本发明涉及生物工程技术领域。
背景技术：
结核病(tuberculosis，tb)是由结核分枝杆菌(结核菌)感染而引起的传染性疾病。结核病是困扰人类时间最长、危害最大的传染病之一。1882年，结核病的病原菌结核分枝杆菌才被德国科学家科赫分离并鉴定。在此之前，结核病在全球范围内多次发生大规模流行，并且被称为“白色瘟疫”。自五十年代以来，人类不断发现了有效的抗结核药物，使tb的流行得到了一定控制。抗结核药物是一把双刃剑，它既能够治疗tb，但是它也能够导致结核分枝杆菌出现对应的抗结核药物耐药株。
在今天全球tb的防控面临巨大的挑战，尤其是结核分枝杆菌和hiv(tb/hiv)共感染，耐多药(multidrug-resistant，mdr)和广泛耐药(extensivelydrug-resistant，xdr)结核病病例的出现。用于治疗结核病的药物通常分为一线药物和二线药物，目前常用的一线药物主要有异烟肼(inh)，利福平(rif)，吡嗪酰胺(pza)和乙胺丁醇(emb)，一线药物疗效显著并能缩短整个治疗的周期。二线药物主要有：氨基糖苷类(aminoglycosides)：卡那霉素(kanamycin)和丁胺卡那霉素(amikacin)；环多肽类(polypeptides)：卷曲霉素(capreomycin)、紫霉素(viomycin)和恩维霉素(enviomycin)；氟喹诺酮类(fuoroquinolones)：氧氟沙星(ofoxacin)、加替沙星(gatifoxacin)和环丙沙星(ciprofloxacin)；环丝氨酸(d-cycloserine)；碳硫胺类(thionamides)：乙硫异烟胺(ethionamide，eth)和丙硫异烟胺(prothionamide)；pas。二线药物毒性更大并且没有一线药物显著的疗效，主要用于mdr-tb的治疗以及延长治疗时间。异烟肼于1956年发现，是一种应用广泛的一线抗结核药物。该药物发挥抗结核活性首先需要蛋白katg活化，活化后与nad形成有活性的抗结核化合物异烟肼烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(inh-nad)，该化合物结合到inha蛋白中进而抑制其活性并最终影响结核菌细胞壁中分枝菌酸(mycolicacid)的合成进而杀死结核菌(见下图)。异烟肼发挥抗结核活性必须是其活化后的化合物(inh-nad)，临床分离耐药性结核菌中inha蛋白通常会发生突变，从而导致inh-nad不能结合到inha蛋白上导致结核菌耐受inh作用。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服上述不足之处，提供一种在大肠杆菌细胞内直接合成inh-nad并快速高效纯化分离该化合物的方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种通过合成生物学制备异烟肼烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，包括步骤：
1).pcr扩增katg和inha的dna序列片段：
1-1).以seqid№1所示的引物katgbgliifp和seqid№2所示的引物katgecorirp，进行katg的pcr扩增；以seqid№3所示的引物inhancoifp和seqid№4所示的引物inhahindшrp，进行inha的pcr扩增；pcr扩增的目的dna片段经核酸凝胶电泳后回收，-20℃保存备用；
2).构建ptrchis2c-katg质粒：
2-1).扩大培养含有ptrchis2c质粒的大肠杆菌dh5α菌株，抽提ptrchis2c质粒；
2-2).将步骤1-1扩增后回收的katg序列片段和步骤2-1获得的ptrchis2c质粒分别都使用bglⅱ和ecorⅰ限制性内切酶进行双酶切；将酶切后回收的katg序列片段和线性化含有粘性末端的质粒ptrchis2c使用t4dna连接酶16℃连接，连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞并单克隆扩大培养，经抽提后获得pcdfduet-katg质粒；
3).构建pet28a-inha质粒：
3-1).扩大培养含有pet28a质粒的大肠杆菌dh5α菌株，抽提pet28a质粒；
3-2).将步骤1-1扩增后回收的inha序列片段和pet28a质粒分别都使用ncoi和hindⅲ限制性内切酶进行双酶切；将酶切后回收的inha序列片段和线性化含有粘性末端的质粒pet28a使用t4dna连接酶16℃连接反应过夜，连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞并单克隆扩大培养，经抽提后获得pet28a-inha质粒；
