本发明涉及生物技术领域，具体涉及重组腺相关病毒载体携带人为设计肌微管素基因（mtm1）表达框的x染色体连锁肌小管肌病基因药物。
背景技术：
x连锁肌小管肌病(x-linkedmyotubularmyopathy，xlmtm)是一种先天性肌肉失养症，主要是肌原纤维行成肌小管时发生障碍，导致肌小管形成不良，因而使肌肉组织发展中断并停留在胎儿时期的肌肉组织，病患肌肉切片可发现肌肉细胞，但细胞核并未如同成熟的肌肉组织散布在肌肉纤维周围，而是位于细胞中央。xlmtm疾病由x染色体连锁的肌微管素（myotubularin，mtm1）基因突变引起。mtm1基因编码一种磷酸酶，能够调节细胞中pip和pip2的比例，在细胞信号转导过程中发挥重要作用。肌微管素（下简称“mtm1蛋白”）在细胞中广泛表达，但只在肌肉细胞中表现出功能。mtm1基因突变导致xlmtm疾病，发病率为1/50000新生男婴（amburgeyk,etal.neurology.2017;89(13):1355-1364.）。目前xlmtm疾病无有效的治疗药物和方法，酶替代治疗和基因治疗是可能的治疗策略。
2013年，lawlormw等评价了融合抗体结合fv片段的mtm1蛋白在xlmtm小鼠模型的作用效果（lawlormw,etal.humanmoleculargenetics.2013;22:1525-1538.）。结果发现该蛋白可有效提高模型小鼠中的肌肉力量和逆转病变特征，显示出一定的治疗作用。虽然抗体结合fv片段增加了mtm1蛋白在体内的靶向性，但是由于mtm1蛋白在细胞内起作用，需要蛋白穿透细胞膜进入细胞质中，效率偏低，对效果影响较大。作为蛋白药物，需要持续给药，病人依从性偏低，不是一种理想的治疗药物候选。在基因药物研究方面，2008年buj-belloa等研究结果显示携带mtm1基因表达框aav载体肌肉注射xlmtm小鼠模型可有效地恢复注射部位附近的肌肉功能（buj-belloa,etal.humanmoleculargenetics.2008;17:2132-2143.），从原理上证明了基因治疗xlmtm的可行性。随后，childersmk等构建了肌肉特异性启动子调控表达的小鼠mtm1基因表达框和狗mtm1基因表达框，包装成aav8病毒，静脉注射至xlmtm模型小鼠和模型狗体内，表达产生mtm1蛋白，恢复模型的正常机能，延长生存期（childersmk,etal.scitranslmed.2014;6:220ra10.）。该研究说明了系统给药用于治疗xlmtm的可行性。2017年mackdl等进一步在xlmtm狗模型中证实aav8介导的系统给药基因治疗可有效纠正全身的mtm1基因突变（mackdl,etal.molther.2017;25(4):839-854.），为基于aav8载体的xlmtm基因药物走向临床试验奠定了科学基础。专利（wo2014/167253a1）报道了xlmtm的基因治疗方法，该方法采用aav载体携带肌肉特异性启动子调控的mtm1基因表达单元，静脉注射系统给药，aav载体血清型为aav8和aav9。美国专利（us9895426）报道了同专利（wo2014/167253a1）类似的xlmtm基因治疗方法。主要的不同在于美国专利（us9895426）使用了xlmtm模型小鼠和xlmtmt模型狗等两种动物模型来验证基因药物的有效性。基于上述研究结果，多种xlmtm基因药物进入临床研究阶段（https://clinicaltrials.gov/），相关临床试验项目数为2。
在充分调研别人工作的基础上，我们设计了一种用于xlmtm的基因治疗药物raav-mck-hmtm1-122t-142t。首先，我们优化合成了人mtm1基因编码序列（hmtm1），通过序列优化，消除了mrna二级结构、稀有密码子和隐蔽剪接位点对mtm1基因编码序列转录和翻译的影响，提高了基因表达水平。其次，采用小鼠肌酸激酶（mck）启动子调控hmtm1的转录，mck启动子具有肌肉组织特异性好、转录水平高、序列短小等特点（shieldma,etal.molcellbiol.1996;16(9):5058-5068.），有助于hmtm1特异性在肌肉组织中高效表达。此外，在基因的3’utr（untranslatedregion）区加入mir-142-3p靶序列，最大限度地抑制hmtm1基因在免疫相关细胞（如抗原呈递细胞）中表达，显著降低针对mtm1蛋白免疫反应的产生概率（boisgeraultf,etal.humgenether.2013;24(4):393-405.）。利用正常肝脏特异性高表达mir-122的特点（joplingc.rnabiol.2012;9(2):137-142.），在3’utr中设计mir-122靶序列，降低hmtm1基因在肝细胞中表达，增强其安全性。选择安全、不致病的重组aav载体（dismukedj,etal.currgenether.2013;13(6):434-452.）携带hmtm1基因表达框。进一步提高了药物开发成功的可能性。
腺相关病毒（adeno-associatedvirus，aav）因在腺病毒制品中发现而得名（atchisonrw,etal.science.1965;149:754-756.hogganmd,etal.procnatlsciusa.1966;55:1467-1474.）。aav是微小病毒科(parvovirus)成员，包含多种血清型，其基因组为单链dna(roseja,etal.procnatlacadsciusa.1969;64:863-869.)，其中aav2的基因组大小为4682个核苷酸。aav是依赖性病毒，需要其它病毒如腺病毒、单纯疱疹病毒和人乳头瘤病毒(geoffroymc,etal.currgenether.2005;5(3):265-271.)，或辅助因素提供辅助功能才能复制。在没有辅助病毒存在时，aav感染细胞后其基因组将整合到细胞染色体中成为潜伏状态(chiorinija,etal.currtopmicrobiolimmunol.1996;218:25-33.)，而不产生子代病毒。
最早分离到的aav病毒是血清型2型aav（aav2）(atchisonrw,etal.science.1965;149:754-756.)。aav2基因组长约4.7kb，基因组两端为长度145bp的“反向末端重复序列”（invertedterminalrepeat,itr），呈回文-发卡结构(lusbye,etal.jvirol.1980;34:402-409.)。基因组中有两个大开放阅读框（orf），分别编码rep和cap基因。aav2的全长基因组已克隆至大肠杆菌质粒中(samulskirj,etal.procnatlacadsciusa.1982;79:2077-2081.laughlinca,etal.gene.1983;23:65-73.)。
itr是aav载体基因组的顺式作用元件，在aav病毒的整合、拯救、复制和基因组包装中发挥重要作用(xiaox,etal.jvirol.1997;71(2):941-948.)。itr序列中包含rep蛋白结合位点（repbindingsite，rbs）和末端解链位点trs（terminalresolutionsite），能够被rep蛋白结合识别并在trs处产生切口(lindenrm,etal.procnatlacadsciusa.1996;93(15):7966-7972.)。itr序列还可形成独特的“t”字母型二级结构，在aav病毒的生活周期中发挥重要作用(ashktorabh,etal.jvirol.1989;63(7):3034-3039.)。
