本发明涉及共轭噻吩化合物制备及应用技术领域，具体涉及一种共轭寡聚噻吩化合物、制备方法及其抗微生物应用。
背景技术：
寡聚噻吩类化合物(英文简称“ott”)是一类具有多个噻吩并以邻位c-c单键互相连接的高共轭程度的寡聚化合物，通常具有三个或以上的噻吩共轭结构。由于其共轭程度较高，其光学性能独特，是使用最为频繁的共轭材料，特别是在有机电子设备和分子电子学中应用广泛。因此，寡聚噻吩分子结构的修饰也是最为活跃的研究领域之一，其结构修饰包括共轭体系的延长，从线性材料衍生至二维结构，以及其他类型的新颖拓扑结构的研究。一方面，噻吩结构的多样化修饰得益于噻吩化学的成熟，其核心结构的修饰方法繁多，另一方面，也是最重要的方面在于该体系是贵金属特别是钯催化偶联形成π-共轭体系的理想模块。共轭噻吩的研究驱动力在于其优异的电子学特性和杰出的物理化学特性。通常情况下，噻吩中硫的多个价态都很稳定，同时，共轭噻吩衍生物的表征手段也多种多样。噻吩中的硫原子高度激化，对共轭体系起到很好的稳定作用，同时又赋予寡聚噻吩体系电子较好的流动性。除此之外，噻吩类寡聚物也容易发生超分子自组装，且可以在固体表面进行组装。因此，便于制备固体表面的单分子层噻吩薄膜(sams)。由于寡聚噻吩独特的电子学，光学，及其氧化还原特性，寡聚噻吩类化合物引起极大的研究兴趣，是有机和分子电子学的关键材料之一，在有机发光二极管，化学传感器和生物传感器等领域中应用广泛。(handbookofoligo-andpolythiophenes；fichou,d.,ed.；wileyvch:weinheim,1999；metalcatalyzedcross-couplingreactions；diedrich,f.,stang,p.j.,eds.；wiley-vch:weinheim,1998and2006；electronicmaterials:theoligomerapproach；mullen,k.,wegner,g.,eds.；wiley-vch:weinheim,1998)。
在自组装领域，advincula等人合成了一种水溶性的寡聚噻吩，其结构特点在于分子骨架含有6个噻吩环，骨架两端对称地修饰了链长为6个碳的末端季胺盐，其对应阴离子为溴，通过吸收光谱，荧光光谱和afm研究发现，该分子在thf/水体系中能产生自组装。然而，advincula等人并未进一步研究其生物活性或对微生物毒性(locklin,；youk,etal.,langmuir,2002,18,877–883；xia；locklin,etal.,langmuir,2002,18,955–957)。
光动力抗菌领域，美国新墨西哥大学的whitten组，佛罗里达大学的schanze组，中国工程物理研究院周志军组则对寡聚苯乙炔(ope)类化合物做了较为深入的研究。通过对ope表明，紫外光照条件下均能对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌产生细胞毒性。研究也发现，未经中间苯环修饰的末端季胺盐eo-ope比ope水溶性虽然差一些，但是细胞毒性却更强。另外，所有ope对革兰氏阳性菌毒性大至少一个数量级。进一步的暗毒性机理研究发现，eo-ope分子对细胞的形态破坏很大，而m-ope在相应浓度条件下则并未造成细胞的破损，相应细胞暗毒性较低。最近，周志军等人发现，中性ope分子表现出远超正电ope的细胞毒性，甚至可见光照条件下就能产生直接的细胞毒性。机理研究认为，中性ope具有更好的细胞内化能力，因此，单线态氧等活性氧自由基可以更为直接造成细胞毒性。而细胞的内化能力与ope的电性关系密切，较多的静电荷虽然提高了其溶解性，却降低了细胞内化能力，因而，大大降低其细胞毒性能力(zhou,corbitt,etal.,j.phy.chem.lett.,2010,1,3207-3212；tang,corbitt,etal.,langmuir,2011,27(8),4956-4962；wang,tang,etal.,langmuir,2010,26(15),12509-12514；dimitri,ji,etal.,langmuir,2012,28(31),11286-11290；wang,zhou,etal.,acsappliedmaterialsandinterfaces,2017,9,7964-7971；周志军，王静等，中国专利，cn104151174b；周志军，王静等，中国专利，cn104140372b)。