4).纯化inha蛋白：
4-1).将ptrchis2c-katg质粒和pet28a-inha质粒等量混合后共转化大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞单克隆扩大培养，控温16℃并添加0.5mmiptg诱导蛋白表达，继续200rpm震荡培养2-3小时，然后加入100mg/ml的异烟肼和10mm的mncl2培养16小时；
4-2).离心收集菌体，缓冲液洗涤后重悬，再超声破碎后离心取上清液经结合缓冲液预平衡的ni2+-nta亲和层析柱，然后使用5个柱体积的第一洗脱缓冲液洗脱不能结合到层析柱上杂蛋白，进一步使用第二洗脱缓冲液洗脱并收集获得的目的inha蛋白；所述第一洗脱缓冲液为50mmtris-hcl，0.5mnacl，80mm咪唑，ph8.0；所述第二洗脱缓冲液为50mmtris-hcl，0.5mnacl，250mm咪唑，ph8.0；
5).纯化inh-nad化合物：
5-1).使用millipore10k超滤管浓缩纯化的inha蛋白并使用ph8.0的50mmtris-hcl置换原有的洗脱液，将纯化的inha蛋白浓缩换液至1ml，将浓缩液100℃加热50秒，然后离心收集上清，将获得的上清液添加到milliporemicrocon3过滤柱中10000g4℃离心1小时过滤除去蛋白，离心滤液即含有inh-nad。
进一步，步骤2-1所述扩大培养是将大肠杆菌dh5α菌株接种于含有100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基37℃摇床200rpm震荡过夜培养。步骤2-2所述单克隆扩大培养是将大肠杆菌dh5α菌株涂布于含有100μg/ml氨苄青霉素的lb固体平板，平板放置37℃恒温培养箱培养过夜；挑取平板上长出的单克隆菌落接种于含有100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基37℃摇床200rpm震荡过夜培养。步骤2-2单克隆扩大培养获得的质粒使用bglⅱ和ecorⅰ限制性内切酶进行双酶切后经核酸凝胶电泳检测验证dna片段katg连接到ptrchis2c载体上获得质粒ptrchis2c-katg。
进一步，步骤3-1所述扩大培养是将大肠杆菌dh5α菌株接种于含有100μg/ml硫酸卡那霉素的lb液体培养基37℃摇床200rpm震荡过夜培养。步骤3-2所述单克隆扩大培养是将大肠杆菌dh5α菌株涂布于含有100μg/ml硫酸卡那霉素的lb固体平板，平板放置37℃恒温培养箱培养过夜；挑取平板上长出的单克隆菌落接种于含有100μg/ml硫酸卡那霉素的lb液体培养基37℃摇床200rpm震荡过夜培养。步骤3-2单克隆扩大培养获得的质粒使用ncoi和hindⅲ限制性内切酶进行双酶切后经核酸凝胶电泳检测验证dna片段inha连接到pet28a载体上获得质粒pet28a-inha。
进一步，步骤4-1所述单克隆扩大培养是将转化大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，并涂布于含有100μg/ml氨苄青霉素和100μg/ml硫酸卡那霉素的lb固体平板，平板放置37℃恒温培养箱培养过夜；挑取平板上长出的单克隆菌落接种于含有100μg/ml氨苄青霉素和100μg/ml硫酸卡那霉素的lb液体培养基37℃摇床200rpm震荡过夜培养，将液体培养的菌种1:100转接于新鲜的含有100μg/ml氨苄青霉素和100μg/ml硫酸卡那霉素的lb液体培养基37℃摇床200rpm震荡培养2-3小时至od600为0.6。步骤4-2所述离心收集菌体，缓冲液洗涤后重悬具体包括使用离心机4℃8500rpm收集培养好的细菌，菌体沉淀用结合缓冲液洗涤一次，然后重悬于50ml结合缓冲液，所述结合缓冲液为50mmtris-hcl，0.5mnacl，25mm咪唑，ph8.0。
进一步，步骤5-1后还包括检测鉴定inh-nad的步骤：
5-2).使用bio-teksynergyh1酶标仪全波长扫描检测其特征紫外吸收峰，以及使用高效液相色谱-电喷雾电离质谱联用仪进行分子量检测鉴定，所述电喷雾电离质谱工作参数：毛细管电压4.5kv；cdl9温度为250℃，加热模块温度为200℃；雾化氮气流速1.5l/min，压力0.02mpa；检测器压力1.4ev；采用负离子模式检测。
