1009，购自于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)，和该菌株的内源性质粒消除株中，转化方法与专利cn201210177392.x实施例2所述相同。本实施例中使用的两种h.alvei宿主菌，一种含有palvb内源性质粒(ha)，一种为去除内源性质粒的宿主菌(hac)，这两种h.alvei宿主菌与专利cn201210177392.x中实施例1和2中所述相同。将ppr2-cada分别转化进含内源性质粒和无内源性质粒的h.alvei菌株，所得重组菌命名为ha/ppr2-cada和hac/ppr2-cada。
作为表达实验和/或质粒稳定性实验的对照，空载体puc19和组成型重组表达质粒pplac-cada也分别转化进含内源性质粒和/或无内源性质粒的h.alvei菌株，所得重组菌命名为ha/puc19、ha/pplac-cada和hac/pplac-cada。
1.2cada重组表达质粒在不同温度下在蜂房哈夫尼菌内的表达
将ha/puc19、ha/pplac-cada、ha/ppr2-cada和hac/ppr2-cada单菌落接种于lb/amp液体中(氨苄青霉素浓度为100mg/l)，35℃摇床培养过夜。将菌液以0.6％v/v接种于新鲜lb/amp中，35℃摇床培养3.25hr。将每份菌液分为3份，分别在35℃、36℃和42℃摇床中培养过夜。取1ml菌液，离心收集菌体。
制备sds-page分离胶，组份包含：10％w/v丙烯酰胺/甲叉丙烯酰胺(29/1)，0.375mtris-hcl(ph8.8)，0.1％w/vsds，0.1％w/v过硫酸铵，0.04％v/vtemed。将收集的菌体用800μl无菌水悬浮。取15μl悬浮液，加入5μl4×sds-page上样液(购自宝生物工程(大连)有限公司)混匀，沸水浴中加热5min。将上述20μl样品全部上样电泳。蛋白分子量用宝生物工程(大连)有限公司的蛋白分子量标准(宽)指示。电泳胶用考马斯亮蓝r-250染色液染色，其组份包含：0.1％w/v考马斯亮蓝r-250，25％v/v异丙醇，10％v/v冰醋酸。
电泳图见图2，重组表达蛋白cada在电泳图中的位置用黑色箭头指示。其中泳道1、4、7、9是各重组菌接种以后在35℃培养3.25hr，并继续在35℃培养过夜后所收集菌体的蛋白；泳道2、5、8、10是各重组菌接种以后在35℃培养3.25hr，将温度提高到36℃，继续培养过夜后所收集菌体的蛋白；泳道3、6、9、12是各重组菌接种以后在35℃培养3.25hr，将温度提高到42℃，继续培养过夜后所收集菌体的蛋白。
由图2可见，ha/ppr2-cada和hac/ppr2-cada菌中的cada表达随温度升高而增强(对比泳道7～9，泳道10～12)，在42℃最强。而组成型表达的对照菌株ha/pplac-cada，其cada表达在35-42℃区别不大(对比泳道4～6)。ha/ppr2-cada菌在42℃的cada表达量低于ha/pplac-cada菌(对比泳道4～6和9)。hac/ppr2-cada菌在42℃的表达强度与ha/pplac-cada菌的表达强度相当(对比泳道4～6和12)。
1.3温控cada重组表达质粒在培养温度下在蜂房哈夫尼菌内的稳定性
重组质粒在宿主中的稳定性通过如下方法检测：在无抗生素的非选择性培养液中连续传代重组菌株，将每次培养所得的菌液进行梯度稀释，分别涂在非选择性和含氨苄青霉素的选择性平板上，估算和比较菌液中的总细胞数和含质粒的细胞数。
将ha/pplac-cada、hac/pplac-cada、ha/ppr2-cada和hac/ppr2-cada单菌落分别接种于lb/amp液体中，于35℃摇床过夜培养(种子液)。将各种子液以1‰v/v接种于新鲜lb液体中，在35℃摇床培养24hr(第一次传代)。所得菌液继续以1‰v/v接种，在与前相同的条件下培养，最多重复至5次。每次培养结束的菌液用无菌生理盐水做10×梯度稀释。各稀释液分别取5μl点于lb和lb/amp平板上，于35℃温箱培养1天。在无氨苄青霉素的平板上可以估计菌液的细胞总数，在有氨苄青霉素的平板上可以估算菌液中带有质粒的细胞的数量(图3，图4，图5，图6)。
组成型表达质粒pplac-cada在无内源性质粒的蜂房哈夫尼菌宿主中极不稳定，即使在选择性的种子液中也出现质粒丢失(图4)；在有内源性质粒的宿主中稳定性较好，但经过2到3次连续传代后质粒丢失率达99％(图3)。与此相反，温控重组表达质粒ppr2-cada无论在有无内源性质粒的宿主中都十分稳定，经过5次连续传代，未出现明显质粒丢失(图5和6，对比图3和4)。
因此，在h.alvei中，温控重组表达质粒在菌株正常培养温度下能够保持稳定，有利于在发酵扩培过程中保持菌株性能的稳定；而在较高温度(如42℃)下温控表达质粒的表达强度在无内源性质粒的宿主中可以达到与组成型表达质粒pplac-cada相当，适用于以获得重组蛋白为目的的发酵生产。
sequencelisting
<110>上海凯赛生物技术研发中心有限公司凯赛生物产业有限公司
<120>一种重组表达质粒、转化子及其应用
<130>123456
<160>12
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>2148
<212>dna
<213>escherichiacoli
<400>1
atgaacgttattgcaatattgaatcacatgggggtttattttaaagaagaacccatccgt60
gaacttcatcgcgcgcttgaacgtctgaacttccagattgtttacccgaacgaccgtgac120
gacttattaaaactgatcgaaaacaatgcgcgtctgtgcggcgttatttttgactgggat180
aaatataatctcgagctgtgcgaagaaattagcaaaatgaacgagaacctgccgttgtac240
gcgttcgctaatacgtattccactctcgatgtaagcctgaatgacctgcgtttacagatt300
