本发明涉及一种基因，特别是涉及nthak8基因，及其促进植物钾吸收的用途。
背景技术：
烟草属于茄科(solanaceae)烟属(nicotiana)，是茄科植物的第五大家族，约60余种，可制卷烟和烟丝，茎和叶的残屑可为杀虫剂。中国引入栽培的有数种，其中以普通烟草(nicotianatobacuml.)栽培最广。烟草为一年生或多年生经济作物，烟属植物体细胞共有十一种数目的染色体，分别为2n＝9ⅱ、10ⅱ、12ⅱ、16ⅱ、18ⅱ、19ⅱ、20ⅱ、21ⅱ、22ⅱ、23ⅱ、24ⅱ(goodspeedthetal.,1944)。普通烟草(nicotianatobacum；2n＝24ⅱ＝48ttss)是由绒毛状烟草(nicotianatomentosiformis；2n＝12ⅱ＝24tt)和林烟草(nicotianasylvestris；2n＝12ⅱ＝24ss)这两个祖先种通过一系列的杂交、染色体自然加倍形成的异源四倍体(goodspeedth,1944；gersteldu,1960；gersteldu,1963)。烟草在异源多倍化过程中，其基因组来源于绒毛状烟草(t基因组)的大概比例是47％，来源于林烟草(s基因组)的大概比例是53％(sierroetal.,2014)，其中绒毛状烟草和林烟草基因组的重复dna片段丢失了3.7％-8％(leitchetal.,2008；sierroetal.,2014)，t基因组丢失比例大于s基因组，具有一定的倾向性(renny-byfieldetal.,208)。
烟草是我国重要的经济作物之一，在其生长发育过程中，钾素是烟草吸收量最多的矿质元素。钾在烟株的生理过程中扮演很重要的角色，它显著影响着烟株的物质代谢和能量代谢，几乎可以参与烟株所有的生理代谢过程，包括酶的活化，膜转运，阴离子中和以及渗透调节等(clarksondtetal.,1980)。钾元素可以增强植物的光合作用，促进植物体内糖和淀粉的形成；能提高蛋白质分解酶类的活性，从而影响氮素的代谢过程；能提高细胞的渗透压，增加植物的抗旱性和耐寒性；也能促进机械组织的形成而提高植株的抗病力(陆景陵,2003)。
烟叶含钾量与烟叶品质密切相关，是衡量烟叶品质的重要指标之一。烟叶的含钾量直接影响烟叶的吃味、油分、香气量、香气质和阴燃持火力等品质指标,并与烟草制品的安全性息息有关,从而被视为烟草品质的重要指标(石屹等,1997)。sims等(1981)研究表明，烟叶含钾量的高低决定烟叶燃烧过程中所产生的气体中有害化学成分的含量,烟叶含钾量越多，热分解产物的种类和数量也会随之发生明显改变，焦油等有害物质含量会有所降低。严小龙等(1997)也指出，随着烟叶含钾量的增加,卷烟的尼古丁、总生物碱、抽吸次数、静态燃烧、微粒物质等含量降低。但是，与国际优质烟叶相比，我国烟叶钾含量相对较低，差距明显。
通过增加钾肥施用量、改善施肥方法，可以对提高烟叶含钾量起到一定作用，但是烟草对其吸收利用有限，一方面烟叶钾含量并没有显著提高，另一方面增加了钾肥资源的消耗量，同时钾肥的大量流失还对生态环境造成破坏。通过基因改良来提高烟草对钾元素的吸收利用效率，可以从根本上解决高效、合理地利用钾元素，提高烟叶中的钾含量。
kup/hak/kt家族是生物界最早发现、家族基因数目最多、功能最丰富多样的钾转运体家族，在多个物种中都有一定的分布。该家族基因的表达受到多种因素的调控作用，主要是受到植物自身生长发育调节因子及环境等因素的调控，kup/hak/kt钾转运体既可以介导植物在低钾浓度下对k+的吸收，还能促进植物细胞的增大，在根部生长素的运输过程中也发挥着重要的作用，同时也参与植物的生长发育及逆境响应机制(gierthmetal.,2007)。
根据相关研究发现，kup/hak/kt钾转运体家族成员在表达模式上存在一定的差异，各自具有相应的功能特性。rubiof(2000)和
目前，在烟草中克隆得到三个kup/hak/kt家族的k+吸收转运体基因，分别是黄花烟草的nrhak1(guozetal.,2008)、普通烟草的nthak1(鲁黎明等,208)、林烟草的nshak8(宋毓峰等,2014)。但是关于nthak8基因的克隆及其功能在普通烟草中尚未见研究报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种具有促进钾吸收功能的核苷酸序列(nthak8基因序列)。
