本发明涉及基因工程
技术领域：
，具体地，涉及一种基于人铁蛋白的纳米酶及其制备方法。
背景技术：
：重组人铁蛋白重链（recombinantheavychainofhumanferritin,rhf,以下简称人铁蛋白）是目前研究得较为清晰的具有纳米结构特性的蛋白质，具有在体外自组装形成24聚体笼形纳米颗粒的特性。人铁蛋白较其他生物大分子型的纳米元件相对简单，修饰和组装技术也相对成熟，可以通过基因工程手段连接功能性蛋白，特别是与人铁蛋白n端融合，并不影响纳米颗粒的完整性，且组装后功能分子被展示在笼形结构的表面，这些特点都赋予了人铁蛋白在纳米材料领域独特的优势，使得人铁蛋白成为一种构建自组装纳米颗粒的完美模块。对硫磷类有机磷农药作为一种广泛用于农业生产行列的产品，已被列为最毒物质之一。它的神经毒性是由于对乙酰胆碱酯酶的抑制作用，该酶在神经系统中可以正常降解神经递质乙酰胆碱，从而使神经系统功能紊乱。在农业生产中，因病虫害所造成的有机磷农药的滥用使得农药在土壤、水资源、农产品，甚至食物链的残留，破坏农业生态，严重威胁着人类健康，因此迫切需要发展一种高效无污染的对硫磷类农药降解方法和高灵敏度检测手段。甲基对硫磷水解酶（methylparathionhydrolase,mph,ec3.1.8.1）是在2001年由中国科学院武汉病毒研究所从筛选出来的一株甲基对硫磷降解菌（pseudomonassp.strainwbc-3）中分离纯化出来的对硫磷类重要代谢酶。研究发现，mph可以降解甲基对硫磷、乙基对硫磷、毒死俾等。虽然已有研究人员成功构建了mph的大肠杆菌表达系统，并且成功实现了mph在异源宿主中的大量表达（楚晓娜，2003；刘璐璐等，2004），但是这对于迫切希望提高降解速率和检测灵敏度方法学的研究而言还是远远不够的。碱性磷酸酶（alkalinephosphatase,ap,ec3.1.3.1）属于非特异性磷酸单酯酶，具有催化磷酸单酯水解生成无机磷酸和相应的醇、酚或糖类化合物的功能。碱性磷酸酶来源广泛，且不同来源的分子大小、编码序列差异很大，在结构、功能与催化机理上也略有不同。其中，对大肠杆菌碱性磷酸酶（escherichiacolialkalinephosphatase，eap）的研究最为透彻，eap是一个同源二聚体金属酶，因其催化机理清楚且作用底物广泛，目前被广泛应用于医学、免疫学等领域。人铁蛋白纳米颗粒广泛用于生物传感器、疫苗的开发、药物的靶向释药系统的研究和应用，但是基于人铁蛋白纳米结构而构建的甲基对硫磷水解酶及大肠杆菌碱性磷酸酶的重组蛋白（纳米酶），以及针对这两种纳米酶催化体系的研究目前尚无报道。技术实现要素：本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种基于人铁蛋白的纳米酶及其制备方法。本发明将甲基对硫磷水解酶或大肠杆菌碱性磷酸酶置于人铁蛋白的n端进行融合表达，这两种酶可分别在大肠杆菌中自组装形成纳米颗粒，酶活性及稳定性皆有提高，本发明所述制备方法可解决酶活性不高、最适ph及最适温度过窄等问题，扩大酶的应用范围。本发明的另一目的在于提供由上述制备方法制备得到的纳米酶。本发明的另一目的在于提供一种编码上述纳米酶的融合基因。本发明的另一目的在于提供一种含有上述核酸的表达载体。本发明的另一目的在于提供一种含有上述表达载体的宿主菌。本发明的另一目的在于提供一种用于降解有机磷农药或催化磷酸单酯水解的制剂。为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：一种基于人铁蛋白的纳米酶的制备方法，以人铁蛋白为融合伴侣，将目标酶置于其n端进行融合表达，在目标酶与人铁蛋白之间插入连接肽。所述连接肽为柔性连接肽，其序列为ggggs。本发明所述制备方法能够显著提高目标酶对底物的催化活性，且使酶对温度及ph有更强的耐受性，具有高效、简便、适用面广等特点，适用于基因工程、生物化学、分子生物学等研究。优选地，所述制备方法包括如下步骤：克隆人铁蛋白和目标酶基因，拼接获得人铁蛋白-连接肽-目标酶融合蛋白基因，构建重组质粒，转化大肠杆菌宿主菌，筛选获得工程菌株，培养工程菌，诱导人铁蛋白-连接肽-目标酶融合蛋白的表达，经镍离子亲和层析纯化，分离获得人铁蛋白-连接肽-目标酶融合蛋白。优选地，所述目标酶为水解酶。更优选地，所述水解酶为甲基对硫磷水解酶或大肠杆菌碱性磷酸酶。