agcttctttgaatatgcgctgggtgctgctgaagatattgctaataagatcaagcagacc360
actgacgaatatatcaacactattctgcctccgctgactaaagcactgtttaaatatgtt420
cgtgaaggtaaatatactttctgtactcctggtcacatgggcggtactgcattccagaaa480
agcccggtaggtagcctgttctatgatttctttggtccgaataccatgaaatctgatatt540
tccatttcagtatctgaactgggttctctgctggatcacagtggtccacacaaagaagca600
gaacagtatatcgctcgcgtctttaacgcagaccgcagctacatggtgaccaacggtact660
tccactgcgaacaaaattgttggtatgtactctgctccggcaggcagcaccattctgatt720
gaccgtaactgccacaaatcgctgacccacctgatgatgatgagcgatgttacgccaatc780
tatttccgcccgacccgtaacgcttacggtattcttggtggtatcccacagagtgaattc840
cagcacgctaccattgctaagcgcgtgaaagaaacaccaaacgcaacctggccggtacat900
gctgtaattaccaactctacctatgatggtctgctgtacaacaccgacttcatcaagaaa960
acactggatgtgaaatccatccactttgactccgcgtgggtgccttacaccaacttctca1020
ccgatttacgaaggtaaatgcggtatgagcggtggccgtgtagaagggaaagtgatttac1080
gaaacccagtccactcacaaactgctggcggcgttctctcaggcttccatgatccacgtt1140
aaaggtgacgtaaacgaagaaacctttaacgaagcctacatgatgcacaccaccacttct1200
ccgcactacggtatcgtggcgtccactgaaaccgctgcggcgatgatgaagggtaatgct1260
ggtaagcgtctgatcaacggttccattgaacgtgcgatcaaattccgtaaagagatcaaa1320
cgtctgagaacggaatctgatggctggttctttgatgtttggcagccggatcatatcgat1380
acgactgaatgctggccgctgcgttctgacagcacctggcacggcttcaaaaacatcgat1440
aacgagcacatgtatcttgacccgatcaaagtcaccctgctgactccggggatggaaaaa1500
gacggcaccatgagcgactttggtattccggccagcatcgtggcgaaatacctcgacgaa1560
catggcatcgttgttgagaaaaccggtccgtataacctgctgttcctgttcagcatcggt1620
atcgataagaccaaagcactgagcctgctgcgtgctctgactgacttcaaacgtgcgttc1680
gacctgaacctgcgtgtgaaaaacatgctgccgtctctgtatcgtgaagatcctgaattc1740
tatgaaaacatgcgtattcaggaactggctcaaaatatccacaaactgattgttcaccac1800
aatctgccggatctgatgtatcgcgcatttgaagtgctgccgacgatggtaatgactccg1860
tatgctgcgttccagaaagagctgcacggtatgaccgaagaagtttacctcgacgaaatg1920
gtaggtcgtattaacgccaatatgatccttccgtatccgccgggagttcctctggtaatg1980
ccgggtgaaatgatcaccgaagaaagccgtccggttctggagttcctgcagatgctgtgt2040
gaaatcggcgctcactatccgggctttgaaaccgatattcacggtgcataccgtcaggct2100
gatggccgctataccgttaaggtattgaaagaagaaagcaaaaaataa2148
<210>2
<211>2142
<212>dna
<213>escherichiacoli
<400>2
atgaacatcattgccattatgggaccgcatggcgtcttttataaagatgagcccatcaaa60
gaactggagtcggcgctggtggcgcaaggctttcagattatctggccacaaaacagcgtt120
gatttgctgaaatttatcgagcataaccctcgaatttgcggcgtgatttttgactgggat180
gagtacagtctcgatttatgtagcgatatcaatcagcttaatgaatatctcccgctttat240
gccttcatcaacacccactcgacgatggatgtcagcgtgcaggatatgcggatggcgctc300
tggttttttgaatatgcgctggggcaggcggaagatatcgccattcgtatgcgtcagtac360
accgacgaatatcttgataacattacaccgccgttcacgaaagccttgtttacctacgtc420
aaagagcggaagtacaccttttgtacgccggggcatatgggcggcaccgcatatcaaaaa480
agcccggttggctgtctgttttatgattttttcggcgggaatactcttaaggctgatgtc540