本发明所述烟草nthak8基因序列，并通过超表达和基因编辑技术证实了nthak8基因具有促进烟草钾吸收的功能。
发明人在已完成的烟草全基因组测序的基础上，克隆了nthak8基因，并通过转基因和基因编辑技术验证其功能，通过与对照组比较，发现转化了nthak8基因的转基因植株钾含量比对照组显著提高，而对nthak8基因进行编辑得到的植株钾含量比对照组显著下降。由此验证了nthak8基因是与钾吸收相关的功能基因，完成了本发明。
具体地，本发明包括以下几方面：
本发明的一个方面涉及一种具有促进植物钾吸收功能的核苷酸序列，所述核苷酸序列含有seqidno：1所示的核苷酸序列，即nthak8基因，所述基因的序列如下：
ggacagttttagccttagcttatcagagtttaggtgtggtgtatggagatttgagtacttcacctttatatgtatacaagagcacatttgcagaggatattcatcattcagagtctaatgaggagatatttggagttttatcatttgtgttttggacattaactcttattccattgcttaaatatgtgttcatagtattacgagctgatgataatggtgaaggtgggacttttgctttgtattccttattgtgccgtcatgcccgtgttagtactttgcctaatggtcaattggctgatgaggatttatatgagtacaagaatgatagaaaattgtcagctgataggattggaatgagcttgaaatcaactcttgagaaacacagatttttgaagaaaattttgctcattttagctttgattgggacttgtatggttattggtgatggagtccttacccctgcaatctcagtattctctgctgtctctggacttgaactttcaatggcaaagcatcatcaccaatatgtagaagttccagttgcttgtgtgatacttgtgttcttattttttctccagcactatgggacacatcgaataggatttctatttgcacctattgtgattacatggcttttttgcattagtgcaattgggctgtacaacatcttccactggaaccctcatgtttatcaagcattatctccatactacatgtacaaattcttaaagaagacccaaagaggaggatggatgtccctgggtgggattttattatgtataacaggttcagaagctatgtttgctgatcttggacacttttcccagctgtctattcagatagcttttacgtttgttgtttacccatcattaattcttgcttatatgggacaagctgcgtatctttccaagcatcatgttatccaaggtgattaccacatcgggttcaatgtatcagtacctgaaaaactgcggtatcctgttctggctattgctatacttgctgcagtggttggaagccaggccatcatcactgggacgttttctataatcaagcaatgttctgctttgggttgcttcccaagggtcaaaatagtacatacatcgtccaaaatccatggccagatttacattccagagataaactggacgttgatgttgctatgcctggcagttactattggcttccgtgacacgaaacacataagcaacgcatcaggtctggcagttataactgttatgctggtcactacgtgctttatgtctctagtcattgtcctctgctggcacaaaaacgtgttacttgccatttgctttatattcttctttggttccattgaagccctctacttttcagcttccctaatcaagttcctcgaaggggcctgggtaccgattgttctctctttgatatttctagtcgtcatgtacagttggcattatggcaccctgaaaaagtacgagtttgatgttgaaaacaaaattcccatcaactggctgctcaccttgagtcccaacctgggtattacacgggtccgtgacattggcctcatccacaccgagcttgtttcaggaattccagcaattttctcacatttcgtcaccaacctacctgctttccaccaggctcttgttttcctttgtgccagagagtccacaaatggatttaagcgttcgtgcagagttgcaagaactgatggaagcgcgggaagcaggcatggcgtttatccttggacattgttatgtaagagcaaagagaggttcaagtttgataaaaaaactggtggttgacataggatatgactttttgagaaggaattgtcgcgggccaseqidno：1。
本发明还涉及与seqidno：1所示序列互补的核苷酸序列，或其具有促进植物钾吸收功能的选自如下的变体：
1)在高等严紧条件下与seqidno：1所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
2)对seqidno：1所示的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列，和，
3)与seqidno：1所示的核苷酸序列具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列。
典型地，“杂交条件”根据测量杂交时所用条件的“严紧性”程度来分类。严紧性程度可以以例如核酸结合复合物或探针的解链温度(tm)为依据。例如，“最大严紧性”典型地发生在约tm-5℃(低于探针tm5℃)；“高等严紧性”发生在tm以下约5-10℃；“中等严紧性”发生在探针tm以下约10-20℃；“低严紧性”发生在tm以下约20-25℃。作为替代，或者进一步地，杂交条件可以以杂交的盐或离子强度条件和/或一或多次的严紧性洗涤为依据。例如，6×ssc＝极低严紧性；3×ssc＝低至中等严紧性；1×ssc＝中等严紧性；0.5×ssc＝高等严紧性。从功能上说，可以采用最大严紧性条件确定与杂交探针严紧同一或近严紧同一的核酸序列；而采用高等严紧性条件确定与该探针有约80％或更多序列同一性的核酸序列。
对于要求高选择性的应用，典型地期望采用相对严紧的条件来形成杂交体，例如，选择相对低的盐和/或高温度条件。sambrook等(sambrook，j.等(1989)分子克隆，实验室手册，coldspringharborpress，plainview，n.y.)提供了包括中等严紧性和高等严紧性在内的杂交条件。
为便于说明，用于检测本发明的多核苷酸与其它多核苷酸杂交的合适的中度严紧条件包括：用5×ssc、0.5％sds、1.0mmedta(ph8.0)溶液预洗；在50-65℃下在5×ssc中杂交过夜；随后用含0.1％sds的2×、0.5×和0.2×ssc在65℃下各洗涤两次20分钟。本领域技术人员应当理解，能容易地操作杂交严紧性，如改变杂交溶液的含盐量和/或杂交温度。
在本发明中，所述在高等严紧条件下与seqidno：1所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，其具有与seqidno：1所示的核苷酸序列相同或相似的促植物钾吸收的活性。
在本发明中，所述对seqidno：1所示的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列，是指分别或同时在所述核苷酸序列的5’端和/或3’端，和/或序列内部进行例如不超过2-45个，或者不超过2-30个，或者不超过3-20个，或者不超过4-15个，或者不超过5-10个，或者不超过6-8个的分别用逐个连续整数表示的碱基的取代、缺失、添加修饰。
在本发明中，所述对seqidno：1所示的核苷酸序列进行如上述一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列具有与seqidno：1所示的核苷酸序列相同或相似的功能。
