本发明涉及基因工程疫苗领域。具体地说，涉及猪圆环病毒3型病毒样颗粒的制备方法及其应用。
背景技术：
猪圆环病毒(porcinecircovirus,pcv)属于圆环病毒科圆环病毒属，是无囊膜的单股环状负链dna病毒，20面体对称，直径17-20nm。猪圆环病毒相关疾病是目前危害养猪业的一个主要疾病，临床表现为断奶仔猪多系统衰竭综合征(pmws)，呼吸道和肠道疾病，繁殖障碍和猪皮炎和肾病综合征(pdns)。pcv目前主要有3个血清型，即猪圆环病毒1型(pcv1)、猪圆环病毒2型(pcv2)和猪圆环病毒3型(pcv3)。其中，pcv1对猪没有致病性。pcv2和pcv3与猪的圆环病毒相关疾病密切相关。2015年，pcv3首次在美国被鉴定到。最近，华中农业大学的何启盖教授也在国内首次检测出致病性的pcv3。pcv3基因组含有3个主要的开放阅读框，即orf1，orf2和orf3。其中pcv3orf2由645个碱基组成，编码214个氨基酸，构成病毒的衣壳蛋白(cap)，是主要的免疫原性蛋白。pcv3与pcv2的同源性较低，目前防治pcv2的方法并不能很好的用于pcv3。因此，急需一种能够用于预防pcv3感染的有效疫苗。
病毒样颗粒(viruslikeparticles，vlp)是利用重组表达的方法，在体外将重组病毒衣壳蛋白组装成与天然病毒有相似结构的空心颗粒。该颗粒的特点是不含有病毒的遗传物质，其形态、大小、组成和抗原表位都与天然病毒相同或极为相似。具有良好的免疫原性，且安全性远好过传统疫苗。目前，vlp疫苗已成为新型疫苗研发的重要方向。然而vlp疫苗的研发难度较大。重组病毒衣壳蛋白只有在满足特定的条件下，才能自我组装成与天然病毒有相似结构的空心颗粒。因此，目前商品化的vlp疫苗较少。
表达与组装vlp疫苗的系统有很多。常用的有大肠杆菌表达系统、杆状病毒表达系统和酵母表达系统等。其中，相较其它的表达系统，大肠杆菌表达系统有着成本低，表达量大的优势。因此，大肠杆菌表达系统成为大批量生产的首选。但同时，大肠杆菌表达系统用于vlp制备也存在着许多技术难点。首先，因为密码子使用频率的不同，动物病毒的基因常常难于在大肠杆菌表达系统中表达。其次，大肠杆菌分子伴侣较少，常常造成重组蛋白无法正确的折叠，从而影响重组衣壳蛋白组装成vlp。另外，相对于真核表达系统，大肠杆菌缺乏很多关键的蛋白酶，无法去除阻碍衣壳蛋白组装的多余氨基酸序列。针对不同的动物病毒都需要摸索出特定的表达与包装条件，才能使用大肠杆菌表达系统制备出相应的vlp。
pcv3作为猪源病毒，其cap蛋白在大肠杆菌中的表达量受着密码子使用频率偏好性的影响，cap蛋白本身含有大量的疏水氨基酸，其在大量表达时容易形成不可溶的包涵体，从而无法形成vlp结构，另外，cap蛋白自组装成vlp需要在特定的条件下进行，因此，本研究存在一定的难度。
技术实现要素：
针对目前存在的各种问题，本发明提供了一种猪圆环病毒3型病毒样颗粒的制备方法，利用本发明的方法，可成功的大量制备猪圆环病毒3型病毒样颗粒，适合工业化生产。
本发明的另一个目的在于提供了一种猪圆环病毒3型病毒样颗粒的制备方法的应用。为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
猪圆环病毒3型病毒样颗粒的制备方法，包括下述步骤：
1)以f：5'-tatggatccaccgcgggtacctactacacca-3'和r：5'-gcggcaagcttttacagaacgcttttgtaacga-3'为上下游引物，以合成的pcv3-cap181为模板进行扩增；扩增产物和pet28a-sumo经bamhi和hindiii双酶切后回收、连接，产物转化到e.colidh5ɑ感受态细胞，挑菌鉴定后抽提质粒，重组质粒命名为pet28a-8his×sumo-cap181。