tctatttcggtcaccgagcttggttcgttgctcgaccacaccgggccacacctggaagcg600
gaagagtacatcgcgcggacttttggcgcggaacagagttatatcgttaccaacggaaca660
tcgacgtcgaacaaaattgtgggtatgtacgccgcgccatccggcagtacgctgttgatc720
gaccgcaattgtcataaatcgctggcgcatctgttgatgatgaacgatgtagtgccagtc780
tggctgaaaccgacgcgtaatgcgttggggattcttggtgggatcccgcgccgtgaattt840
actcgcgacagcatcgaagagaaagtcgctgctaccacgcaagcacaatggccggttcat900
gcggtgatcaccaactccacctatgatggcttgctctacaacaccgactggatcaaacag960
acgctggatgtcccgtcgattcacttcgattctgcctgggtgccgtacacccattttcat1020
ccgatctaccagggtaaaagtggtatgagcggcgagcgtgttgcgggaaaagtgatcttc1080
gaaacgcaatcgacccacaaaatgctggcggcgttatcgcaggcttcgctgatccacatt1140
aaaggcgagtatgacgaagaggcctttaacgaagcctttatgatgcataccaccacctcg1200
cccagttatcccattgttgcttcggttgagacggcggcggcgatgctgcgtggtaatccg1260
ggcaaacggctgattaaccgttcagtagaacgagctctgcattttcgcaaagaggtccag1320
cggctgcgggaagagtctgacggttggtttttcgatatctggcaaccgccgcaggtggat1380
gaagccgaatgctggcccgttgcgcctggcgaacagtggcacggctttaacgatgcggat1440
gccgatcatatgtttctcgatccggttaaagtcactattttgacaccggggatggacgag1500
cagggcaatatgagcgaggaggggatcccggcggcgctggtagcaaaattcctcgacgaa1560
cgtgggatcgtagtagagaaaaccggcccttataacctgctgtttctctttagtattggc1620
atcgataaaaccaaagcaatgggattattgcgtgggttgacggaattcaaacgctcttac1680
gatctcaacctgcggatcaaaaatatgctacccgatctctatgcagaagatcccgatttc1740
taccgcaatatgcgtattcaggatctggcacaagggatccataagctgattcgtaaacac1800
gatcttcccggtttgatgttgcgggcattcgatactttgccggagatgatcatgacgcca1860
catcaggcatggcaacgacaaattaaaggcgaagtagaaaccattgcgctggaacaactg1920
gtcggtagagtatcggcaaatatgatcctgccttatccaccgggcgtaccgctgttgatg1980
cctggagaaatgctgaccaaagagagccgcacagtactcgattttctactgatgctttgt2040
tccgtcgggcaacattaccccggttttgaaacggatattcacggcgcgaaacaggacgaa2100
gacggcgtttaccgcgtacgagtcctaaaaatggcgggataa2142
<210>3
<211>2220
<212>dna
<213>hafniaalvei
<400>3
atgaatatcattgccatcatgaacgatttaagcgcttattttaaggaagaacccctgcgc60
gagctgcatcaagagttagagaaggaaggcttccgtattgcttatcccaaagaccgcaac120
gatctgctgaagctgattgaaaacaactcccgcctgtgtggcgtcattttcgactgggat180
aaatataacctcgaactcagcgctgaaatcagcgagctcaacaaactgctgccaatttat240
gccttcgccaatacctattcgacgcttgacgtcaacatgagcgacctgcgtcttaatgtt300
cgcttctttgaatatgcattaggcagcgcgcaagacattgccaccaagatccgccaaagc360
accgatcagtatattgataccattctgccaccgctgaccaaggcgctgttcaaatacgtc420
aaagaagagaaatacacagtctgtacgccggggcatatgggcggaactgcgttcgataaa480
agccctgtcggtagcctgttctatgatttcttcggtgaaaacaccatgcgttcggatatc540
tcgatctccgtatctgagctcggatcgctgctcgatcatagcggcccacaccgtgacgcc600
gaagagtatatcgcgcgcacgttcaacgccgatcgcagctatatcgtaaccaacggaaca660
tctacggcgaataaaattgtcggcatgtattcatctcctgccggtgccactattctgata720
gaccgtaactgccataaatcattgacccatttgatgatgatgagcaacgttgtccccgtc780