通过一种多核苷酸进行说明，其所具有的核苷酸序列例如与seqidno：1的参考核苷酸序列至少具95％的“同一性”是指：在seqidno：1的参考核苷酸序列之每100个核苷酸中，该多核苷酸的核苷酸序列除了含有多达5个核苷酸的不同外，该多核苷酸之核苷酸序列与参考序列相同。换句话说，为了获得核苷酸序列与参考核苷酸序列至少95％相同的多核苷酸，参考序列中多达5％的核苷酸可被删除或被另一核苷酸替代；或可将一些核苷酸插入参考序列中，其中插入的核苷酸可多达参考序列之总核苷酸的5％；或在一些核苷酸中，存在删除、插入和替换的组合，其中所述核苷酸多达参考序列之总核苷酸的5％。参考序列的这些突变可发生在参考核苷酸序列的5’或3’末端位置，或在这些末端位置之间的任意地方，它们或单独散在于参考序列的核苷酸中，或以一个或多个邻近的组存在于参考序列中。
在本发明中，用于确定序列同一性和序列相似性百分数的算法是例如blast和blast2.0算法，它们分别描述在altschul等(1977)nucl.acid.res.25：3389-3402和altschul等(1990)j.mol.biol.215：403-410。采用例如文献中所述或者默认参数，blast和blast2.0可以用于确定本发明的核苷酸序列同一性百分数。执行blast分析的软件可以通过国立生物技术信息中心为公众所获得。
在本发明中，所述与seqidno：1所示的核苷酸序列具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列包括与seqidno：1所公开序列基本同一的多核苷酸序列，例如当采用本文所述方法(例如采用标准参数的blast分析)时，与本发明多核苷酸序列相比含有至少90％序列同一性、优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的序列同一性的那些序列。
在本发明中，所述与seqidno：1所示的核苷酸序列具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列具有与seqidno：1所示的核苷酸序列相同或相似的促进钾吸收的功能。
在本发明中，所述的nthak8基因来源于普通烟草nc89。
本发明的另一个方面涉及对上述nthak8基因序列具有特异性识别并编辑的靶序列，如含有seqidno：2所示的靶序列，所述靶序列如下：
agaggaggatggatgtccctgggseqidno：2。
本发明的另一方面涉及一种载体，其特征在于，所述载体含有本发明所述的nthak8核苷酸序列，所述载体可以通过例如将上述核苷酸序列插入克隆载体或表达载体而得到，或者可以通过人工合成得到。
本发明的另一方面涉及一种重组载体，其特征在于所述重组载体含有本发明所述的nthak8核苷酸序列，所述重组载体可以通过将上述核苷酸序列插入克隆载体或表达载体而得到。
适于构建本发明所述重组载体的克隆载体包括但不限于，例如：puc18、puc19、puc88、puc89、pmd19-t、pmd20-t、pmd18-tsimplevecter、pmd19-tsimplevecte、peasy-t1等。
适于构建本发明所述的表达载体包括但不限于，例如：pc2301m1dpb、pbi121、p13w4、pgem等。
在本发明的一个实施方案中，所述重组载体为pc2301m1dpb+nthak8重组载体。
本发明的另一方面涉及一种载体，其特征在于，所述载体含有本发明所述的nthak8靶序列，所述载体可以通过例如将上述靶序列插入编辑载体或者可以通过人工合成得到。
本发明的另一方面涉及一种重组载体，其特征在于所述重组载体含有本发明所述的nthak8靶序列，所述重组载体可以通过将上述靶序列插入编辑载体而得到。
在本发明的另一个实施方案中，所述编辑载体为sgrna-cas9+nthak8重组载体。
本发明的另一方面涉及一种含有本发明所述载体的重组细胞，所述重组细胞可以通过将含有本发明所述的载体转化至宿主细胞而得到。
适于构建本发明所述重组细胞的宿主细胞包括但不限于，例如：根癌农杆菌细胞lba4404、eha105、gv3101等。
在本发明的一个实施方案中，所述重组细胞为重组农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)eha105-pc2301m1dpb+nthak8。