下面以甲基对硫磷水解酶和大肠杆菌碱性磷酸酶为例说明本发明的特点：以人铁蛋白（rhf）为融合伴侣，将甲基对硫磷水解酶（mph）或大肠杆菌碱性磷酸酶（eap）融合于rhf的n端，构建融合表达载体pet28a-mph-rhf或pet28a-eap-rhf。这两种融合蛋白mph-rhf和eap-rhf都可高效表达于大肠杆菌内，通过镍离子亲和层析可获得高纯度的mph-rhf和eap-rhf。通过透射电镜对融合蛋白的聚集形式进行检测，发现融合蛋白mph-rhf和eap-rhf在体外成功地自组装形成纳米结构，表明在rhf的n端融合mph或eap不影响rhf自组装形成笼形纳米结构。通过比较纳米酶mph-rhf及游离酶mph对底物（对甲基对硫磷）的水解活性，发现纳米酶mph-rhf较游离酶mph有更高的催化活性；相比于游离酶mph，纳米酶mph-rhf的最适温度由35℃变为40℃，最适ph由9.5变为10.5。通过比较纳米酶eap-rhf及游离酶eap对底物（对硝基苯磷酸,p-nitrophenylphosphate,pnpp）的催化活性，发现纳米酶eap-rhf有更高的催化活性；相比于游离酶eap，纳米酶eap-rhf对温度和ph都有更高的耐受性。因此，本发明请求保护人铁蛋白在提高甲基对硫磷水解酶或大肠杆菌碱性磷酸酶的催化活性和/或稳定性中的应用；具体地，所述稳定性为酶对温度和ph的耐受性。本发明还请求保护由上述制备方法制备得到的纳米酶，所述纳米酶为融合蛋白，从n端到c端依次为目标酶、连接肽和人铁蛋白。优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列为seqidno:1～seqidno:2中的任一条。所述融合蛋白mph-rhf的氨基酸序列如seqidno:1所示。所述融合蛋白eap-rhf的氨基酸序列如seqidno:2所示。本发明还请求保护一种编码上述纳米酶的融合基因，所述融合基因的核苷酸序列为seqidno:3～seqidno:4中的任一条。所述融合基因mph-rhf的核苷酸序列如seqidno:3所示。所述融合基因eap-rhf的核苷酸序列如seqidno:4所示。本发明还请求保护一种含有上述核酸的表达载体，所述表达载体为pet28a-mph-rhf或pet28a-eap-rhf。本发明还请求保护一种含有上述表达载体的宿主菌，所述宿主菌为e.colibl21（de3）或e.colibl21（de3）plyss感受态细胞。本发明还请求保护一种用于降解有机磷农药或催化磷酸单酯水解的制剂，所述制剂包括上述纳米酶、融合基因、表达载体或宿主菌。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：通过本发明所提供的制备方法形成纳米酶（融合蛋白），分别提高了甲基对硫磷水解酶或大肠杆菌碱性磷酸酶对底物的催化活性，增强了酶对温度、ph的耐受性。该制备方法不仅限于人铁蛋白与甲基对硫磷水解酶和大肠杆菌碱性磷酸酶的融合表达，还适用于人铁蛋白与多种酶的融合表达，以改良目标酶的特性，在科学研究和应用基础研究中具有较高的研究价值和科学意义。附图说明图1为本发明重组酶构建策略的示意图；其中目标酶基因可为甲基对硫磷水解酶基因（mph）或大肠杆菌碱性磷酸酶基因（eap）；linker为ggggs的核苷酸序列；rhf为人铁蛋白重链基因。图2为实施例中纯化的重组酶的sds-page电泳图；a为纯化的mph-rhf及mph的电泳图，其中m为蛋白marker，泳道1为纯化的mph，泳道2为纯化的mph-rhf；b为纯化的eap-rhf及eap的电泳图，其中m为蛋白marker，泳道1为纯化的eap，泳道2为纯化的eap-rhf。图3为实施例中重组酶的透射电镜（tem）图像；a为重组酶mph-rhf的聚集形式；b为重组酶eap-rhf的聚集形式。图4为实施例中温度对酶活性的影响结果；a为温度对mph-rhf及mph的影响；b为温度对eap-rhf及eap的影响。图5为实施例中ph对酶活性的影响结果；a为ph对mph-rhf及mph的影响；b为ph对eap-rhf及eap的影响。具体实施方式下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。实施例1甲基对硫磷水解酶与人铁蛋白融合表达载体的构建融合蛋白的设计策略：以人铁蛋白（rhf）为融合伴侣，将甲基对硫磷水解酶（mph）置于rhf的n端进行表达，mph与rhf之间通过一个连接肽（linker）进行连接。