所述的pcv3-cap181基因的核苷酸序列为seqidno.1所示。
2)将pet28a-8his×sumo-cap181质粒转入大肠杆菌表达菌株rosetta(de3)，命名为rcap181。
3)rcap181菌液接种到含卡那霉素的液体lb培养基中，37℃，200rpm摇床上培养3～4h，使od600的值达到0.6左右。然后加入终浓度为0.1mmol/l的iptg，37℃，200rpm进行诱导表达3～4小时，随后离心收集菌液；
4)破碎3)中收集的菌液的菌体，收集上清后过柱纯化，将初纯蛋白放入透析袋中透析后，切除sumo标签，即得cap蛋白；
5)cap蛋白置于缓冲液a中透析12～24h。透析完成后，即得猪圆环病毒3型病毒样颗粒；
所述的缓冲液a的配方：0.1m磷酸氢二钠、0.1m磷酸二氢钠、500mm氯化钠、10mmtris、50mm氯化钾、2mm氯化镁、5％的甘油、ph6.5。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
猪圆环病毒3(pcv3)型作为新发现的猪圆环病毒新血清型，到目前为止没有相应的血清诊断和疫苗。而病毒样颗粒相对于天然病毒，有着安全性更高，生产更便宜的优点，被广泛用于病毒性疾病的疫苗和诊断试剂的开发。本发明首次建立了pcv3病毒样颗粒的制备方法和pcv3疫苗的制备方法，使用的原核表达系统使抗原的生产变得容易，成本低廉而且产量高。
附图说明
图1为cap蛋白sds-page电泳检测结果；其中1为诱导前菌液，2为诱导后裂解上清液，3为纯化后的蛋白，4为经酶切buffer透析后的重组cap蛋白，5为sumo蛋白酶酶切后的重组cap蛋白，6为最终纯化后的重组cap蛋白，m为蛋白分子量。
图2为电镜实验的结果图。
图3为猪免疫pcv3病毒样颗粒疫苗后的抗体水平示意图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例以及附图对本发明进一步的详细描述，而本发明的实施方式不限于此。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，
实施例1：
猪圆环病毒3型病毒样颗粒的制备方法，包括下述步骤：
1)cap蛋白表达载体的构建
根据pcv3-cap181基因序列，设计合成一对引物用于特异性扩增，并在产物两端分别设计了bamhi和hindiii位点。所述的pcv3-cap181基因的核苷酸序列为seqidno.1所示。
利用pcr方法，以f：5'-tatggatccaccgcgggtacctactacacca-3'和r：5'-gcggcaagcttttacagaacgcttttgtaacga-3'为上下游引物，以合成的pcv3-cap181为模板进行扩增。扩增产物经bamhi和hindiii双酶切后回收纯化。pet28a-sumo经bamhi和hindiii双酶切后回收纯化。将处理好的pet28a-sumo和pcv3-cap181在16℃连接过夜，之后将连接产物转化到e.colidh5ɑ感受态细胞，涂布含卡那霉素的lb平板，37℃培养12-16h。挑取平板上的单菌落，然后进行菌落pcr鉴定和送测序。将测序正确的菌落加入到新鲜的含卡那霉素的lb中，培养过夜，之后抽提质粒保存待用，重组质粒命名为pet28a-8his×sumo-cap181。
2)重组cap蛋白表达菌的构建
将pet28a-8his×sumo-cap181质粒转入大肠杆菌表达菌株rosetta(de3)，命名为rcap181，即为重组表达菌株。
3)重组cap蛋白的诱导表达