aav2基因组其余部分可分为2个功能区，rep基因区和cap基因区(srivastavaa,etal.jvirol.1983;45(2):555-564.)。rep基因区编码rep78、rep68、rep52和rep40四种rep蛋白。rep蛋白对于aav病毒的复制、整合、拯救和包装都具有重要作用。其中rep78和rep68与itr中的末端解链位点trs（terminalresolutionsite）和gagy重复基序（repeatmotif）特异性结合(hüserd,etal.plospathog.2010;6(7):e1000985.)，启动aav基因组由单链向双链的复制过程。itr中trs和gagc重复基序是aav基因组复制的中心，因此虽然在各种血清型的aav病毒中itr序列都不尽相同，但是都能形成发卡结构和存在rep结合位点。在aav2基因组图谱位置19处有p19启动子，分别表达rep52和rep40。rep52和rep40没有结合dna的功能，而有atp依赖的dna解旋酶活性。cap基因编码aav病毒的衣壳蛋白vp1、vp2和vp3。其中，vp3分子量最小，但数量最多，在成熟的aav颗粒中vp1、vp2、vp3的比例大致为1:1:10。vp1是形成有感染性的aav所必需的；vp2协助vp3进入细胞核；vp3是组成aav颗粒的主要蛋白。
随着对aav病毒生活周期及其相关分子生物学机制的了解，aav病毒被改造成了一种高效的外源基因转移工具，即aav载体。改造后的aav载体基因组中只包含aav病毒的itr序列和携带转运的外源基因表达框，病毒包装需要的rep和cap蛋白通过外源质粒反式提供，降低了rep和cap基因包装入aav载体可能带来的危害。加之，aav病毒本身不具有致病性，使aav载体成为公认的最安全的病毒载体之一。删除aav病毒的一侧itr序列中的d序列和trs（terminalresolutionsite）序列还能够使包装得到的重组aav病毒载体携带基因组自我互补，形成双链，显著提高aav载体的体内外转导效率（wangz,etal.genether.2003;10(26):2105-2111.mccartydm,etal.genether.2003;10(26):2112-2118.）。包装得到的病毒成为scaav（self-complementaryaav）病毒，即所谓的双链aav病毒。不同于双侧itr均未突变的ssaav（single-strandedaav），即传统的aav病毒。scaav病毒的包装容量更小，仅为ssaav包装容量的一半，约为2.2kb-2.5kb，但感染细胞后转导效率更高。aav病毒血清型众多，不同的血清型具有不同的组织感染嗜性，因此应用aav载体能够将外源基因转运至特定的器官和组织(wuz,etal.molther.2006;14(3):316-327.)。某些血清型aav载体还可穿越血脑屏障，将外源基因导致大脑神经元中，为靶向大脑的基因转导提供了可能(samaranchl,etal.humgenether.2012;23(4):382-389.)。此外，aav载体的理化性质稳定，对酸碱和高温体现出较强的耐受性(gruntmanam,etal.humgenethermethods.2015;26(2):71-76.)，容易开发出稳定性较高的生物制品。
aav载体还具有相对成熟的包装系统，便于规模化生产。目前国内外常用的aav载体包装系统主要包括三质粒共转染系统、腺病毒为辅助病毒系统、单纯疱疹病毒（herpessimplexvirustype1，hsv1）为辅助病毒的包装系统以及基于杆状病毒的包装系统。其中，三质粒转染包装系统因无需辅助病毒，安全性高，是应用最为广泛的aav载体包装系统，也是目前国际上主流的生产系统。略显不足的是，高效大规模转染方法的缺失限制了三质粒转染系统在aav载体大规模制备中的应用。yuan等建立以腺病毒为辅助病毒的aav大规模包装系统（yuanz,etal.humgenether,2011,22(5):613-624.），该系统生产效率高，但包装系统中腺病毒在最后aav成品中的痕量存在，影响了aav成品的安全性。hsv1作为辅助病毒的包装系统是另一类应用较为广泛的aav载体包装系统。伍志坚和conway等几乎同时在国际上提出了以hsv1为辅助病毒的aav2载体包装策略（伍志坚，吴小兵等。科学通报，1999，44（5）：506-509。conwayje,etal.genether,1999,6:986-993.）。随后wustner等提出了以hsv1为辅助病毒的aav5载体包装策略（wustnerjt,etal.molther,2002,6(4):510-518.）。在此基础上，booth等利用两个hsv1分别携带aav的rep/cap基因和aav的反向末端序列（invertedterminalrepeat，itr）/外源基因表达框，然后两个重组hsv1病毒共同感染生产细胞，包装产生aav病毒（boothmj,etal.genether,2004,11:829-837.）。thomas等进一步建立双hsv1病毒aav生产的悬浮细胞系统（thomasdl,etal.genether,2009,20:861-870.），使更大规模的aav病毒生产成为可能。另外，urabe等利用三个杆状病毒分别携带aav的结构、非结构和itr/外源基因表达框，构建了aav载体的杆状病毒包装系统。考虑到杆状病毒携带外源基因的不稳定性，随后减少了生产系统中所需杆状病毒的个数，逐渐从最开始的需要三个杆状病毒到需要两或一个杆状病毒（chenh.molther.2008;16(5):924-930.galibertl,etal.jinvertebrpathol,2011,107suppl:s80-93.）以及一个杆状病毒加一株诱导细胞株策略（mietzschm,etal.humgenether.2014;25:212-222.mietzschm,etal.humgenether.2015;26(10):688-697.）。每种包装系统都各具特点，可根据需要做出合适的选择。
由于上述特点，aav载体逐渐成为一种广泛应用于基因治疗，特别是遗传病的基因治疗的外源基因转运工具。截至2017年11月，世界上批准的机遇aav载体的基因治疗临床试验方案有204项（http://www.abedia.com/wiley/vectors.php）。更为重要的是，基于aav载体的脂蛋白脂酶基因治疗药物glybera已于2012年被欧洲药监局批准上市，成为西方世界批准的第一个基因治疗药物（ylä-herttualas.molther.2012;20(10):1831-1832.）；2017年12月19日美国fda批准先天性黑曚症（rpe65基因突变引起）基因治疗药物luxturna上市，成为美国第一个罕见病的基因治疗药物（https://www.fda.gov/newsevents/newsroom/pressannouncements/ucm589467.htm）。血友病b（kayma,etal.natgenet.2000;24(3):257-261.）的aav载体基因治疗药物均取得不错的临床试验效果，预期在不久的将来会上市销售，造福广大患者。