融合蛋白mph-rhf的基因序列示意图见图1。表达载体的构建：根据中国科学院武汉病毒研究所提供的载体pet20-mph及pet28a-rhf，设计特异的扩增引物，在mph基因两端分别引入ndei和bamhi酶切位点；在rhf基因5’端引入linker（ggggs）的核苷酸序列，同时两端引入bamhi和hindiii酶切位点。分别用ndei和bamhi双酶切回收mph和pet28a载体，酶切产物进行连接，转入e.colidh5α，筛选阳性克隆并测序，测序结果显示成功构建载体pet28a-mph，将正确的阳性克隆扩大培养，抽提质粒保存备用。然后用bamhi和hindiii双酶切pet28a-mph及扩增的rhf片段，酶切产物进行连接，转入e.colidh5α，筛选阳性克隆并测序，测序结果显示成功构建表达载体pet28a-mph-rhf，将正确的阳性克隆扩大培养，抽提质粒保存备用。实施例2融合蛋白mph-rhf的诱导表达及纯化将实施例1中构建成功的表达载体pet28a-mph-rhf以及pet28a-mph，用热激法转入e.colibl21（de3）感受态细胞中，挑取单菌落在含有50μg/ml卡那霉素的lb培养基中，于37℃、200rpm条件下振摇培养5h后，以1:100的比例转进500ml含50μg/ml卡那霉素的lb培养基中，于37℃、200rpm条件下，摇至od600=0.6左右，加入诱导剂iptg，使其终浓度为0.5mm，30℃，150rpm诱导8h。于4℃、5000rpm条件下离心10min，弃上清收集菌体。每克菌体用20ml结合缓冲液（20mmtris，0.5m氯化钠和5mm咪唑，ph7.9）重悬，进行超声破碎，破碎后于4℃、6000rpm条件下离心15min，收集上清，将上清过0.22μm滤膜抽滤，然后进行镍离子亲和层析（ni-nta）纯化，梯度洗脱，分管收集洗脱液并进行sds-page电泳，电泳结果见图2a。实施例3重组酶mph-rhf及游离酶mph动力学参数的测定通过使用岛津uv-2550分光光度计，检测产物对硝基苯酚在405nm处的吸光值来测定重组酶mph-rhf以及游离酶mph对模式底物甲基对硫磷的相关稳态动力学参数。标准反应体系总体积为800μl，其中含50nmmph-rhf或mph和不同浓度的甲基对硫磷（溶于甲醇中，当甲醇浓度小于4%时，酶的活性不受影响），缓冲液为ph8.0的20mm的tris-hcl。底物加入前对吸收值进行调零，加入甲基对硫磷混匀后起始反应，在37℃记录波长405nm处4min内吸收值的变化。利用graphpadprism对三次实验数据进行拟合，得到酶促动力学参数，如表1所示（结果是3次实验的平均值）。从表1可以看出，重组酶mph-rhf与游离酶mph相比，酶的催化效率（kcat/km）提高超过1倍。表1重组酶mph-rhf和游离酶mph的动力学参数比较参数mphmph-rhfkm（μm）36.98±7.6565.80±29.59kcat（min-1）177.8±12.75687.1±141.2kcat/km(min-1μm-1)4.8110.45实施例4透射电镜（tem）检测重组酶mph-rhf的聚集形式将20μlmph-rhf溶液，20μl负染液，滴加到封口膜光滑面，成隆起的小液滴；轻轻夹起铜网边缘，将碳膜面覆盖到样品溶液上，使得样品吸附到碳膜表面，时间3～5min；小心夹起铜网，用滤纸从铜网边缘吸走液体后，待肉眼观察不到铜网表面有水珠，再将铜网碳膜面覆盖到负染液表面，时间5～7min。同样用滤纸从边缘吸走液体后，放置到铺有一层滤纸的平皿中，做好标记；静置2～4h后，方可进行tem表征。电镜观察由华南农业大学测试中心完成（荷兰fei，分析型透射电子显微镜）。通过电镜技术表征mph-rhf自组装形成笼形纳米颗粒结构，如图3a所示：有直径在12nm[12.86±2.17nm(n=300)]左右的颗粒状规则结构，说明在rhf的n端融合mph不影响人铁蛋白自组装形成笼形纳米结构，分离纯化的mph-rhf在体外成功地自组装形成笼形纳米颗粒结构。实施例5温度对纳米酶mph-rhf活性的影响分别将含50nm待测酶的反应体系置于各温度（4℃、15℃、30℃、37℃、40℃、50℃、60℃和65℃）下，保温30min后，迅速进行活性检测，反应10min后加50μl1mnaoh终止反应。以各温度为横轴，各温度下产物在405nm处的吸收值为纵轴作图。