将rcap181按照1:1000的比例接种于含有卡那霉素的液体lb中培养过夜。再取过夜培养的rcap181菌液以1:100接种到1l新鲜的含卡那霉素的液体lb培养基中，37℃，200rpm摇床上培养3h，使od600的值达到0.6。然后加入终浓度为0.1mmol/l的iptg，37℃，200rpm进行诱导表达3小时。随后离心收集菌液，样品处理过后进行sds-page分析(图1)。
4)重组cap蛋白的纯化与标签去除
将3)中收集的菌液，按照100ml菌液加入10mlpbs重悬菌体。重悬的菌体进行超声波破碎。功率选用200w，在冰盒上操作，超声裂解10s，停顿10s，直至菌液变得清澈。将破碎完成的菌液离心，4℃、12000rpm、15min，收集上清待用。
ni+填料装柱后，用binding缓冲液(50mmtris，0.2m氯化钠，ph7.4，20mm咪唑)平衡纯化柱子。将收集的上清缓慢的通过处理后的含ni+填料的柱子。binding缓冲液洗去杂蛋白。最后洗脱液(50mmtris，0.2m氯化钠，ph7.4，400mm咪唑)洗脱目的蛋白。即初步纯化目的蛋白，结果如图2。可见经本实验方案，能实现重组cap蛋白的大量可溶性表达。
将上述初纯蛋白放入透析袋中，然后置于酶切buffer(500mmtris-hcl,10mmdtt,ph8.0)中透析过夜以去除咪唑。然后按照sumo蛋白酶与重组cap蛋白1：100(w/w)混合，在酶切buffer的环境中，4℃酶切16h。随后，将酶切后的反应液加入ni+填料装柱，收集流出液，即为去除标签后的重组cap蛋白，结果如图1。按照上述步骤，1l菌液可获得180mg的目的蛋白。
5)pcv3病毒样颗粒的组装与电镜观察
cap蛋白置于4摄氏度缓冲液a(0.1m磷酸氢二钠、0.1m磷酸二氢钠、500mm氯化钠、10mmtris、50mm氯化钾、2mm氯化镁、5％的甘油、ph6.5)中透析16h。透析完成后，将组装好的vlp测浓度，调整浓度至200ng/ml。取20ul滴到200目铜网上，室温静置3min，用滤纸轻轻吸去多余的液体。然后用3％的磷钨酸染色3min，待完全干燥后在透射电镜下观察。电镜结果见图2。可见直径17nm左右的空心颗粒结构。
实施例2：
pcv3病毒样颗粒疫苗的制备与免疫
然后按照1:1的体积比例将vlp与法国赛比克公司提供的201佐剂混合，接着进行超声乳化。经检测粘度和稳定性合格后置于4℃保存。
将10只3周龄经抗原抗体检测双阴性的仔猪随机分为2组，每组5头。各组均采用颈部肌肉注射的方式免疫，共免疫两次。第一组：每头仔猪每次免疫2ml灭菌后的pbs。第二组：每头仔猪2ml由201佐剂乳化的vlp，终浓度为0.2mg/ml。一免后两周，每头仔猪进行第二次免疫。一免后，每隔2周对每组仔猪采血一次，析出的血清使用3型猪圆环病毒包被的elisa板检测抗体水平。检测结果见图3。结果显示：病毒样颗粒疫苗免疫仔猪后能快速产生针对3型猪圆环病毒的抗体。经一免后，特异性抗体水平能够达到0.74。二免后能够达到1.87。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>武汉科前生物股份有限公司
<120>猪圆环病毒3型病毒样颗粒的制备方法及其应用
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>546
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
accgcgggtacctactacaccaaaaaatacagcaccatgaacgttatcagcgttggtacc60
ccgcagaacaacaaaccgtggcacgcgaaccacttcattacccgtctgaacgaatgggaa120
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