在光动力抗菌领域，陕西师范大学的唐艳丽教授组完成了一项开创性研究，该团队合成三聚噻吩乙炔季胺盐，该分子由2-碘噻吩为起始原料，通过6步反应合成得到目标分子。通过吸收光谱可以看到，该分子在可见光范围有较强吸收，预示该分子可以吸收可见光并进一步被激发产生单线态氧，从而产生生物毒性。后续研究发现三聚噻吩乙炔季胺盐在光照下对金黄葡萄球菌能达到60ng/ml杀死99.9％细菌的能力，即使在暗处，该化合物也表现出优异的抗菌效果。由此可见，三聚噻吩乙炔季胺盐在光激发的条件下，能产生活性自由基，单线态氧等强氧化性活性物种，并对细菌等微生物产生毒性。值得指出的是该分子的细胞毒性却不大(唐艳丽，赵琦，中国专利，cn105001193b；zhao,li,etal.，acsappliedmaterialsandinterfaces,2016,8,1019-1024)。然而，上述三聚噻吩乙炔季胺盐合成过程需要用到钯催化剂，成本较高，且合成控制条件严格，合成难度非常大，产率相对较低，难于工业化应用。
综上所述，现有的光动力抗菌化合物存在以下不足：
(1)，现有的光动力抗菌化合物抗菌效果较差，主要表现在一方面：广谱性较差，每种化合物均只能对特定的菌种产生毒性作用，如某种化合物只对革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌起作用，无法同时起到抗革兰氏阴性菌和阳性菌的作用；另一方面，相同条件下，达到设定的光动力抗菌效果，需要含抗菌化合物的浓度较高，成本增加；
(2)，由于工业化应用需要足够简单的合成步骤、成本低及产率高的要求，而现有的光动力抗菌化合物制备过程中需要用到昂贵的催化剂，耗材多，成本高，难度大，合成步骤多，不适于工业化生产应用。
(3)，此外，由于现有的光动力抗菌化合物大多需要用到紫外光作为光源，对人体有一定伤害，对于光源的选择受到一定限制。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是：现有的光动力抗菌化合物生产成本高，且使用光源波长短，不利于工业化应用，本发明提供了解决上述问题的共轭寡聚噻吩化合物、制备方法及其抗微生物应用。
本发明通过下述技术方案实现：
共轭寡聚噻吩化合物，所述化合物的结构式如(i)所示：
其中，a为胺类基团，通式为a＝-(ch2)an(r)b(ch3)m，其中：a为2～6的整数，r＝甲基或乙基，b＝2，m＝0或1。
优选地，所述化合物的结构式中，m＝0时，化合物命名为ott-1，所述制备ott-1的反应式如(ii)所示：
其中，x的通式为x＝-(ch2)an(r)b(ch3)m，其中：a为2～6的整数，r＝甲基或乙基，b＝2，m＝0；以p-ott为原料通过与醇的取代反应制备得ott-1。
优选地，制备ott-1的方法具体为：
step1，将氢化钠和1,4-二氧六环加入反应瓶中，冰水浴中搅拌，惰性气体保护下，将相应的醇胺加入反应瓶中，室温下搅拌反应；
step2，然后依次向反应瓶中加入p-ott原料，以及铜粉、亚铜盐、氯化锂中的一种或一种以上，将反应体系在水泵下抽气置换气重复操作，惰性气体保护，避光环境中反应加热升温至80～120℃，恒温搅拌10～24h后停止加热，冷却至室温；
step3，垫硅藻土过滤，用二氯甲烷和甲醇混合溶液洗涤，收集所有滤液，减压旋干；残渣经硅胶柱层析纯化得到黄色固体，其中，洗脱液采用乙酸乙酯、甲醇和三乙胺的混合溶液。
优选地，所述p-ott的制备反应式如(iii)所示：
以三噻吩a为原料通过取代反应制备获得p-ott地的取代反应。
优选地，所述制备p-ott的方法具体为：