本发明中，我们选择aav载体来携带hmtm1基因表达框，主要是基于aav载体的以下特点。其一，aav载体仅保留野生型病毒中包装需要的两个itr序列，不含有野生型病毒基因组中的蛋白编码基因（salgenikm,etal.microbiolspectr.2015;3(4).），免疫原性低。其二，aav通常以不整合的染色体外遗传物质形式实现携带基因读框的持续稳定表达（chenzy,etal.molther.2001;3(3):403-410.），避免引导入基因随机整合而带来的安全性问题。其三，aav载体通过静脉注射、肌肉注射都具有较高的转导效率（wangz,etal.natbiotechnol.2005;23:321-328.bishlt,etal.humgenether.2008;19:1359-1368.zincarellic,etal.molther.2008;16:1073-1080.prasadkm,etal.genether.2011;18:43-52.rebuffata,etal.humgenether.2010;21(4):463-477.），保证hmtm1基因表达框能够在体内高效地表达mtm1蛋白。
为了降低机体产生针对mtm1蛋白免疫反应的概率，延长hmtm1基因持续稳定表达的时间。我们选择肌肉特异性高效表达的mck启动子，让导入的hmtm1基因在肌肉中特异高效表达。进一步，我们利用正常肝脏特异性高表达mir-122的特点（joplingc.rnabiol.2012;9(2):137-142.），在hmtm1基因表达框的3’utr区克隆入mir-122靶序列。借用mirna抑制基因表达的原理（kimvn.natrevmolcellbiol.2005;6(5):376-385.），肝细胞内的mir-122分子会抑制mtm1蛋白的表达，显著降低mtm1蛋白在肝脏中的表达。通过肌肉特异性启动子和mir-122靶序列调控，实现mtm1蛋白的靶向性表达。同时为了降低mtm1蛋白过表达可能带来的免疫反应，我们设计了mir-142-3p靶序列调控策略。由于mir-142-3p在造血干细胞系来源细胞中高表达（chencz,etal.science.2004;303(5654):83-86.），免疫细胞均分化来源于造血干细胞系，因此利用mirna抑制基因表达的原理（kimvn.natrevmolcellbiol.2005;6(5):376-385.），携带mir-142-3p靶序列的基因表达会在免疫细胞中受到明显抑制，从而降低机体产生针对基因表达产物免疫反应的概率（boisgeraultf,etal.humgenether.2013;24(4):393-405.）。
mirnas（micrornas）是广泛存在于人类和动物体内的长度为18至25个核苷酸（nucleotide，nt）的单链非编码rna(barteldp.cell.2004;116:281-297.kimvn.natrevmolcellbiol.2005;6:376-385.)。1993年mirna首先在秀丽线虫（c.elegans）中发现(leerc,etal.cell.1993;75:843-854.wightmanb,etal.cell.1993;75:855-862.)。c.elegans中lin-4基因能够下调lin-14基因的表达，但lin-4基因的编码产物不是蛋白质，而是一种小rna分子，表明自身编码小rna分子能够调节基因的表达。随后，多种类似的小rna分子在不同的物种和细胞中相继发现(lagos-quintanam,etal.science.2001;294:853-858.launc,etal.science.2001;294:858-862.leerc,etal.science.2001;294:862-864.)，mirna开始成为该类小rna的统称。mirna调节人类大约60%基因的表达(lewisbp,etal.cell.2005;120:15-20.friedmanrc,etal.genomeres.2009;19:92-105.)，在多种生理和病理过程中发挥重要作用(caretonm,etal.cellcycle.2007;6:2127-2132.ambrosv.cell.2003;113:673-676.schichelr,etal.oncogene.2008;27:5959-5974.)。
mirna基因通常位于基因组的外显子、内含子和基因间区中(olenaaf,etal.jcellphysiol.2010;222:540-545.kimvn,etal.trendsgenet.2006;22:165-173.)。在细胞内，mirna的产生过程如下述(winterj,etal.natcellbiol.2009;11:228-234.)。首先在细胞核中，mirna基因由rna聚合酶ii或iii启动转录产生初始产物pri-microrna；pri-microrna自我折叠部分序列形成茎环结构。随后，由核糖核酸酶iiidrosha和dgcr8分子组成的加工复合体作用pri-microrna，切去多余序列，留下60nt左右的茎环结构，即前体mirna分子pre-microrna(leey,etal.nature.2003;425:415-419.denliam,etal.nature.2004;432:231-235.gregoryri,etal.nature.2004;432:235-240.hanj,etal.genesdev.2004;18:3016-3027.landthalerm,etal.currbiol.2004;14:2162-2167.)。然后在转运蛋白exportin-5的协助下，pre-microrna从细胞核进入细胞质中(lunde,etal.science.2003;303:95-98.yir,etal.genesdev.2003;17:3011-3016.bohnsackmt,etal.rna.2004;10:185-191.)，经dicer酶加工去掉其茎环结构中的环形部分，变为双链rna分子(jiangf,etal.genesdev.2005;,19:1674-1679.saitok,etal.plosbiol.2005;3:e235.)。最后，双链rna分子被ago2等蛋白因子结合，其中一条链发生降解，另一条链和蛋白因子形成rna诱导沉默复合物（rnainducedsilencingcomplex，risc）。risc识别mrna中靶序列，通过降解mrna分子、促进mrna分子3’端去腺苷化和抑制翻译来降低mrna的表达水平，在转录后水平调节基因的表达(storzg,etal.curropinmicrobiol.2004;7:140-144.fabianmr,etal.annurevbiochem.2010;79:351-379.valencia-sanchezma,etal.genesdev.2006;20:515-524.)。因此利用细胞内高表达的mirna，在外源基因的3’utr(untranslatedregion)插入该mirna的靶序列，能够有效地抑制外源基因在导入细胞中的表达。