从图4a中可以看出纳米酶mph-rhf对于高温有更好的耐受性，并且在40℃表现出最佳活性，这与游离酶mph最适温度在35℃左右有所差异；并且纳米酶mph-rhf在高达60℃下都有较好的活性，而游离酶mph在超过40℃以后酶活力急剧下降，这表明与人铁蛋白的融合作用增强了mph对于温度的耐受性。实施例6ph对纳米酶mph-rhf活性的影响选用ph值7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0，10.5，11.0，11.5，12.0的20mmtris-hcl缓冲液作为酶反应缓冲液，在酶浓度为50nm，底物浓度为0.0625mm的反应体系下测定酶活力，反应10min后加50μl1mnaoh终止反应。以ph值为横轴，各ph值下产物在405nm处的吸光值为纵轴作图，如图5a所示，可以看出纳米酶mph-rhf在ph10.5具有更佳的酶活性，而游离酶mph则表现在ph9.5左右；并且从图中可以看出纳米酶对于ph也有很好的适应性，这表明与人铁蛋白的融合作用增强了mph对于ph的耐受性。实施例7大肠杆菌碱性磷酸酶与人铁蛋白融合表达载体的构建融合蛋白的设计策略：以人铁蛋白（rhf）为融合伴侣，将大肠杆菌碱性磷酸酶（eap）置于rhf的n端进行表达，eap与rhf之间通过一个连接肽（linker）进行连接。融合蛋白eap-rhf的基因序列示意图见图1。表达载体的构建：从实验室已有的atcc25922菌株中，提取基因组。根据ncbi中eap的序列设计引物，分别扩增出含终止密码子和不含终止密码子的eap的核苷酸序列（两端含有ndei和bamhi酶切位点）；然后用ndei和bamhi酶对扩增出的含终止密码子和不含终止密码子的eap的核苷酸序列和pet28a载体进行双酶切，酶切产物进行连接，转化到e.colidh5α感受态细胞，筛选阳性克隆并测序，测序结果显示成功构建表达载体pet28a-eap（含终止密码子与不含终止密码子）。根据测序结果，将正确的阳性克隆扩大培养，抽提质粒保存备用。从实验室已有的pet28a-rhf载体上，设计引物（5’端引入ggggs的核苷酸序列）扩增含有linker的rhf的核苷酸序列（含bamhi和hindiii酶切位点）；用bamhi和hindiii酶对扩增出的含有linker的rhf的核苷酸序列和不含终止密码子的pet28a-eap载体进行双酶切，酶切产物进行连接，转化到e.colidh5α感受态细胞，筛选阳性克隆并测序，测序结果显示成功构建表达载体pet28a-eap-rhf。根据测序结果，将正确的阳性克隆扩大培养，抽提质粒保存备用。实施例8融合蛋白eap-rhf的诱导表达及纯化将保存备用的表达载体pet28a-eap以及pet28a-eap-rhf，利用热激法转化进e.colibl21（de3）plyss感受态细胞，挑单克隆于5ml含卡那霉素50mg/ml的lb培养基中于37℃、200rpm条件下振摇5h后，按1:100转进500ml含卡那霉素50μg/ml的新鲜lb培养基中，于37℃、200rpm条件下摇菌至od600=0.6，加入诱导剂iptg，使其终浓度为0.5mm，于25℃、150rpm条件下诱导24h后收菌。于4℃、5000rpm离心10min，弃上清，菌体用预冷的ddh2o重悬。于4℃、5000rpm离心10min，弃上清留菌体。每克菌体用20ml缓冲液（20mmtris-hcl，1mmedta，ph8.0）重悬，加入终浓度为1mm的pmsf，样品置于冰上进行超声破碎，破碎后样品于4℃、5000rpm离心30min，上清过0.22μm滤膜，进行镍离子亲和层析（ni-nta）纯化，梯度洗脱，分管收集洗脱液，进行sds-page电泳，电泳结果见图2b。实施例9重组酶eap-rhf及游离酶eap动力学参数的测定以对硝基苯磷酸（pnpp）为催化底物，eap与pnpp发生反应后生成产物对硝基苯酚，对硝基苯酚在405nm处有特异性吸收值。通过分析游离酶eap和纳米酶eap-rhf对底物pnpp的催化能力，来测定相关动力学参数。在96孔板上进行酶活检测，反应总体积为250μl，其中酶浓度为5nm。反应前先将含有不同浓度pnpp的dea缓冲液（ph9.8，1mmmg2+）和酶溶液放置37℃温育5min，混合后立即放入仪器，以不加酶液的样品孔作为调零样，37℃条件下监测5min内405nm处吸收值的变化。利用graphpadprism对三次实验数据进行拟合，绘制酶促动力学参数，如表2所示（结果是3次实验的平均值）。