本发明的有益效果是：在大肠杆菌细胞内直接合成inh-nad并通过超滤管浓缩纯化和短时间加热后离心、过滤等步骤实现inh-nad的纯化分离。
附图说明
图1是纯化的inha蛋白通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图2是实施例1纯化收集到的目的蛋白经电喷雾电离质谱检测结果图；
图3是实施例1分光光度计检测inh-nad的检测结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考j.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：通过合成生物学制备异烟肼烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。
pcr扩增katg和inha的dna序列片段：pcr扩增katg和inha的dna序列片段分别使用引物对ethanfp/ethakrp和inhabfp/inhahrp进行扩增，引物序列如下：
katgbgliifp：5'-accaagatctatgcccgagcaacacccacc-3'(seqid№1)；
katgecorirp：5'-ccccgaattctcagcgcacgtcgaacct-3'(seqid№2)；
inhancoifp：5'-acaaccatgggaatgacaggactgctggacggc-3'(seqid№3)；
inhahindшrp：5'-atgcaagcttgagcaattgggtgtgcgcgccg-3'(seqid№4)。
pcr扩增的目的dna片段经核酸凝胶电泳后，使用omega公司胶回收试剂盒回收dna目的片段，回收后的dna片段。冻存-20℃冰箱备用。
构建ptrchis2c-katg质粒：
1)含有ptrchis2c质粒的大肠杆菌dh5α菌株接种lb液体培养基(含有100μg/ml氨苄青霉素)37℃摇床200rpm震荡过夜培养，然后使用omega公司质粒提取试剂盒抽提质粒ptrchis2c。
2)将pcr扩增回收的katg序列片段和试剂盒抽提的ptrchis2c质粒分别都使用bglⅱ和ecorⅰ限制性内切酶进行双酶切，酶切后的katg序列片段使用omega公司cycle-pure试剂盒回收；酶切后的ptrchis2c质粒进行琼脂糖凝胶电泳并使用omega公司胶回收试剂盒回收酶切后的线性化含有粘性末端的ptrchis2c质粒；将酶切后回收的katg序列片段和线性化的质粒ptrchis2c使用t4dna连接酶16℃连接反应过夜，连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞并涂布lb固体平板(含有100μg/ml氨苄青霉素)，平板放置37℃恒温培养箱培养过夜；挑取平板上长出的单克隆菌落接种lb液体培养基(含有100μg/ml氨苄青霉素)37℃摇床200rpm震荡过夜培养，然后使用omega公司质粒抽提试剂盒抽提质粒，获得的质粒使用bglⅱ和ecorⅰ限制性内切酶进行双酶切后经核酸凝胶电泳检测验证dnakatg序列片段连接到ptrchis2c载体上获得质粒ptrchis2c-katg。同时验证正确的质粒ptrchis2c-katg经擎科公司测序验证序列无突变。
构建pet28a-inha质粒：
1)含有pet28a质粒的大肠杆菌dh5α菌株接种lb液体培养基(含有100μg/ml硫酸卡那霉素)37℃摇床200rpm震荡过夜培养，然后使用omega公司质粒提取试剂盒抽提质粒pet28a。
2)将pcr扩增回收的inha序列片段和试剂盒抽提的pet28a质粒分别都使用ncoi和hindⅲ限制性内切酶进行双酶切，酶切后的inha序列片段使用omega公司cycle-pure试剂盒回收；酶切后的pet28a质粒进行琼脂糖凝胶电泳并使用omega公司胶回收试剂盒回收酶切后的线性化含有粘性末端的pet28a质粒；将酶切后回收的inha序列片段和线性化的质粒pet28a使用t4dna连接酶16℃连接反应过夜，连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞并涂布lb固体平板(含有100μg/ml硫酸卡那霉素)，平板放置37℃恒温培养箱培养过夜；挑取平板上长出的单克隆菌落接种lb液体培养基(含有100μg/ml硫酸卡那霉素)37℃摇床200rpm震荡过夜培养，然后使用omega公司质粒抽提试剂盒抽提质粒，获得的质粒使用ncoi和hindⅲ限制性内切酶进行双酶切后经核酸凝胶电泳检测验证inha序列片段连接到pet28a载体上获得质粒pet28a-inha。同时验证正确的质粒pet28a-inha经擎科公司测序验证序列无突变。