step1，将三噻吩a溶解在n,n-二甲基甲酰胺中，惰性气体保护下，室温条件下搅拌设定时间后，冰水浴下分批次加入n-碘代琥珀酰亚胺；
step2，室温条件下，搅拌反应设定时间；
step3，将反应液边搅拌边滴加到冰水中，析出大量固体，过滤，滤饼依次用水、二氯甲烷洗涤，收集滤饼，减压旋干得到p-ott成品。
优选地，所述中醇胺的化学结构如(iv)所示：
其中，n＝1～5整数。
优选地，所述亚铜盐为氯化亚通、溴化亚酮、碘化亚铜其中任意一种或一种以上的任意比例的混合物。
优选地，所述化合物的结构式中，m＝1时，化合物命名为ott-2，所述制备ott-2的反应式如(v)所示：
其中，y的通式为y＝-(ch2)an(r)b(ch3)m，其中：a为2～6的整数，r＝甲基或乙基，b＝2，m＝1；以ott-1为原料通过甲基化反应制备获得ott-2。
优选地，制备所述ott-2的方法具体为：
称取化合物ott-1加入到茄形瓶中，再加入有机溶剂，再加入碘甲烷，室温下搅拌反应，减压下旋干溶剂，得到淡黄色固体ott-2。所述有机溶剂为二氯甲烷/甲醇，四氢呋喃/甲醇或二氯甲烷/四氢呋喃/甲醇。
上述共轭寡聚噻吩化合物在可见或紫外光诱导抗微生物过程中作为光敏剂的应用。
所述微生物为大肠杆菌或金黄葡萄球菌。所述光诱导过程中采用光源波长为300nm～800nm，光强为3mw/cm2～200mw/cm2。
本发明具有如下的优点和有益效果：
本发明合成的对称共轭寡聚噻吩化合物制备容易，成本低廉，制备周期短，其光动力抗微生物所使用光源广谱，包括紫外光和可见光，光强覆盖范围广，实际使用更为方便，具有优异的抗菌效果。具体地：
(1)本发明提供的ott-1，ott-2的合成简单，相比目前光动力抗菌的苯乙炔和噻吩乙炔的合成所需要的6步以上，本合成只需要2～3步，且总产率要远高于相应的苯乙炔和噻吩乙炔的合成；
(2)本发明提供的ott光动力抗菌效果突出，在可见光照条件下均表现出不同程度的抗菌活性，在同样条件下，ott-1的细菌毒性要远大于ott-2。而在暗处，两种ott的细菌毒性远小于光照条件。
(3)本发明中末端支链含硫化合物的细菌毒性要好于含氧化合物。由此可见，本发明所称的新型抗菌材料ott比类似化合物的合成更简单，产率更高，抗菌效果相当或更突出。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：
图1为本发明实施例1提供的制备对称共轭寡聚噻吩化合物的反应式。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例1
化合物p-ott的合成：将三噻吩a(1mmol，248mg)溶解在干燥的n,n-二甲基甲酰胺(5ml)中，氮气保护下，室温条件下搅拌10min后，分三等分每隔5分钟加入一等分的n-碘代琥珀酰亚胺(2mmol，447mg)，搅拌反应1h后，将反应液边搅拌边滴加到冰水中，析出大量固体，过滤，滤饼用水洗两次，用二氯甲烷洗涤一次，收集滤饼，减压旋干得到淡黄色固体0.47gp-ott，产率：91％。反应如式(iii)所示：
实施例2
化合物ott-1(oc2)的合成：将nah(7.2mmol，288mg)和1,4-二氧六环(重蒸，20ml)加入干燥后的反应瓶中，冰水浴中搅拌10min，氮气保护下，将2-(二甲氨基)-1-乙醇(6.4mmol，760μl)加入反应瓶中，室温下搅拌40min后，依次向反应瓶中加入铜粉(0.8mmol，51mg)，碘化亚铜(3.2mmol，609mg)，氯化锂(6.4mmol，271mg)，p-ott(1.6mmol，800mg)。将反应体系在水泵下抽气置换气体重复操作四次，氮气保护，避光环境中反应加热升温至105℃，恒温搅拌22h，停止加热，冷却至室温，垫硅藻土过滤，用二氯甲烷/甲醇(9:1)溶液洗涤四次，每次20ml，合并收集所有滤液，减压旋干，残渣经硅胶柱层析纯化(乙酸乙酯/甲醇/三乙胺＝93：5：2(v:v:v))得到黄色固体220mgott-1(oc2)，产率：35％。反应如式(vi)所示：
实施例3
化合物ott-1(oc4)的合成：将nah(7.2mmol，288mg)和n,n-二甲基甲酰胺(重蒸，20ml)加入干燥后的反应瓶中，冰水浴中搅拌10min，氮气保护下，将4-(二甲氨基)-1-丁醇(6.4mmol，754mg)加入反应瓶中，室温下搅拌40min后，依次向反应瓶中加入铜粉(0.8mmol，51mg)，碘化亚铜(3.2mmol，609mg)，氯化锂(6.4mmol，271mg)，p-ott(1.6mmol，800mg)。将反应体系在水泵下抽气置换气重复操作四次，氮气保护，避光环境中反应加热升温至105℃，恒温搅拌36h，停止加热，冷却至室温，垫硅藻土过滤，用二氯甲烷/甲醇(9:1)溶液洗涤四次，每次20ml，合并收集所有滤液，减压旋干，残渣经硅胶柱层析纯化(乙酸乙酯/甲醇/三乙胺＝93：5：2(v:v:v))得到黄色固体189mgott-1(oc4)，产率：25％。反应如式(vii)所示：
实施例4
化合物ott-2(oc2)的合成：称取化合物ott-1(oc2)(1mmol，423mg)溶解于二氯甲烷和甲醇(各5ml)中，在加入碘甲烷(426mg，3mmol)，室温反应6h后，产生大量沉淀，过滤，用二氯甲烷淋洗，得到淡黄色固体699mg。产率：99％。反应如式(viii)所示：
实施例5
化合物ott-2(oc4)的合成：称取化合物ott-1(oc4)(1mmol，479mg)溶解于四氢呋喃和甲醇(各5ml)中，在加入碘甲烷(426mg，3mmol)，室温反应6h后，产生大量沉淀，过滤，用二氯甲烷淋洗，得到淡黄色固体755mg。产率：99％。反应如式(ix)所示：
以下依次测试化合物ott-1，ott-2对细菌在光照和非光照条件下的毒性，考察化合物ott-1，ott-2的浓度、光照时间等因素对上述各种微生物毒性的影响。
实施例6
ott-1(oc2)对大肠杆菌毒性：大肠杆菌(atcc25922)在通用培养液里37℃下培养18h，离心机离心菌液，并倒掉上清液，加入适量的0.9％消毒过的食盐水后，在振荡器中混合均匀，再次离心，倒掉上清液，同样的水洗过程进行三遍后，将细菌均匀悬浮在1ml的0.9％消毒过的食盐水中，并将其od600调至1.0备用。
将1mg化合物ott-1(oc2)溶解在1mldmso(二甲基亚砜)中，取100μl稀释用0.9％食盐水稀释至1ml备用。准备8个1.5ml容量的灭菌后的离心管，编号为1，2，3，4，5，6，7，8。
(1)分别在上述离心管1，2中加入400μl0.9％食盐水，ott-1(oc2)终浓度为0；
(2)3，4中加入395μl0.9％食盐水及5μl稀释ott-1(oc2)溶液，ott-1(oc2)终浓度为1μg/ml；
(3)5，6中加入385μl0.9％食盐水及15μl稀释ott-1(oc2)溶液，ott-1(oc2)终浓度为3μg/ml；
(4)7，8中加入355μl0.9％食盐水及45μl稀释ott-1(oc2)溶液，ott-1(oc2)终浓度为9μg/ml。
均震荡1min，得到均匀溶解的ott-1(oc2)溶液。再分别向上述1～8号离心管加入100μlod600为1.0的菌液，并在振荡器上震荡1min。取离心管1，3，5，7保存至暗室中并同时计时；取离心管2，4，6，8置于可见光(90mw/cm2)下，并同时计时。30min或1h后，取出1～8号样品，用0.9％食盐水稀释18万倍后，取100μl滴于固体培养基上，并用涂布器涂抹均匀后置于37℃的保温箱中培养10～15h，计算细菌斑数，通过与1，2号管的数量对比计算细菌的存活率。
测试结果：
(1)非光照条件：化合物ott-1(oc2)在非光照条件下，通过与非光照条件的参照对比发现，在浓度1μg/ml，3μg/ml，9μg/ml，无论30min还是1h的保存，均没有观察到明显的细胞毒性，细菌存活率和相应参照保持一致；