从表2可以看出，纳米酶eap-rhf与游离酶eap相比，酶的催化效率（kcat/km）提高6.7倍。表2重组酶eap-rhf和游离酶eap的动力学参数参数eapeap-rhfkm（μm）35.10±18.3187.68±15.81kcat（min-1）186.2±14.633592±140.3kcat/km（min-1μm-1）5.3140.97实施例10透射电镜（tem）检测重组酶eap-rhf的聚集形式将纯化得到的重组酶eap-rhf进行tem电镜分析：取10μl蛋白样品液于光滑封口膜上，用镊子夹铜网膜边缘，将其覆盖着蛋白液上，浸润10min；取10μl2%pta溶液（ph8.0）于另一光滑的封口膜上，将浸润蛋白液的铜网膜竖立，用滤纸将膜上多余蛋白液吸干，然后将铜网膜轻轻放在2%pta溶液的液珠上，浸润10min；用滤纸将膜上多余液体吸干，室温放置，待铜网膜晾干后上机观察形态（电镜观察由中国科学院武汉病毒研究所完成），如图3b所示，有直径在12nm[12.54±1.35nm(n=20)]左右的颗粒状规则结构。实施例11温度对纳米酶eap-rhf及游离酶eap活性的影响将待测酶及含有0.0125mm的底物缓冲液置于20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃及80℃下，温预5min后，取50μl酶液和200μl底物缓冲液，迅速进行活性检测，反应10min后加50μl1mnaoh终止反应。以温度为横轴，各温度下产物在405nm处的吸收值为纵轴作图。如图4b所示，与游离酶eap相似，高温条件下纳米酶eap-rhf仍有较高的活性；但纳米酶eap-rhf在各个温度条件下的活性都比游离酶eap的强，这表明与人铁蛋白的融合作用增强了eap对于温度的耐受性。实施例12ph对纳米酶eap-rhf及游离酶eap活性的影响选用ph值6.5、7.0、8.0、9.0、10.0及10.5的dea缓冲液作为酶反应缓冲液，在酶浓度为5nm，底物浓度为0.0125mm的250μl反应体系下测定酶活力，反应10min后加50μl1mnaoh终止反应。以ph值为横轴，各ph值下产物在405nm处的吸光值为纵轴作图。从图5b中可以看出纳米酶eap-rhf和游离酶eap的最适ph均在8.0左右，但在各ph条件下纳米酶eap-rhf的活性都比游离酶eap的活性高，这表明与人铁蛋白的融合作用增强了eap对ph的耐受性。最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。序列表<110>华南农业大学<120>一种基于人铁蛋白的纳米酶及其制备方法<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>484<212>prt<213>大肠杆菌(escherichiacoli)<400>1alaalaproglnvalargthrseralaproglytyrtyrargmetleu151015leuglyaspphegluilethralaleuseraspglythrvalalaleu202530provalasplysargleuasnglnproalaprolysthrglnserala354045leualalysserpheglnlysalaproleugluthrservalthrgly505560tyrleuvalasnthrglyserlysleuvalleuvalaspthrglyala65707580alaglyleupheglyprothrleuglyargleualaalaasnleulys859095alaalaglytyrglnprogluglnvalaspgluiletyrilethrhis100105110methisproasphisvalglyglyleumetvalglygluglnleuala115120125pheproasnalavalvalargalaaspglnlysglualaaspphetrp130135140leuserglnthrasnleuasplysalaproaspaspgluserlysgly145150155160phephelysglyalametalaserleuasnprotyrvallysalagly165170175lysphelyspropheserglyasnthraspleuvalproglyilelys180185190alaleualaserhisglyhisthrproglyhisthrthrtyrvalval195200205gluserglnglyglnlysleualaleuleuglyaspleuileleuval210215220alaalavalglnpheaspaspproservalthrthrglnleuaspser225230235240aspserlysservalalavalgluarglyslysalaphealaaspala245250255alalysglyglytyrleuilealaalaserhisleuserpheprogly260265270ileglyhisileargalagluglylysglytyrargphevalproval275280285asntyrservalvalasnprolysglyglyglyglysermetthrthr290295300alaserthrserglnvalargglnasntyrhisglnaspsergluala305310315320alaileasnargglnileasnleugluleutyralasertyrvaltyr325330335leusermetsertyrtyrpheaspargaspaspvalalaleulysasn340345350phealalystyrpheleuhisglnserhisglugluarggluhisala355360365glulysleumetlysleuglnasnglnargglyglyargilepheleu370375380glnaspilelyslysproaspcysaspasptrpgluserglyleuasn385390395400alametglucysalaleuhisleuglulysasnvalasnglnserleu405410415leugluleuhislysleualathrasplysasnaspprohisleucys420425430asppheilegluthrhistyrleuasngluglnvallysalailelys435440445gluleuglyasphisvalthrasnleuarglysmetglyalaproglu450455460serglyleualaglutyrleupheasplyshisthrleuglyaspser465470475480aspasngluser<210>2<211>637<212>prt<213>大肠杆菌(escherichiacoli)<400>2thrproglumetprovalleugluasnargalaalaglnglyaspile151015thralaproglyglyalaargargleuthrglyaspglnthralaala202530leuargaspserleuserasplysproalalysasnileileleuleu354045ileglyaspglymetglyaspsergluilethralaalaargasntyr505560alagluglyalaglyglyphephelysglyileaspalaleuproleu65707580thrglyglntyrthrhistyralaleuasnlyslysthrglylyspro859095asptyrvalthraspseralaalaseralathralatrpserthrgly100105110vallysthrtyrasnglyalaleuglyvalaspilehisglulysasp115120125hisprothrileleuglumetalalysalaalaglyleualathrgly130135140asnvalserthralagluleuglnaspalathrproalaalaleuval145150155160alahisvalthrserarglyscystyrglyproseralathrserglu165170175lyscysserglyasnalaleuglulysglyglylysglyserilethr180185190gluglnleuleuasnalaargalaaspvalthrleuglyglyglyala195200205lysthrphealagluthralathralaglyglutrpglnglylysthr210