根据以上设计思路，我们制备得到raav-mck-hmtm1-122t-142t病毒，并设计制备得到无mirna靶序列的raav-mck-hmtm1对照病毒以及携带绿色荧光蛋白编码框的raav-mck-egfp对照病毒。将这些病毒分别等剂量注射至xlmtm小鼠模型体内，评价设计raav-mck-hmtm1-122t-142t的有效性。结果显示，相比raav-mck-egfp对照病毒，raav-mck-hmtm1-122t-142t和raav-mck-hmtm1都能够在xlmtm小鼠模型体内表达mtm1蛋白，恢复xlmtm小鼠模型肌肉的生理功能，延长模型小鼠的生存期。而且相比于raav-mck-hmtm1病毒，raav-mck-hmtm1-122t-142t病毒在模型小鼠肝脏中表达水平更低，显著降低了肝脏hmtm1过表达可能带来的毒性作用，更为重要的是hmtm1稳定持续表达时间更长，为xlmtm患者提供了新的治疗选择。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供一种基于aav载体的新型的xlmtm基因治疗药物。该药物由aav载体携带hmtm1基因表达框。序列优化得到人mtm1基因编码序列hmtm1，采用小鼠肌肉特异性启动子mck调控hmtm1序列的表达，在基因表达框的3’utr（untranslatedregion）区加入mir-142-3p靶序列。基于上述设计，预期该药物通过静脉注射后能够在xlmtm模型小鼠肌肉组织中高效表达产生mtm1蛋白，恢复模型小鼠的肌肉生理功能，延长生存期。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种治疗x连锁肌小管肌病（xlmtm）的基因治疗药物，其特征在于，该药物基于重组aav载体，利用aav载体通过静脉注射能高效地把药物效应元件导入体内，实现药物效应元件高效表达产生治疗作用的mtm1蛋白。为了实现mtm1的高效表达，根据不同血清型aav的转导特点，选用的aav载体血清型主要为aav8和aav9。
本发明提供的xlmtm基因治疗药物，其特征在于，对原有的人mtm1蛋白基因的编码区序列进行了消除稀有密码子、rna二级结构等优化得到hmtm1序列，采用小鼠肌酸激酶启动子（mck启动子）调控hmtm1序列的表达，保证了人mtm1蛋白在肌肉中特异高效表达；在基因表达框的3’utr中分别插入2个完全互补的人mir-122和mir-142-3p靶序列，基于mirna抑制基因表达的原理，mir-122在肝细胞中特异性高表达，显著降低mtm1蛋白在肝脏中的表达，mir-142-3p在人造血干细胞中表达水平高，人mtm1在包括抗原呈递细胞的人造血干细胞来源细胞中表达受到抑制，可降低机体产生针对人mtm1蛋白的免疫反应的概率，有助于人mtm1蛋白的持续表达。
本发明提供的xlmtm基因治疗药物，其特征在于，将该药物经静脉注射注射至xlmtm模型小鼠体内后，能在小鼠体内高效稳定持续地表达人mtm1蛋白，表达产生的mtm1蛋白能够恢复模型小鼠的肌肉生理功能，延长模型小鼠的生存期，从而起到治疗xlmtm的效果。
本发明提供的xlmtm基因治疗药物，其特征还在于，经静脉注射一次给药就能够长期持续地在xlmtm模型小鼠体内表达产生人mtm1蛋白，恢复模型小鼠的肌肉生理功能，延长生存期。
本发明用到的重要原始实验材料如下所示：
phelper质粒，来源于aavhelperfreesystem（agilenttechnologies，美国），由本公司购自agilenttechnologies公司并保存。该质粒包含三质粒共转染hek293细胞制备重组aav病毒所需要的腺病毒来源辅助功能基因e2a、e4和varna等。
paav-rc质粒，来源于aavhelperfreesystem（agilenttechnologies，美国），由本公司购自agilenttechnologies公司并保存。paav-rc质粒包含完整的aav2的rep和cap基因，在三质粒共转染包装制备重组aav2病毒中提供包装所必须的4种rep蛋白（rep78、rep68、rep52和rep40）和aav2外壳蛋白。
paav-r2c8质粒，由本公司构建保存。以aavhelperfreesystem（agilenttechnologies，美国）中的paav-rc质粒为基本骨架，用aav8基因组（genbankid：af513852）中外壳蛋白编码序列cap8（基因组中第2121至4337位序列）替换paav-rc质粒中第2013至4220位序列，即得paav-r2c8质粒。简要的构建过程为，根据前述思路获得paav-r2c8质粒序列信息，人工合成paav-r2c8质粒中hindiii至pmei酶切位点之间序列，采用标准的分子克隆方法，用合成序列替换paav-rc质粒中hindiii和pmei酶切位点之间序列获得paav-r2c8质粒。paav-r2c8质粒包含完整的aav8的cap基因和aav2的rep基因，在三质粒共转染包装制备重组aav8病毒中提供包装所必须的4种rep蛋白（rep78、rep68、rep52和rep40）和aav8外壳蛋白。
paav-r2c9质粒，由本公司构建保存。以aavhelperfreesystem（agilenttechnologies，美国）中的paav-rc质粒为基本骨架，用aav9外壳蛋白编码序列（genbankid：ay530579）替换paav-rc质粒中第2013至4220位序列，即得paav-r2c9质粒。简要的构建过程为，根据前述思路获得paav-r2c9质粒序列信息，人工合成paav-r2c9质粒中hindiii至pmei酶切位点之间序列，采用标准的分子克隆方法，用合成序列替换paav-rc质粒hindiii和pmei酶切位点之间序列获得paav-r2c9质粒。paav-r2c9质粒包含完整的aav9的cap基因和aav2的rep基因，在三质粒共转染包装制备重组aav9病毒中提供包装所必须的4种rep蛋白（rep78、rep68、rep52和rep40）和aav9外壳蛋白。
x连锁肌小管肌病小鼠模型制备种鼠，购自美国thejacksonlaboratory，商品名b6.cg-mtm1tm1itl/j，保种号018153。该种鼠性别为雌性，x染色体连锁mtm1（myotubularmyopathygene1）基因外显子4突变杂合子，突变的mtm1基因不能表达产生正常的mtm1蛋白（piersoncr,etal.hummolgenet.2012;21(4):811-25.）。该种鼠同雄性野生型c57bl/6j小鼠杂交后，大约一半的新生雄性小鼠mtm1基因突变，出现同人相似的x连锁肌小管肌病。
对照小鼠，c57bl/6j小鼠，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，用作动物实验的野生型对照。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1paav2neo载体结构示意图。本公司保存的两侧itr均为145bp野生型itr的aav载体paav2neo（dongx,etal.plosone.2010;5(10):e13479.）。itr，invertedterminalrepeat，长度为145bp的反向末端重复序列。cmvpromoter，人巨细胞病毒早期启动子。bghpolya，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。amp，氨苄青霉素抗性基因读框。neo，新霉素抗性基因读框。xhoi、kpni、ecori、sali、bglii、bamhi和apai均为限制性酶切位点。
