本发明涉及微藻生物处理技术领域，涉及一种利用高浓度豆腐废水培养小球藻l166生产多糖和油脂的优化方法。
背景技术：
我国的豆腐产量大，由豆腐生产而排放的废水量也很大。将一吨大豆加工成豆腐产生约7-10吨废水，废水的化学需氧量(cod)为8-20g/l[1]。现如今并没有专门化的处理技术，对豆腐废水处理的研究都集中在厌氧过滤器、上流式厌氧污泥流化床等采用厌氧为主的工艺[2]。一个最佳的处理过程应该是利用生物的生产，同时去除有机物和氮磷污染物。豆腐废水中含有氮、磷、有机物等营养物质能被小球藻利用，它可以作为一种有效的有机废水来实现小球藻生物质生产。
小球藻在培养过程中积累生物质，其中多糖是一种有效的成分。多糖测定的方法主要是苯酚-硫酸法、蒽酮浓硫酸法、dds法、碘量法等[3]。本专利对微藻多糖的测定则采用苯酚-硫酸法，原理是多糖在浓硫酸作用下能够水解生成单糖,单糖迅速脱水生成糖醛衍生物后与苯酚缩合可生成一种橙黄色的化合物,该化合物颜色稳定且在波长490nm处有最大的吸收值,显色时间长可用比色法测定，其吸光度与总糖含量成线性关系。
尼罗红(nilered，nr)是一种脂溶性的荧光染料，可以准确地将细胞内脂类物质与其他贮藏物区分开，因此经常被用于检测动物以及微生物细胞内油脂情况。尼罗红荧光染色溶液是一种旨在通过与脂类物质的结合并发出荧光检测信号，快速、敏感、可靠地活体定量测定细胞内脂类成分的常用荧光染料。尼罗红是一种脂溶性染料，能够与脂类物质相结合，性能稳定，着色清晰灵敏，选择合适的激发波长可以显示强烈橘红色荧光，适用于各种细胞的脂质染色。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种利用高浓度豆腐废水培养小球藻l166生产多糖和油脂的优化方法。豆腐废水中含有氮、磷、有机物等营养物质能被微藻利用，能够作为一种有效的有机废水来实现小球藻多糖和油脂生产并同时净化废水。而我们在此基础上进一步探究小球藻l166培养的优化方法。
本发明为解决上述背景技术中的技术问题，提出的技术方案如下：利用高浓度豆腐废水培养小球藻l166生产多糖和油脂的优化方法，包括如下步骤：
1)小球藻接种：
(1)将小球藻l166接种于容器内；
(2)添加bg-11培养基；
(3)接种体积比为10％(v接种物/v培养基)；
(4)置于光培养箱中培养10天：培养条件为温度22℃，白色荧光照明6000lx并通入1.0l.min-1的过滤灭菌空气条件下培养；
2)废水预处理：
(1)将豆腐废水离心、过滤并进行121℃高压灭菌处理；
(2)将灭菌后的豆腐废水稀释10倍，向3个锥形瓶中分别加入不同稀释倍数的豆腐水样200ml；
(3)调节ph为7；
3)小球藻培养：
在3个稀释10倍的豆腐废水样品中接种小球藻l166，控制初始吸光度为0.1；
培养条件为：温度22℃，白色荧光照明6000lx；
4)测定小球藻油脂；
5)测定小球藻多糖。
所述步骤4)测定小球藻油脂的具体步骤如下：
(1)培养25天后，取2.55ml稀释10倍豆腐废水培养下的小球藻l166藻液，添加450μl二甲基亚砜(dmso)及1mg/ml溶于丙酮的尼罗红(nr)溶液24μl；
(2)在恒温水浴振荡器中200rpm充分震荡混匀；
(3)在30℃暗室静置10min；
(4)选取580nm作为激发荧光检测波长进行测定，根据荧光值查找标准曲线计算油脂生产率(mg/l/d):
所述步骤5)测定小球藻多糖的具体步骤如下：
(1)培养25天后，取稀释10倍豆腐废水培养下的小球藻l166藻液20ml，转速5000rpm离心20min，弃上清液；