215220leuarggluglnalaglnalaargglytyrglnleuvalseraspala225230235240alaserleuasnservalthrglualaasnglnglnlysproleuleu245250255glyleuphealaaspglyasnmetprovalargtrpglnglyprolys260265270alathrtyrhisglyasnileasplysproalavalthrcysthrpro275280285asnproglnargasnaspservalprothrleualaglnmetthrasp290295300lysalailegluleuleuserargasnglulysglyphepheleugln305310315320valgluglyalaserileasplysglnasphisalaalaasnprocys325330335glyglnileglygluthrvalaspleuaspglualavalglnargala340345350leugluphealalyslysaspglyasnthrleuvalilevalthrala355360365asphisalahisalaserglnilevalalaproaspthrlysalapro370375380glyleuthrglnalaleuasnthrlysaspglyalavalmetvalmet385390395400sertyrglyasnserglugluaspserglngluhisthrglysergln405410415leuargilealaalatyrglyprohisalaalaasnvalvalglyleu420425430thraspglnthraspleuphetyrthrmetlysalaalaleuglyleu435440445lysglyglyglyglysermetthrthralaserthrserglnvalarg450455460glnasntyrhisglnaspserglualaalaileasnargglnileasn465470475480leugluleutyralasertyrvaltyrleusermetsertyrtyrphe485490495aspargaspaspvalalaleulysasnphealalystyrpheleuhis500505510glnserhisglugluarggluhisalaglulysleumetlysleugln515520525asnglnargglyglyargilepheleuglnaspilelyslysproasp530535540cysaspasptrpgluserglyleuasnalametglucysalaleuhis545550555560leuglulysasnvalasnglnserleuleugluleuhislysleuala565570575thrasplysasnaspprohisleucysasppheilegluthrhistyr580585590leuasngluglnvallysalailelysgluleuglyasphisvalthr595600605asnleuarglysmetglyalaprogluserglyleualaglutyrleu610615620pheasplyshisthrleuglyaspseraspasngluser625630635<210>3<211>1452<212>dna<213>大肠杆菌(escherichiacoli)<400>3gccgcaccgcaggtgcgcacctcggcccccggctactaccggatgctgctgggcgacttc60gaaatcaccgcgctgtcggacggcacggtggcgctgccggtcgacaagcggctgaaccag120ccggccccgaagacgcagagcgcgctggccaagtccttccagaaagcgccgctcgaaacc180tcggtcaccggttacctcgtcaacaccggctccaagctggtgctggtggacaccggcgcg240gccggcctgttcggccccaccctgggccggctggcggccaacctcaaggccgcaggctat300cagcccgagcaggtcgacgagatctacatcacccacatgcaccccgaccacgtgggcggc360ttgatggtgggtgagcaactggcgttcccgaacgcggtggtgcgtgcggaccagaaagaa420gccgatttctggctcagccagaccaacctcgacaaggccccggacgacgagagcaaaggc480ttcttcaaaggcgccatggcctcgctgaacccctatgtgaaggccggcaagttcaagcct540ttctcggggaacaccgacctggtgcccggcatcaaagcgctggccagccacggccacacc600ccgggccacaccacctacgtggtcgaaagccaggggcaaaagctcgccctgctcggcgac660ctgatactcgtcgccgcggtgcagttcgacgaccccagcgtcacgacccagctcgacagc720gacagcaagtccgtcgcggtggagcgcaagaaggccttcgcggatgccgccaagggcggc780tacctgatcgcggcgtcccacctgtcgttccccggcatcggccacatccgcgccgaaggc840aagggctaccgtttcgtgccggtgaactactcggtcgtcaaccccaagggtggaggtgga900tcgatgacgaccgcgtccacctcgcaggtgcgccagaactaccaccaggactcagaggcc960gccatcaaccgccagatcaacctggagctctacgcctcctacgtttacctgtccatgtct1020tactactttgaccgcgatgatgtggccttgaagaactttgccaaatactttcttcaccaa1080tctcatgaggagagggaacatgctgagaaactgatgaagctgcagaaccaacgaggtggc1140cgaatcttccttcaggatatcaagaaaccagactgtgatgactgggagagcgggctgaat1200gcgatggagtgtgcattacatttggaaaaaaatgtgaatcagtcactactggaactgcac1260aaactggccactgacaaaaatgacccccatttgtgtgacttcattgagacacattacctg1320aatgagcaggtgaaagccatcaaagaattgggtgaccacgtgaccaacttgcgcaagatg1380ggagcgcccgaatccggcttggcggaatatctctttgacaagcacaccctgggagacagt1440gataatgaaagc1452<210>4<211>1911<212>dna<213>大肠杆菌(escherichiacoli)<400>4acaccagaaatgcctgttctggaaaaccgggctgctcagggcgatattactgcacccggc60ggtgctcgccgcttaacgggtgatcagaccgccgctctgcgtgattctcttagcgataaa120cctgcaaaaaatattattttgctgattggcgatgggatgggggactcggaaattactgcc180gcacgcaattatgccgaaggtgcgggcggcttttttaaaggtatcgatgccttaccgctt240accgggcaatacactcactatgcgctgaataaaaaaaccggcaaaccggactacgtcacc300gactcggctgcatcagcaaccgcctggtcaactggtgtcaaaacctataacggcgcgctg360ggcgtcgatattcacgaaaaagatcacccaacgattctggaaatggcaaaagccgcaggt420ctggcgaccggtaacgtttctaccgcagagttgcaggatgccacgcccgctgcgctggtg480gcgcatgtgacctcgcgcaaatgctacggtccgagtgcgaccagtgaaaaatgttcgggt540aacgctctggaaaaaggcggaaaagg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