图2paav2-mck-egfp载体结构示意图。itr，invertedterminalrepeat，长度为145bp的反向末端重复序列。mck，小鼠肌酸激酶启动子。bghpolya，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。amp，氨苄青霉素抗性基因读框。neo，新霉素抗性基因读框。
图3paav2-mck-egfp载体结构示意图。itr，invertedterminalrepeat，长度为145bp的反向末端重复序列。mck，小鼠肌酸激酶启动子。bghpolya，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。amp，氨苄青霉素抗性基因读框。neo，新霉素抗性基因读框。egfp，增强型绿色荧光蛋白编码区序列。
图4paav2-mck-hmtm1载体结构示意图。itr，invertedterminalrepeat，长度为145bp的反向末端重复序列。mck，小鼠肌酸激酶启动子。hmtm1，优化合成的人mtm1基因编码区序列。bghpolya，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。amp，氨苄青霉素抗性基因读框。neo，新霉素抗性基因读框。xhoi、kpni和ecori均为限制性酶切位点。
图5paav2-mck-hmtm1-122t-142t载体结构示意图。itr，invertedterminalrepeat，长度为145bp的反向末端重复序列。mck，小鼠肌酸激酶启动子。hmtm1，优化合成的人mtm1基因编码区序列。2×mir-122t，2个拷贝完全互补的人mir-122靶序列。2×mir-142-3pt，2个拷贝完全互补的人mir-142-3p靶序列。bghpolya，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。amp，氨苄青霉素抗性基因读框。neo，新霉素抗性基因读框。xhoi、kpni、ecori和bglii均为限制性酶切位点。
图6注射携带hmtm1基因表达框重组aav病毒延长xlmtm模型小鼠生存期。6种不同的重组aav病毒（aav8-mck-egfp、aav8-mck-hmtm1、aav8-mck-hmtm1-122t-142t、aav9-mck-egfp、aav9-mck-hmtm1、aav9-mck-hmtm1-122t-142t）以3×1013vg/kg（viralgenome，vg）的剂量经尾静脉注射xlmtm模型小鼠，其中aav8-mck-egfp和aav9-mck-egfp为对照病毒，每种病毒注射5只xlmtm模型小鼠，注射时xlmtm小鼠年龄为3周。注射病毒后，记录小鼠的生存期。wt，c57bl/6j野生性对照小鼠；ko-aav8-mck-egfp，注射aav8-mck-egfp病毒的xlmtm模型小鼠；ko-aav8-mck-hmtm1，注射aav8-mck-hmtm1病毒的xlmtm模型小鼠；ko-aav8-mck-hmtm1-122t-142t，注射aav8-mck-hmtm1-122t-142t病毒的xlmtm模型小鼠；ko-aav9-mck-egfp，注射aav9-mck-egfp病毒的xlmtm模型小鼠；ko-aav9-mck-hmtm1，注射aav9-mck-hmtm1病毒的xlmtm模型小鼠；ko-aav9-mck-hmtm1-122t-142t，注射aav9-mck-hmtm1-122t-142t病毒的xlmtm模型小鼠。
图7注射携带hmtm1基因表达框重组aav病毒的xlmtm模型小鼠的体重变化情况。6种不同的重组aav病毒（aav8-mck-egfp、aav8-mck-hmtm1、aav8-mck-hmtm1-122t-142t、aav9-mck-egfp、aav9-mck-hmtm1、aav9-mck-hmtm1-122t-142t）以3×1013vg/kg（viralgenome，vg）的剂量经尾静脉注射xlmtm模型小鼠，其中aav8-mck-egfp和aav9-mck-egfp为对照病毒，每种病毒注射5只xlmtm模型小鼠，注射时xlmtm小鼠年龄为3周。注射病毒后，不同时间点测定记录小鼠的体重。wt，c57bl/6j野生性对照小鼠；ko-aav8-mck-egfp，注射aav8-mck-egfp病毒的xlmtm模型小鼠；ko-aav8-mck-hmtm1，注射aav8-mck-hmtm1病毒的xlmtm模型小鼠；ko-aav8-mck-hmtm1-122t-142t，注射aav8-mck-hmtm1-122t-142t病毒的xlmtm模型小鼠；ko-aav9-mck-egfp，注射aav9-mck-egfp病毒的xlmtm模型小鼠；ko-aav9-mck-hmtm1，注射aav9-mck-hmtm1病毒的xlmtm模型小鼠；ko-aav9-mck-hmtm1-122t-142t，注射aav9-mck-hmtm1-122t-142t病毒的xlmtm模型小鼠。
图8注射病毒5周后小鼠90分钟内移动距离测试结果。6种不同的重组aav病毒（aav8-mck-egfp、aav8-mck-hmtm1、aav8-mck-hmtm1-122t-142t、aav9-mck-egfp、aav9-mck-hmtm1、aav9-mck-hmtm1-122t-142t）以3×1013vg/kg（viralgenome，vg）的剂量经尾静脉注射xlmtm模型小鼠，其中aav8-mck-egfp和aav9-mck-egfp为对照病毒，每种病毒注射5只xlmtm模型小鼠，注射时xlmtm小鼠年龄为3周。注射病毒2周后，记录小鼠90分钟内移动距离。wt，c57bl/6j野生性对照小鼠；ko-aav8-mck-egfp，注射aav8-mck-egfp病毒的xlmtm模型小鼠；ko-aav8-mck-hmtm1，注射aav8-mck-hmtm1病毒的xlmtm模型小鼠；ko-aav8-mck-hmtm1-122t-142t，注射aav8-mck-hmtm1-122t-142t病毒的xlmtm模型小鼠；ko-aav9-mck-egfp，注射aav9-mck-egfp病毒的xlmtm模型小鼠；ko-aav9-mck-hmtm1，注射aav9-mck-hmtm1病毒的xlmtm模型小鼠；ko-aav9-mck-hmtm1-122t-142t，注射aav9-mck-hmtm1-122t-142t病毒的xlmtm模型小鼠。
图9注射病毒3个月后小鼠90分钟内移动距离测试结果。6种不同的重组aav病毒（aav8-mck-egfp、aav8-mck-hmtm1、aav8-mck-hmtm1-122t-142t、aav9-mck-egfp、aav9-mck-hmtm1、aav9-mck-hmtm1-122t-142t）以3×1013vg/kg（viralgenome，vg）的剂量经尾静脉注射xlmtm模型小鼠，其中aav8-mck-egfp和aav9-mck-egfp为对照病毒，每种病毒注射5只xlmtm模型小鼠，注射时xlmtm小鼠年龄为3周。注射病毒3个月后，记录小鼠90分钟内移动距离。wt，c57bl/6j野生性对照小鼠；ko-aav8-mck-egfp，注射aav8-mck-egfp病毒的xlmtm模型小鼠；ko-aav8-mck-hmtm1，注射aav8-mck-hmtm1病毒的xlmtm模型小鼠；ko-aav8-mck-hmtm1-122t-142t，注射aav8-mck-hmtm1-122t-142t病毒的xlmtm模型小鼠；ko-aav9-mck-egfp，注射aav9-mck-egfp病毒的xlmtm模型小鼠；ko-aav9-mck-hmtm1，注射aav9-mck-hmtm1病毒的xlmtm模型小鼠；ko-aav9-mck-hmtm1-122t-142t，注射aav9-mck-hmtm1-122t-142t病毒的xlmtm模型小鼠。nd，由于注射病毒小鼠死亡，故未做测定。
图10不同肌肉组织肌微管素表达水平。6种不同的重组aav病毒（aav8-mck-egfp、aav8-mck-hmtm1、aav8-mck-hmtm1-122t-142t、aav9-mck-egfp、aav9-mck-hmtm1、aav9-mck-hmtm1-122t-142t）以3×1013vg/kg（viralgenome，vg）的剂量经尾静脉注射xlmtm模型小鼠，其中aav8-mck-egfp和aav9-mck-egfp为对照病毒，每种病毒注射5只xlmtm模型小鼠，注射时xlmtm小鼠年龄为3周。注射病毒3个月后，分离趾长伸肌、四头肌和横膈肌等代表性肌肉组织。提取组织细胞总蛋白，sds-page（十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）后，转移至pvdf膜，蛋白免疫印迹（westernblot）检测，以gapdh为内参照计算得到肌微管素的表达水平。wt，c57bl/6j野生性对照小鼠；ko-aav8-mck-egfp，注射aav8-mck-egfp病毒的xlmtm模型小鼠；ko-aav8-mck-hmtm1，注射aav8-mck-hmtm1病毒的xlmtm模型小鼠；ko-aav8-mck-hmtm1-122t-142t，注射aav8-mck-hmtm1-122t-142t病毒的xlmtm模型小鼠；ko-aav9-mck-egfp，注射aav9-mck-egfp病毒的xlmtm模型小鼠；ko-aav9-mck-hmtm1，注射aav9-mck-hmtm1病毒的xlmtm模型小鼠；ko-aav9-mck-hmtm1-122t-142t，注射aav9-mck-hmtm1-122t-142t病毒的xlmtm模型小鼠。
图11不同组织hmtm1基因表达水平检测结果。6种不同的重组aav病毒（aav8-mck-egfp、aav8-mck-hmtm1、aav8-mck-hmtm1-122t-142t、aav9-mck-egfp、aav9-mck-hmtm1、aav9-mck-hmtm1-122t-142t）以3×1013vg/kg（viralgenome，vg）的剂量经尾静脉注射xlmtm模型小鼠，其中aav8-mck-egfp和aav9-mck-egfp为对照病毒，每种病毒注射5只xlmtm模型小鼠，注射时xlmtm小鼠年龄为3周。注射病毒3个月后，分离心脏、肝脏、骨骼肌、肺、脾和肾等组织。提取组织总rna，定量pcr检测总rna中hmtm1rna拷贝数和gapdhrna拷贝数，计算hmtm1rna拷贝数和gapdhrna拷贝数的比值，用于表示hmtm1基因的表达水平。wt，c57bl/6j野生性对照小鼠；ko-aav8-mck-egfp，注射aav8-mck-egfp病毒的xlmtm模型小鼠；ko-aav8-mck-hmtm1，注射aav8-mck-hmtm1病毒的xlmtm模型小鼠；ko-aav8-mck-hmtm1-122t-142t，注射aav8-mck-hmtm1-122t-142t病毒的xlmtm模型小鼠；ko-aav9-mck-egfp，注射aav9-mck-egfp病毒的xlmtm模型小鼠；ko-aav9-mck-hmtm1，注射aav9-mck-hmtm1病毒的xlmtm模型小鼠；ko-aav9-mck-hmtm1-122t-142t，注射aav9-mck-hmtm1-122t-142t病毒的xlmtm模型小鼠。
具体实施方式
本发明公开了一种x连锁肌小管肌病的基因治疗药物，包含药物的设计、小量制备及功能验证，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。其中，如无特殊说明，实施例中涉及的各种反应试剂均可以通过商业渠道购买得到。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1质粒载体构建
为了构建获得包装重组aav病毒需要的paav2-mck-egfp、paav2-mck-hmtm1和paav2-mck-hmtm1-122t-142t质粒，我们首先以公司保存的paav2neo（图1）为基础，参考文献（shieldma,etal.molcellbiol.1996;16(9):5058-5068.）用mck启动子(seqidno.1)替换paav2neo载体中的cmv启动子，得到paav2-mck。接下来，将含有增强型绿色荧光蛋白编码序列的dna序列（seqidno.2）、人工优化设计合成的hmtm1序列(seqidno.3)和hmtm1-122t-142t序列（seqidno.4）（在hmtm1序列的终止密码子后依次添加2个人mir-122完全互补的靶序列和2个人mir-142-3p完全互补的靶序列）分别克隆入paav2-mck载体的kpni和ecori以及kpni和bglii酶切位点之间，得到paav2-mck-egfp、paav2-mck-hmtm1和paav2-mck-hmtm1-122t-142t载体。
（1）paav2-mck载体构建
参考文献（shieldma,etal.molcellbiol.1996;16(9):5058-5068.），在genebank数据库中搜索得到小鼠肌酸激酶（mck）启动子的序列编号（m21390.1），分析得到mck启动子序列，在启动子序列5’端添加xhoi限制性酶切位点“5’-ctcgag-3’”，在启动子序列的3’端添加kpni限制性酶切位点“5’-ggtacc-3’”，得到mck序列，序列信息如seqidno.1所示。将mck序列送南京金斯瑞生物技术有限公司合成，合成序列克隆入puc57-1.8k载体（南京金斯瑞生物科技有限公司），得到puc57-1.8k-mck。kpni和xhoi双酶切消化产生0.6kb的mck序列片段和1.8kb的载体片段，回收mck序列片段备用。用mck序列片段替换paav2neo载体中xhoi和kpni酶切位点之间的cmv启动子序列，酶切测序鉴定得到paav2-mck载体（见附图2）。
（2）对照病毒包装载体paav2-mck-egfp构建
以pcmv-c-egfp（碧云天生物技术有限公司，中国）为模板，设计引物egfp-f/egfp-r，pcr扩增egfp基因编码区序列，egfp-f和egfp-r引物中分别含有kpni和ecori酶切位点。扩增得到egfp编码区序列片段，用ecori和kpni双酶切消化后回收备用。用ecori和kpni分别双酶切消化paav2-mck载体，回收线性化的paav2-mck载体片段（约6.7kb）。将两个回收片段连接后转化e.colijm109感受态细胞（宝生物，大连），筛选、鉴定后得到含有egfp基因表达框的aav质粒载体paav2-mck-egfp（见附图3）。
egfp-f:5’-ataggtaccgccaccatggtgagcaag-3’(seqidno.5)