(2)将底部微藻固体在105℃下24h烘干，研磨成粉末状；
(3)取样品20mg，加入蒸馏水约3.0ml，在100℃下水浴2h；
(4)取上清液2.0ml，转速5000rpm离心20min，再通过真空泵中速滤纸过滤；
(5)取1.25ml滤液加入8.75ml无水乙醇于4℃下沉淀12h；
(6)将乙醇沉淀后的样品离心在转速5000rpm离心20min，舍弃上清液并将沉淀物溶于2.0ml蒸馏水中，充分摇匀；
(7)分别取1.0、0.5、0.2、0.1ml多糖水溶液稀释至1.0ml(即原液不稀释、稀释2倍、5倍和10倍)；
(8)使用移液管分别加入5％苯酚0.5ml及浓硫酸2.5ml；
(9)充分摇匀后放入100℃水浴锅中20min后冷却至室温；
(10)在490nm下进行紫外分光光度法测定，根据吸光度查找标准曲线计算多糖生产率(单位：mg/l/d)：
所述步骤2)中豆腐废水原始水质：化学需氧量22.7±0.74g/l，总氮0.95±0.05mg/l，总磷0.12±0.007g/l。
与现有技术相比，本发明具有的优点：
本发明通过25d的豆腐废水培养之后，在稀释10倍的废水中培养小球藻l166,在光照为6000lx，温度为22℃，接种体积为10％(v接种物/v培养基)的条件，最有利于小球藻l166产生多糖和油脂；本发明将高浓度的豆腐废水作为小球藻的培养基质，不仅用小球藻培养产生多糖和油脂等高值化学品，同时也实现了废水的利用与净化，还进一步探究了小球藻l166培养的优化方法，是一种优化的高效培养模式。
附图说明
图1是尼罗红染色法测定油脂的标准曲线；
图2是苯酚-硫酸法测定多糖的标准曲线；
图3是在稀释10倍豆腐废水中培养的小球藻l166多糖和油脂生产率。
具体实施方式
下面通过具体实施例和附图对本发明作进一步的说明。本发明的实施例是为了更好地使本领域的技术人员更好地理解本发明，并不对本发明作任何的限制。
本发明利用高浓度豆腐废水培养小球藻l166生产多糖和油脂的优化方法，包括如下步骤：
1)小球藻接种：
(1)将小球藻l166接种于容器内；
(2)添加bg-11培养基；
(3)接种体积比为10％(v接种物/v培养基)；
(4)置于光培养箱中培养10天：培养条件为温度22℃，白色荧光照明6000
lx并通入1.0l.min-1的过滤灭菌空气条件下培养；
上述步骤1)中(2)所述的bg-11培养基组成为下表1所示：
表1bg-11培养基成分及含量
2)废水预处理：
(1)将豆腐废水离心、过滤并进行121℃高压灭菌处理；
(2)将灭菌后的豆腐废水稀释10倍，向3个锥形瓶中分别加入不同稀释倍数的豆腐水样200ml；
(3)调节ph为7；
其中，豆腐废水原始水质：化学需氧量(cod)22.7±0.74g/l，总氮(tn)0.95±0.05mg/l，总磷(tp)0.12±0.007g/l；
(3)小球藻培养：
在3个稀释10倍的豆腐废水样品中接种小球藻l166，控制初始吸光度为0.1；
培养条件为：温度22℃，白色荧光照明6000lx；
4)尼罗红荧光染色法标准曲线的绘制：取5.5μl三油酸甘油酯溶于1ml吡啶中，配成浓度为5.0325mg/ml的标准液；分别取0、3、6、12、30、36、45μl标准液加水稀释至2.55ml，再加入二甲基亚砜(dmso)450μl及24μl溶于丙酮的1mg/ml尼罗红(nr)溶液；在恒温水浴振荡器中200rpm充分震荡混匀，然后在30℃暗室静置10min；如图1所示，选取580nm作为激发荧光检测波长进行测定，绘制荧光值与油脂浓度的标准曲线；