在本发明的一个实施方案中，所述重组细胞为重组农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)eha105-sgrna-cas9+nthak8。
本发明的还一方面涉及一种双子叶植物愈伤组织，其特征在于，所述愈伤组织转化有本发明的核苷酸序列和/或载体和/或感染有本发明的重组细胞。
本发明的还一方面涉及一种转基因植物，其特征在于，所述转基因植物转化有本发明的核苷酸序列和/或载体和/或感染本发明的重组细胞。
本发明的还一方面涉及本发明的核苷酸序列和/或pc2301m1dpb+nthak8重组载体和/或eha105-pc2301m1dpb+nthak8重组细胞用于促进植物钾吸收的用途，以及用于制备转基因植物或用于植物育种的用途。
本发明的还一方面涉及本发明的sgrna-cas9+nthak8编辑载体和/或eha105-sgrna-cas9+nthak8重组细胞用于降低植物钾吸收的用途，以及用于制备基因编辑植物或用于植物育种的用途。
本发明的还一方面涉及本发明的愈伤组织用于制备转基因植物或用于植物育种的用途。
本发明的还一方面涉及一种促进植物钾吸收的方法，所述方法包括将本发明的核苷酸序列和/或pc2301m1dpb+nthak8重组载体转化入植物，或用本发明的eha105-pc2301m1dpb+nthak8重组细胞感染植物。
本发明的还一方面涉及一种降低植物钾吸收的方法，所述方法包括将本发明的sgrna-cas9+nthak8编辑载体转化入植物，或用本发明的eha105-sgrna-cas9+nthak8重组细胞感染植物。
所述方法包括用本发明的核苷酸序列转化双子叶植物的愈伤组织的步骤。在本发明的一个实施方案中，所述双子叶植物愈伤组织的转化利用了含有本发明的核苷酸序列的重组细胞。在本发明的一个实施方案中，所述双子叶植物愈伤组织的转化过程中利用了前述的重组农杆菌eha105-pc2301m1dpb+nthak8。在本发明的一个具体实施方案中，所述双子叶植物的愈伤组织为烟草愈伤组织，具体地，所述烟草为nc89。
所述方法包括用本发明的靶序列编辑转化双子叶植物的愈伤组织的步骤。在本发明的一个实施方案中，所述双子叶植物愈伤组织的转化利用了含有本发明的靶序列的重组细胞。在本发明的一个实施方案中，所述双子叶植物愈伤组织的转化过程中利用了前述的重组农杆菌eha105-sgrna-cas9+nthak8。在本发明的一个具体实施方案中，所述双子叶植物的愈伤组织为烟草愈伤组织，具体地，所述烟草为nc89。
在本发明中，可采用植物基因转化技术将目的基因插入到植物基因组中，包括农杆菌介导转化、病毒介导的转化、显微注射、粒子轰击、基因枪转化和电穿孔等。本领域周知，农杆菌介导的基因转化常被用于双子叶植物和双子叶植物的基因转化，但其它转化技术也可用于本发明所述双子叶植物的基因转化。基因转化后，采用通用的方法来筛选和再生整合有表达单元的植株。
在本发明中，可采用植物基因编辑技术对植物基因组中的目的基因进行编辑，包括crispr/cas9、zfns、talens等。本领域周知，crispr/cas9技术常被用于双子叶植物和双子叶植物的基因编辑，但其它编辑技术也可用于本发明所述双子叶植物的基因编辑。基因编辑后，采用通用的方法来筛选和再生整合有表达单元的植株。
本发明的一方面涉及一种促进植物钾吸收的方法，所述方法包括以下步骤：
1)将本发明的核苷酸序列和/或pc2301m1dpb+nthak8重组载体转化入植物愈伤组织，或用本发明的eha105-pc2301m1dpb+nthak8重组细胞感染植物愈伤组织；
2)利用所述愈伤组织再生转基因植物。
本发明的另一方面涉及一种降低钾吸收的方法，所述方法包括以下步骤：
1)将本发明的sgrna-cas9+nthak8编辑载体转化入植物愈伤组织，或用本发明的eha105-sgrna-cas9+nthak8重组细胞感染植物愈伤组织；
2)利用所述愈伤组织再生基因编辑植物。