egfp-r:5’-gcggaattcttacttgtacagctcgtc-3’(seqidno.6)
（3）paav2-mck-hmtm1载体构建
在ncbi蛋白数据库中搜索得到人mtm1蛋白氨基序列参照（genbankid：np_000243），根据人密码子偏爱性等原则，南京金斯瑞生物科技有限公司合成得到hmtm1序列（seqidno.3）。合成hmtm1序列克隆入puc57simple载体（南京金斯瑞生物科技有限公司），得到puc57-hmtm1。kpni和ecori分别双酶切消化puc57-hmtm1载体和paav2-mck载体，回收hmtm1片段和线性化的paav2-mck载体片段，两片段连接后转化e.colijm109感受态细胞（宝生物，大连），筛选、鉴定得到paav2-mck-hmtm1载体（见附图4）。
（4）paav2-mck-hmtm1-122t-142t载体构建
将2个串联重复的人mir-122的完全互补的靶序列和2个串联重复的人mir-142-3p的完全互补的靶序列同优化得到的hmtm1基因序列依次拼接，得到hmtm1-122t-142t序列（seqidno.4）。由南京金斯瑞生物科技有限公司合成hmtm1-122t-142t序列。将合成的hmtm1-122t-142t序列克隆入puc57simple载体（南京金斯瑞生物科技有限公司），得到puc57-hmtm1-122t-142t载体。kpni和bglii分别双酶切消化puc57-hmtm1-122t-142t载体和paav2-mck载体，回收hmtm1-122t-142t片段和线性化的paav2-mck载体片段，两片段连接后转化e.colijm109感受态细胞（宝生物，大连），筛选、鉴定得到paav2-mck-hmtm1-122t-142t载体（见附图5）。
实施例2重组aav病毒制备及检定
参照文献（xiaox,etal.jvirol.1998;72(3):2224-2232.），应用三质粒包装系统包装重组aav病毒，采用氯化铯密度梯度离心法分离纯化包装得到aav病毒。简要地，aav载体质粒（paav2-mck-egfp、paav2-mck-hmtm1或paav2-mck-hmtm1-122t-142t）、辅助质粒（phelper）和aav的rep及cap蛋白表达质粒（paav-r2c8或paav-r2c9）按照1:1:1的摩尔比混匀后，采用磷酸钙方法转染hek293细胞，转染48h后，收获细胞和培养上清，应用氯化铯密度梯度离心法分离纯化重组aav病毒。包装纯化得到aav8-mck-egfp、aav8-mck-hmtm1、aav8-mck-hmtm1-122t-142t、aav9-mck-egfp、aav9-mck-hmtm1、aav9-mck-hmtm1-122t-142t等6种重组病毒。
采用定量pcr方法测定制备得到aav病毒的基因组滴度。具体过程如下：
针对mck启动子序列设计定量pcr检测用引物和探针：
mck-q-f：5’-acaccatggaggagaagctc-3’(seqidno.7)
mck-q-r：5’-gccgggaacatggaacagta-3’(seqidno.8)
mck-q-p：5’-ccctggtggagcccgtgcct-3’(seqidno.9)
mck-q-f和mck-q-r为引物，mck-q-p为探针。探针5’端用fam荧光蛋白标记，3’端连接blackberryquencher。引物和探针由thermofisherscientific合成。以mck-q-f和mck-q-r为引物特异性地扩增mck启动子中长度为95bp片段，采用taqman探针结合法，以1μg/μl的paav2-mck-egfp质粒及其10倍梯度稀释的样品为标准品，应用premixextaq(probeqpcr)试剂（takara，大连，中国），使用荧光定量pcr仪（型号：abi7500fast，abi）检测病毒基因组滴度。操作过程参见premixextaq(probeqpcr)试剂说明书。病毒的处理方法参见文献（aurnhammerc,etal.humgenethermethods.2012;23(1):18-28.）。
实施例3动物实验
x连锁肌小管肌病小鼠模型制备种鼠，购自美国thejacksonlaboratory，商品名b6.cg-mtm1tm1itl/j，保种号018153。该种鼠性别为雌性，x染色体连锁mtm1（myotubularmyopathygene1）基因外显子4突变杂合子，突变的mtm1基因不能表达产生正常的mtm1蛋白（piersoncr,etal.hummolgenet.2012;21(4):811-25.）。种鼠同雄性野生型c57bl/6j小鼠杂交后，对新生雄性小鼠进行mtm1基因突变检测，方法参见文献（buj-belloa,etal.pnas.2002;99(23):15060-15065.）。选择mtm1基因突变雄性小鼠用于后续实验。
将30只3周龄mtm1基因突变雄性小鼠随机分为6组，每组5只小鼠，分别经静脉注射aav8-mck-egfp、aav8-mck-hmtm1、aav8-mck-hmtm1-122t-142t、aav9-mck-egfp、aav9-mck-hmtm1和aav9-mck-hmtm1-122t-142t病毒，每只小鼠注射剂量为3×1013vg/kg，其中aav8-mck-egfp和aav9-mck-egfp为对照病毒。以不注射病毒的野生型c57bl/6j作为阳性对照。注射病毒后记录小鼠的生存期、不同时间点测定小鼠体重、注射病毒2周和3个月后进行90分钟内小鼠运动轨迹距离测试、注射病毒3个月后小鼠不同类型肌肉组织肌微管素表达水平以及不同器官肌肉微管素基因表达情况。
注射病毒后记录小鼠的生存期，结果如附图6所示。从图6的结果可知，注射egfp报告基因病毒（aav8-mck-egfp或aav9-mck-egfp）组xlmtm模型小鼠的生存期较短，均不超过68天。4组注射携带hmtm1基因表达aav病毒组（aav8-mck-hmtm1、aav8-mck-htmt1-122t-142t、aav9-mck-hmtm1和aav9-mck-htmt1-122t-142t）xlmtm模型小鼠的生存期都延长。而且注射aav8-mck-htmt1-122t-142t或aav9-mck-htmt1-122t-142t病毒小鼠的生存期延长时间明显多于注射aav8-mck-hmtm1或aav9-mck-hmtm1病毒小鼠，说明含有mirna靶序列的药物结构设计在小鼠模型体内的作用效果更好。更为重要的是，注射aav8-mck-htmt1-122t-142t或aav9-mck-htmt1-122t-142t病毒小鼠的生存期同野生性c57bl/6j小鼠未见明显差异，进一步说明该种药物设计有效性好。
注射病毒后不同时间测定小鼠的体重。在每一个体重测定时间点，只测定活着小鼠的体重，如果测定时小鼠死亡，则没有体重测定结果。结果如附图7所示。从图7的结果可知，注射egfp报告基因病毒（aav8-mck-egfp或aav9-mck-egfp）组xlmtm模型小鼠的体重增长缓慢或几乎不增长，直至死亡。相反，4组注射携带hmtm1基因表达aav病毒组（aav8-mck-hmtm1、aav8-mck-htmt1-122t-142t、aav9-mck-hmtm1和aav9-mck-htmt1-122t-142t）xlmtm模型小鼠的体重均随着时间延长而增加，且相比于野生型c57bl/6j小鼠的体重增加趋势未见明显差异。结果表明注射携带hmtm1基因表达框aav病毒可有效恢复xlmtm模型小鼠的生长发育过程。