5)小球藻油脂的测定：培养25天后，取2.55ml稀释10倍豆腐废水培养下的小球藻l166藻液，添加450μl二甲基亚砜(dmso)及1mg/ml溶于丙酮的尼罗红(nr)溶液24μl；在恒温水浴振荡器中200rpm充分震荡混匀，然后在30℃暗室静置10min；选取580nm作为激发荧光检测波长进行测定；
根据荧光值查找标准曲线计算油脂生产率(mg/l/d):
6)葡萄糖标准曲线的绘制：准确称取经过105℃干燥后的无水葡萄糖100mg于100ml容量瓶中，浓度为1mg/m；取其中10ml加入90ml蒸馏水稀释浓度为0.1mg/ml作为标准溶液；分别吸取0.8、0.6、0.4、0.2、0.1ml标准溶液各以蒸馏水补至1.0ml，然后加入5％苯酚0.5ml及浓硫酸2.5ml，充分摇匀；放入100℃水浴锅中20min后冷却至室温；如图2所示在490nm处用紫外分光光度法测定，绘制吸光度与多糖浓度的标准曲线；
7)小球藻多糖的测定：培养25天后，取稀释10倍豆腐废水培养下的小球藻l166藻液20ml，转速5000rpm离心20min，弃上清液；将底部微藻固体在105℃下24h烘干，研磨成粉末状；取样品20mg，加入蒸馏水约3.0ml，在100℃下水浴2h；取上清液2.0ml，转速5000rpm离心20min，再通过真空泵中速滤纸过滤；取1.25ml滤液加入8.75ml无水乙醇于4℃下沉淀12h；将乙醇沉淀后的样品离心在转速5000rpm离心20min；舍弃上清液并将沉淀物溶于2.0ml蒸馏水中，充分摇匀；分别取1.0、0.5、0.2、0.1ml多糖水溶液稀释至1.0ml(即原液不稀释、稀释2倍、5倍和10倍)；使用移液管分别加入5％苯酚0.5ml及浓硫酸2.5ml，充分摇匀后放入100℃水浴锅中20min冷却至室温；在490nm下进行紫外分光光度法测定；
根据吸光度查找标准曲线计算多糖生产率(mg/l/d)：
本发明具体实施例按照上述步骤1)至步骤7)进行，实施例1至实施例3中废水预处理步骤中的工艺参数和豆腐废水原始水质，见表2：
表2
如图3所示，为25d的豆腐废水培养之后，在稀释10倍的废水条件下的培养表现，可以发现在光照为6000lx，温度为22℃，接种体积为10％(v接种物/v培养基)的条件下，小球藻l166的多糖生产率高达2.86mg·l-1·d-1，油脂生产率高达7.22mg·l-1·d-1；本发明将不仅用小球藻培养产生多糖和油脂等高值化学品，同时也实现了废水的利用与净化，还进一步探究了小球藻l166培养的优化方法，是一种优化的高效培养模式。
应当理解的是，这里所讨论的实施方案及实例只是为了说明，对本领域技术人员来说，可以加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
相关文献：
[1]陈洪斌,高廷耀,唐贤春.豆制品废水生物处理的研究与应用进展[j].中国沼气,2000,(3):13.doi:10.3969/j.issn.1000-1166.2000.03.003.
[2]石玉新,穆迪,武洪庆,等.微藻油脂含量的几种快速测定方法[j].安徽农业科学,2012,(21):11067-11069.doi:10.3969/j.issn.0517-6611.2012.21.112.
[3]石健,张雯婕,冯汛,等.尼罗红荧光染色法的优化及应用[j].工业安全与环保,2016,(4):61-64.doi:10.3969/j.issn.1001-425x.2016.04.019。