在本发明中，所述植物优选是双子叶植物，所述双子叶植物包括但不限于烟草、棉花、大豆、番薯、马铃薯，特别优选为烟草，所述烟草包括但不限于，红花大金元、云烟85、云烟87、云烟97、云烟99、云烟80、云烟105、云烟86、云烟86、云烟202、云烟317、中烟100、中烟101、中烟103、中烟104、中烟201、中烟203、中烟206、毕纳1号、金海1号、贵烟1号、贵烟2号、贵烟3号、贵烟4号、韭菜坪2号、贵烟202、豫烟7号、豫烟8号、豫烟12号、豫烟13号、秦烟1号、秦烟96、秦烟201、安烟2号、安烟3号、蓝玉一号、闽烟12、闽烟35、闽烟38、金神农1号、翠碧2号、革新3号、鄂烟1号、鄂烟213、鄂烟215、湘烟3号、湘烟4号、湘烟5号、辽烟19、龙江925、龙江935、吉烟10号、粤烟216、k326、krk26、tn90lc、nc297、nc102、pvh1452、、nc55、pvh09、rgh51、tn86、nc89、nc628、pvh2254。在本发明的一个实施方案中，所述烟草为nc89。
在本发明的一个实施方案中，发明人从烟草nc89扩增得到基因nthak8，将该基因重组入新构建的pc2301m1dpb载体中得到含有该基因的重组表达载体，转化根癌农杆菌，利用重组农杆菌转化烟草叶片，通过烟草叶片的gus染色、dna鉴定及钾含量测定，并与未转入nthak8基因的组织或植物对比，证明nthak8基因与钾吸收相关并能够促进植物钾吸收含量。
在本发明的一个实施方案中，发明人从烟草nc89扩增得到基因nthak8后，设计其靶序列nthak8，将靶序列重组入sgrna-cas9载体中得到含有该靶序列的表达载体，转化根癌农杆菌，利用重组农杆菌转化烟草叶片，通过烟草叶片dna鉴定及钾含量测定，并与未编辑nthak8基因的组织或植物对比，进一步证明nthak8基因与钾吸收相关并能够促进植物钾吸收含量。
发明的有益效果:
本发明利用高通量测序技术，通过基因的遗传转化和基因编辑，挖掘出促进植物钾吸收的nthak8基因，所述基因能够大大提高转基因植物的钾吸收含量，证明了nthak8基因是与控制烟草钾吸收相关的功能基因，这将有利于在分子水平上更深入探讨该功能形成的生理机理和机制，达到对产量和品质的合理调控作用，对烟草的遗传育种产生重大的意义。
附图说明
图1是sgrna-cas9编辑载体示意图。
图2是pc2301m1dpb载体示意图。
图3是经转化nthak8的烟草叶片的gus染色结果图。
图4是nthak8-oe转基因植株与wt中的钾含量比较图。
图5是nthak8基因编辑株系与wt植株中的钾含量图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1nthak8基因的pcr扩增和peasy-t1+nthak8重组载体的构建
1、引物设计及合成：涉及上下游引物，并在引物中添加酶切位点，上游引物中还增加了保护碱基，具体序列如下：
引物名称碱基序列(5'to3')
nthak8fcgggatcccgatggatattgagagttggggtcgtseqidn0:3；
nthak8rcgagctcgtacatggtaaatcattccaacctccaseqidn0:4；
其中，nthak8f中下划线为bamhⅰ酶切位点，nthak8r中下划线为sacⅰ酶切位点。引物均由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成。
2、烟草总rna提取：烟草植株总rna的提取参照tiangenrnapureplantkit试剂盒进行。为预防rnase污染，研钵用酒精高温煅烧，自然冷却至室温备用；实验中所用的枪头，离心管均为rnase-free进口材料；实验过程中需经常更换手套，以免rna降解。
具体操作步骤如下：
1)植物材料在液氮中迅速研磨成粉末后，向已准备好的1.5mlrnase-free离心管中加入50-100mg植物组织粉末，作好标记，再依次加入450μl裂解液rl，4.5μlβ-巯基乙醇，涡旋剧烈震荡混匀。
2)将过滤柱cs放在收集管中，再将振荡混匀后的溶液转移至过滤cs上，12,000rpm离心5min，小心吸取收集管中的上清至rnase-free的离心管中，吸头避免触及收集管中的细胞碎片沉淀。
3)缓慢加入0.5倍上清体积的rnase-free无水乙醇(通常为225μl)，混匀(此时可能会沉淀出现)，将得到的溶液和沉淀一起转移至吸附柱cr3中，12,000rp离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr3放回收集管中。