(2)可见光光照条件：ott-1(oc2)展现出与非光照条件截然不同的细菌毒性。光照30min条件下，1μg/ml体系中细菌存活率为45％，而3μg/ml和9μg/ml体系中细菌存活率为0％；当光照时间延长到1h时，1μg/ml及其以上浓度的ott-1(oc2)观察到细菌存活率为0％。
实施例7
ott-1(oc2)对金黄葡萄球菌毒性：金黄葡萄球菌(atcc25923)在通用培养液里37℃下培养18h，离心机离心菌液，并倒掉上清液，加入适量的0.9％灭菌过的食盐水后，在振荡器中混合均匀，再次离心，倒掉上清液，同样的水洗过程进行三遍后，将细菌均匀悬浮在1ml的0.9％灭菌过的食盐水中，并将其od600调至1.0备用。
将1mg化合物ott-1(oc2)溶解在1mldmso中，取10μl用0.9％食盐水稀释至1ml备用。准备8个1.5ml容量的灭菌后的离心管，编号为1，2，3，4，5，6，7，8。
(1)分别在上述离心管1，2中加入400μl0.9％食盐水，ott-1(oc2)终浓度为0；
(2)3，4中加入395μl0.9％食盐水及5μl稀释ott-1(oc2)溶液，ott-1(oc2)终浓度为0.1μg/ml；
(3)5，6中加入385μl0.9％食盐水及15μl稀释ott-1(oc2)溶液，ott-1(oc2)终浓度为0.3μg/ml；
(4)7，8中加入355μl0.9％食盐水及45μl稀释ott-1(oc2)溶液(ott-1(oc2)终浓度为0.9μg/ml。
均震荡1min，得到均匀溶解的ott-1(oc2)溶液。再分别向上述1～8号离心管中加入100μlod600为1.0的菌液，并在振荡器上震荡1min。取离心管1，3，5，7保存至暗室中并同时计时；取离心管2，4，6，8置于可见光下进行辐照，并同时计时。30min或1h后，取出1～8号样品，用0.9％食盐水稀释18万倍后，取100μl滴于固体培养基上，并用涂布器涂抹均匀后置于37℃的保温箱中培养10～15h，计算细菌斑数，通过与1，2号管的数量对比计算细菌的存活率。
测试结果：
(1)非光照条件：化合物ott-1(oc2)在非光照条件下，通过与非光照条件的参照对比发现，在浓度0.1μg/ml，0.3μg/ml，0.9μg/ml，无论30min还是1h的保存，均没有观察到细菌毒性，细菌存活率和相应参照保持一致；
(2)在可见光光照条件下，ott-1(oc2)展现出与非光照条件截然不同的细菌毒性。光照30min条件下，0.1μg/mlott-1(oc2)没有观察到99.9％细菌死亡，而0.3μg/ml和0.9μg/ml体系则观察到细菌存活率为0％。
实施例8
ott-2(oc2)对大肠杆菌毒性测试：大肠杆菌培养、处理过程以及样品的处理过程均与同实施例6相同。
测试结果：
(1)非光照条件：化合物ott-2(oc2)在非光照条件下，通过与非光照条件的参照对比发现，在浓度1μg/ml，3μg/ml，9μg/ml，30min和1h均无细菌毒性，细菌存活率和相应参照保持一致；
(2)在可见光光照条件下，ott-2(oc2)展现出与非光照条件截然不同的细菌毒性。光照30min条件下，1μg/mlott-2(oc2)观察到5％细菌死亡，而3μg/ml和9μg/ml细菌死亡率分别达到16％和56％。
实施例9
ott-2(oc2)对金黄葡萄球菌毒性测试：金黄葡萄球菌培养、处理过程以及样品的处理过程均与同实施例7相同。
测试结果：
(1)非光照条件：化合物ott-2(oc2)在非光照条件下，通过与非光照条件的参照对比发现，在浓度0.1μg/ml，0.3μg/ml，0.9μg/ml，30min和1h均无细菌毒性，细菌存活率和相应参照保持一致；
(2)在可见光光照条件下，ott-2(oc2)展现出与非光照条件截然不同的细菌毒性。光照30min条件下，0.1μg/mlott-2(oc2)观察到5％细菌死亡，而0.3μg/ml的细菌死亡率为12％，0.9μg/ml体系则观察到细菌死亡率为15％；当时间延长到1h时，相应浓度的细菌死亡率分别为8％，21％和38％。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。