纯化inha蛋白：
将构建成功的ptrchis2c-katg和pet28a-inha质粒等量混合后共转化大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，并涂布lb固体平板(含有100μg/ml氨苄青霉素和100μg/ml硫酸卡那霉素)，平板放置37℃恒温培养箱培养过夜；挑取平板上长出的单克隆菌落接种lb液体培养基(含有100μg/ml氨苄青霉素和100μg/ml硫酸卡那霉素)37℃摇床200rpm震荡过夜培养，将液体培养的菌种1:100转接新鲜的1升lb液体培养基(含有100μg/ml氨苄青霉素和100μg/ml硫酸卡那霉素)37℃摇床200rpm震荡培养2-3小时至od600为0.6，然后将培养温度降至16℃并添加0.5mmiptg诱导蛋白表达，继续200rpm震荡培养2-3小时，然后加入100mg/ml的异烟肼(inh)培养16小时和10mmmncl2。使用离心机4℃8500rpm收集培养好的细菌，菌体沉淀用结合缓冲液(50mmtris-hcl，0.5mnacl，25mm咪唑，ph8.0)洗涤一次，然后重悬于50ml结合缓冲液中，超声破碎后，以12000rpm离心30min，上清液上样于经结合缓冲液预平衡的ni2+-nta亲和层析柱(ge公司histraphp层析柱)，然后使用5个柱体积的洗脱缓冲液1(50mmtris-hcl，0.5mnacl，80mm咪唑，ph8.0)洗脱不能结合到层析柱上杂蛋白，进一步使用洗脱缓冲液2(50mmtris-hcl，0.5mnacl，250mm咪唑，ph8.0)洗脱并收集获得的目的蛋白inha。纯化收集到的目的蛋白通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)进行检测，结果如图1所示。
纯化并检测inh-nad化合物：
使用millipore10k超滤管浓缩纯化的inha蛋白并使用50mmtris-hcl(ph8.0)置换原有的洗脱液，将纯化的inha蛋白浓缩换液至1ml。由于inh-nad化合物能够紧密结合到inha蛋白中，通过短时间加热让inha蛋白变性释放其结合的inh-nad化合物而又不影响其降解，因此将inha蛋白100℃加热50秒，然后使用离心机15000g4℃离心15分钟后，收集上清。将获得的上清液添加到milliporemicrocon3过滤柱中10000g4℃离心1小时过滤除去蛋白，收集离心下来的滤液即含有inh-nad化合物。inh-nad化合物同时使用bio-teksynergyh1酶标仪全波长扫描检测其特征紫外吸收峰和高效液相色谱(hplc)-电喷雾电离质谱(esi/ms)联用仪(液质联用仪)进行分子量检测鉴定。液质联用仪设备型号：(shimadzulcms-2010ev,tokyo,japan)。使用的分离柱是shim-packvp-odsc18柱(shimadzu，250×2.0mmi.d.，5μm)。esi/ms工作参数如下：毛细管电压4.5kv；cdl9(curveddesolvationline)温度为250℃，加热模块(heatblock)温度为200℃；雾化氮气流速1.5l/min，压力0.02mpa；检测器电压1.4ev；采用负离子模式检测。
质谱检测结果和分光光度计检测结果分别如图2和图3所示。
sequencelisting
<110>佛山科学技术学院
<120>一种通过合成生物学制备异烟肼烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法
<130>2018
<160>4
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>30
<212>dna
<213>人工序列
<400>1
accaagatctatgcccgagcaacacccacc30
<210>2
<211>28
<212>dna
<213>人工序列
<400>2
ccccgaattctcagcgcacgtcgaacct28
<210>3
<211>33
<212>dna
<213>人工序列
<400>3
acaaccatgggaatgacaggactgctggacggc33
<210>4
<211>32
<212>dna
<213>人工序列
<400>4
atgcaagcttgagcaattgggtgtgcgcgccg32