4)向吸附柱cr3中加入350μl去蛋白液rw1，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr3放回收集管中。
5)配制dnaseⅰ工作液：吸取10μldnaseⅰ储存液放入新的rnase-free离管中，加入70μlrdd溶液，轻柔混匀。
6)向吸附柱cr3中央加入80μl的dnaseⅰ工作液，室温放置15min。
7)向吸附柱cr3中央加入350μl去蛋白液rw1，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr3放回收集管中。
8)向吸附柱cr3中加入500μl漂洗液rw(使用前需先确认是否已加入无水乙醇)，室温静置2min，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr3放回收集管中。
9)重复步骤8)。
10)12,000rpm离心3min，倒掉废液。将吸附柱cr3室温放入超净工作台风干，以彻底晾干离心柱中残余的漂洗液。
8)将吸附柱cr3放入一个新的rnase-free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30μlrnase-freeddh2o，室温放置5min，12,000rpm离心2min，收集rna，测定其浓度和纯度，rna样品在-80℃中保存。
rna浓度及质量检测：用nanodrop2000c紫外分光光度计测定rna浓度和纯度。用新鲜1×tae配置1.0％的琼脂糖凝胶，低温下120v电泳18min，检测rna完整性。
3、反转录合成cdna：反转录参照takara反转录试剂盒(prime
瞬时离心后，在pcr仪上进行反转录。程序如下：
37℃15min；
85℃5s；
16℃5min。
产物于-20℃冰箱保存。
4、目的基因的pcr扩增：
1)pcr加样：分别使用目的基因的特异性引物(即seqidno:3和4)，对目的基因进行pcr扩增，扩增反应参照takaratranstartaqbuffer说明书进行，依次加入以下试剂：
pcr程序：94℃预变性5min；(94℃变性30，65℃退火30s，72℃延伸1min40s)×32循环；72℃延伸10min，4℃保存。反应结束后，取3μlpcr产物，于1.0％琼脂糖凝胶中进行电泳检测。
5、目的基因的回收：目的片段回收参照takaraminibestagarosegeldnaextractionkit操作说明进行，具体步骤如下：
1)用跑出目标条带的pcr产物加入显色液，琼脂糖电泳15min，于紫外光下，迅速切取目的dna条带，装入2ml灭菌离心管中。
2)加入200μlbuffergm，在42℃中融化。
3)加入bufferwb700μl于离心柱中，12000rpm，离心1min，重复2次。
4)倒掉液体，12000rpm空离3min。
5)将盖子打开放在超净工作台中吹5min，确保液体挥发干净。
6)将离心柱置于新的离心管中，加入30μl55℃提前预热的水，12000rpm，离心1min，洗脱dna。洗脱出的dna于-20℃保存。
6、目的基因的连接与转化
1)将回收到的目的基因片段分别与peasy-t1simplecloningvector载体连接，存于2ml的灭菌离心管中，连接体系如下：
回收的dna3.5μl；
peasy-t1simple0.5μl。
置于冰上，过夜连接10h。
转化的具体步骤：
1)加连接产物于50μltrans1-t1感受态细胞中(冰上融化，刚解冻时加入)轻弹混匀，冰浴30min。
2)42℃热激60s后，立即置于冰上2min。
3)加入500μl平衡至室温的lb(配方见表2)，于摇床37℃、220rpm振荡培养，孵化1h。
4)将孵化后的菌液，均匀的涂到加入含卡那霉素抗性的lb固体培养基(配方见表2)上，37℃倒置暗培养过夜。
7、重组质粒的pcr鉴定
菌液pcr鉴定重组质粒：
1)吸取6μl的kana(配方见表1)、600μllb液体培养基(配方见表2)于2.0ml的灭菌离心管中。
2)用枪头挑取过夜培养后的白色单菌落，接种于lb溶液(配方见表2)中，于摇床37℃，220rpm振荡培养4-6h，直至菌液浑浊。使用m13f、m13r引物，以菌液为模板，通过菌液pcr分别对重组克隆进行阳性鉴定，加样体系如下：