注射病2周和3个月后注射病毒后进行90分钟内小鼠运动轨迹距离测试，测试方法参见文章（childersmk,etal.scitranslmed.2014;6:220ra10.）。结果如图8（注射病毒2周后）和图9（注射病毒3个月后）所示。从图8的结果可知，6组注射病毒xlmtm模型小鼠组同野生型c57bl/6j小鼠组之间均差异明显，且注射病毒组内之间未见明显差异，可能与病毒注射时间不长，病毒携带hmtm1基因未有效表达相关。从图9的结果可知，除了注射egfp报告基因病毒（aav8-mck-egfp或aav9-mck-egfp）组xlmtm模型小鼠都死亡，未获得检测数据外，4组注射携带hmtm1基因表达aav病毒组（aav8-mck-hmtm1、aav8-mck-htmt1-122t-142t、aav9-mck-hmtm1和aav9-mck-htmt1-122t-142t）xlmtm模型小鼠的运动轨迹距离均相比于野生型c57bl/6j小鼠组未见明显差异，说明4种病毒导入xlmtm模型小鼠体内都能有效地表达产生mtm1蛋白，恢复模型小鼠的运动能力。
注射病毒3个月后，每组各处死1只小鼠，注射egfp报告基因病毒（aav8-mck-egfp或aav9-mck-egfp）组xlmtm模型小鼠都已死亡，故未做本项检测，在图中标记为“nd”（图10）。采用蛋白免疫印迹法检测不同类型肌肉组织中mtm1蛋白表达情况，具体参见文章（childersmk,etal.scitranslmed.2014;6:220ra10.）。同参考文献的不同之处在于本发明中使用的人mtm1蛋白一抗购自药明康德（中国，货号：ap6809b-400），抗体为兔多抗，识别mtm1蛋白的c末端氨基酸序列。其余试剂同参考文献一致。检测结果如图10所示。从图10的结果可知，在三种不同类型的肌肉组织中，4组注射携带hmtm1基因表达aav病毒组（aav8-mck-hmtm1、aav8-mck-htmt1-122t-142t、aav9-mck-hmtm1和aav9-mck-htmt1-122t-142t）xlmtm模型小鼠的mtm1蛋白表达水平未见明显差异，且都不低于野生型c57bl/6j小鼠。结果表明注射携带hmtm1基因表达框aav病毒可有效地在xlmtm模型小鼠肌肉中表达产生mtm1蛋白。
选择上述处死小鼠，分离心脏、肝脏、骨骼肌、脾、肺和肾等器官，提取各种器官的总rna，定量pcr测定总rna中的hmtm1rna拷贝数和小鼠gapdhrna拷贝数，拷贝数用ct值表示，计算hmtm1rna的ct值和小鼠gapdhrna的ct值的差值，用于2的ct值差值的幂表示hmtm1rna的相对表达水平。
定量pcr方法测定总rna中hmtm1rna和小鼠gapdhrna的ct值。具体过程如下：
针对hmtm1rna序列设计定量pcr检测用引物和探针：
hmtm1-q-f：5’-gcagatcagcaagctgacaa-3’(seqidno.10)
hmtm1-q-r：5’-cgtcatcggactcgtatcct-3’(seqidno.11)
hmtm1-q-p：5’-cgcaaggccaagcgtgaacgca-3’(seqidno.12)。
针对小鼠gapdhrna序列设计定量pcr检测用引物和探针：
gapdh-q-f：5’-aacggatttggccgtattgg-3’(seqidno.13)
gapdh-q-r：5’-aatctccactttgccactgc-3’(seqidno.14)
gapdh-q-p：5’-cgcctggtcaccagggctgc-3’(seqidno.15)
hmtm1-q-f/hmtm1-q-r和gapdh-q-f/gapdh-q-r为引物，hmtm1-q-p和gapdh-q-p为探针。探针5’端用fam荧光蛋白标记，3’端连接blackberryquencher。引物和探针由thermofisherscientific合成。以hmtm1-q-f和hmtm1-q-r为引物特异性地扩增hmtm1序列中长度为92bp片段，以gapdh-q-f和gapdh-q-r为引物特异性地扩增gapdh序列中长度为66bp片段，采用一步反应taqman探针结合法测定检测样品中的hmtm1rna和gapdhrna的扩增ct值（表示拷贝数），应用onestepprimerscriptrt-pcrkit（perfectrealtime）试剂（takara，大连，中国），使用荧光定量pcr仪（型号：abi7500fast，abi）检测。操作过程参见onestepprimerscriptrt-pcrkit（perfectrealtime）试剂说明书。
定量pcr检测结果如附图11所示。从图11的结果可知，对于注射aav8-mck-hmtm1、aav8-mck-hmtm1-122t-142t、aav9-mck-hmtm1和aav9-mck-hmtm1-122t-142t病毒组小鼠，在心肌、骨骼肌等肌肉组织中hmtm1表达水平高，而且脾、肾和肺等器官中hmtm1表达水平低，说明aav8和aav9病毒本身的转导特性以及mck启动子的组织特异性可有效地使hmtm1基因特异性在肌肉组织中表达。进一步，静脉给药系统注射时，aav载体对肝脏转导效率高，在本发明中注射aav8-mck-hmtm1和aav9-mck-hmtm1病毒组小鼠的肝脏中可检测到hmtm1的表达，虽然由于mck肌肉特异性启动子的调控，hmtm1的表达水平不高，但仍可能带来不小的安全性风险。我们的实验结果表明在hmtm1表达框的3’utr加入肝脏中高表达的mir-122的靶序列可有效地抑制hmtm1基因的表达（图11），显著增强了hmtm1基因的肌肉特异性表达，增加了使用过程中的安全性。图11的结果显示在野生型小鼠中未检测到hmtm1基因的表达，这是因为hmtm1经过密码子优化后，其dna序列已不同于小鼠内源的mtm1rna序列，故针对hmtm1基因的定量pcr检测用探针和引物无法识别并结合小鼠mtm1rna序列，没有检测信号，也说明本发明中采用的定量pcr探针和引物可特异性地识别并结合hmtm1rna序列，检测结果可靠性高。在检测实验时，注射aav8-mck-egfp或aav9-mck-egfp小鼠已死亡，故图11中没有检测结果显示。
总之，从上述结果可知，本发明设计的aav8-mck-hmtm1、aav8-mck-hmtm1-122t-142t、aav9-mck-hmtm1和aav9-mck-hmtm1-122t-142t重组病毒经静脉给药导入xlmtm模型小鼠体内，均能在模型小鼠肌肉表达产生人mtm1蛋白，延长模型小鼠的生存期、恢复发育（体重增加）和生理功能。而且aav8-mck-hmtm1-122t-142t和aav9-mck-hmtm1-122t-142t病毒显示更好的组织特异性、模型小鼠的生存期延长时间更长，具有更大的开发潜力。
序列表
<110>北京五加和分子医学研究所有限公司
<120>x染色体连锁肌小管肌病的基因药物
<160>15
<170>siposequencelisting1.0
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<400>1
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