tatctgcgcccaacccgtaacgcctacggcattttaggcgggataccgcaaagcgagttc840
acccgcgccagcattgaagagaaagtgaaaaatacgcccaatgcgacatggccggtgcat900
gcggtagtcaccaactctacctatgacggcctgttctacaataccgaatacatcaaaaac960
acgcttgatgttaagtcgattcacttcgattcggcatgggtgccttacaccaacttccat1020
ccgatttaccaaggcaaagcagggatgagcggtgaacgtgtgccggggaaaatcatctac1080
gagactcagtccacccacaaactgctggcggcattctcgcaggcatcgatgatccacgtg1140
aaaggtgagatcaacgaagaaaccttcaatgaagcctatatgatgcatacctcaacatca1200
ccgcattacgggatcgttgcgtcgacggaaaccgcggcggctatgatgaagggcaacgcc1260
ggtaagcgtttaattaacggttcaattgaacgagcgatccgcttccgtaaagagatccgc1320
cgcttacgtacagaatctgatggctggttctttgacgtatggcagccggataacattgac1380
gaggttgcttgctggccactcaatccacgtaatgaatggcatggattcccgaacatcgac1440
aacgatcatatgtatcttgatccgatcaaagtcactctgctgaccccaggtttaagcccc1500
aatggcactctggaagaggaagggataccggcgtcgatcgtgtcgaaatatctggatgag1560
cacggcatcatcgtggaaaaaaccgggccatataacctgctcttcctgtttagtatcggg1620
atcgataaaaccaaggcgttgagcttgttgcgggcattaaccgatttcaaacgcgtgtat1680
gacctcaacctgcgcgtgaaaaacgtgttgccatcgctctataacgaggcgcctgatttc1740
tataaagagatgcgaattcaggagttggctcaggggattcatgctctggtgaaacaccac1800
aatctaccagacctgatgtatcgtgcatttgaggtattaccaaagctggtgatgacgccg1860
catgatgcgttccaagaagaagtgcgtggcaatattgagccatgtgccttggatgatatg1920
ttagggaaagttagcgccaacatgatcttgccgtatcctccgggtgttccggtggttatg1980
ccgggagaaatgctcactaaggagagccgccctgttctgagcttcttgcagatgctatgt2040
gaaattggcgcacactatccgggctttgaaacggatattcacggcgttcatcgtgatggt2100
gcaacgggtaaatacatggtcgtggtgctcaaacaaggcgcagatgaaccgggtgataaa2160
ccgagtgatacggtgaagaaagcgccgggtaaaaaaccatcagcggcgaagaagtcataa2220
<210>4
<211>32
<212>dna
<213>artificialsequence
<220>
<223>primer
<400>4
actgacggatcctcagccaaacgtctcttcag32
<210>5
<211>40
<212>dna
<213>artificialsequence
<220>
<223>primer
<400>5
acaggctccaagccaagctttcctgacggaatgttaattc40
<210>6
<211>41
<212>dna
<213>artificialsequence
<220>
<223>primer
<400>6
aagcttggcttggagcctgttggtgcggtcatggaattacc41
<210>7
<211>47
<212>dna
<213>artificialsequence
<220>
<223>primer
<400>7
actgacagatctacctccttagtacatgcaaccattatcaccgccag47
<210>8
<211>39
<212>dna
<213>artificialsequence
<220>
<223>primer
<400>8
actgacagatctatgaacgttattgcaatattgaatcac39
<210>9
<211>32
<212>dna
<213>artificialsequence
<220>
<223>primer
<400>9
actgacggatcccttcctcgctcactgactcg32
<210>10
<211>55
<212>dna
<213>artificialsequence
<220>
<223>primer
<400>10
caatattgcaataacgttcatacaacctccttagtacatgcaaccattatcaccg55
<210>11
<211>55
<212>dna
<213>artificialsequence
<220>
<223>primer
<400>11
cggtgataatggttgcatgtactaaggaggttgtatgaacgttattgcaatattg55
<210>12
<211>20
<212>dna
<213>artificialsequence
<220>
<223>primer
<400>12
caggcttacatcgagagtgg20