3)pcr程序：95℃预变性5min；(95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min)×35循环；72℃10min，4℃保存。反应结束后，取3μlpcr产物，于1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。挑取阳性克隆。
提质粒步骤与测序：
1)将菌液转至1.5ml离心管中，12000rpm室温离心30s，弃除上清液，重复3-4次；
2)向菌体中加入250μlsolutionⅰ(使用前先加入rnasea)，涡旋振荡使其充分混匀；
3)加入250μlsolutionⅱ，上下颠倒混匀，室温放置4min至液体变清亮；
4)加入350μlsolutionⅲ，上下颠倒混匀，此时会有白色絮状沉淀出现，室温放置2min，14000rpm室温离心10min；
5)将上清液加入吸附柱中(切勿碰到白色沉淀，避免发生蛋白污染)，12000rpm室温离心1min，倒掉废液，吸附柱放入收集管中；
6)向吸附柱中加入500μlhbcbuffer，室温放置1min后12000rpm离心1min；
7)向吸附柱中加入700μlwashbuffer(使用前先加入无水乙醇)，12000rpm离心1min，倒掉液体，将吸附柱放入收集管中；
8)重复操作步骤3)；
9)空管12000rpm离心2min，将置于新的离心管的吸附柱在37℃烘箱中开盖放置10min，以彻底晾干吸附柱中残余漂洗液；
10)向吸附膜中央悬空滴加100μlelutionbuffer，37℃烘箱中放置5min，12000rpm离心2min，离心管收集到的即为质粒dna溶液；
11)将上述获得的质粒送华大基因测序，测序结果正确的命名为peasy-t1+nthak8重组载体。
实施例2pc2301m1dpb+nthak8重组载体的构建
本实施例即将目的基因nthak8构建入pc2301m1dpb载体中(载体图谱见图2所示)。
酶切t载体上的目的片段：
目的基因酶切体系：
分别在37℃下酶切3h，得到酶切后的目的基因片段和载体片段。
目的片段和载体回收：具体步骤同上。
目的片段和载体的连接：
37℃,2h连接。
连接产物转化大肠杆菌：具体步骤同上。
菌液pcr鉴定：具体步骤同上，鉴定引物使用克隆时使用的引物。
提质粒步骤与测序：具体步骤同上。测序正确的即为pc2301m1dpb+nthak8重组载体。
实施例3重组根癌农杆菌eha105-pc2301m1dpb+nthak8细胞的制备
表达载体转化农杆菌
1)向农杆菌eh105感受态细胞中加入10μl的质粒dna(实施例2所得的pc2301m1dpb+nthak8重组载体质粒)轻轻混匀；
2)冰浴30min，之后将感受态细胞置于液氮中冷冻8min，再迅速置于37℃水浴锅水浴5min，之后再冰浴2min；
3)在超净工作台上，加入无抗生素的yeb液体培养基850μl，上下颠倒混匀，于225rpm摇床上28℃培养4h；
4)培养4h后，4000rpm离心5min，除去800μl上清液，用无菌枪头吹打混匀；
5)将剩余悬浮液涂布于含有kana(配方见表1)和rif(配方见表1)的yeb固体培养基平板上，表面要涂至干燥为止；
6)将涂好的平板置于37℃烘箱培养2d；
7)平板上挑取单克隆进行pcr检测。
菌液pcr(引物为nthak8f和nthak8r)鉴定：具体步骤同上。鉴定正确的命名为重组根癌农杆菌eha105-pc2301m1dpb+nthak8。
实施例4烟草的遗传转化
1、培养无菌苗
1)将nc89种子置于4℃春化。
2)取800μl70％酒精洗涤nc89种子一次，静止2min。
3)取800μlddh2o洗涤nc89种子两次，振荡。
4)取800μlnaclo洗涤nc89种子一次，颜色由深棕变至黄色。
5)取800μlddh2o洗涤nc89种子3-5次，振荡。
6)将洗过的nc89种子倒在滤纸上，用灭菌的镊子蘸取1-2粒种子点涂在配制好的1/2ms培养基上，每瓶5颗左右。
7)将瓶子标注，放入培养室，先进行暗培养48h，再进行光照培养4天后可出苗。
2、农杆菌侵染
1)将无菌野生型烟草nc89叶片剪成1cm×1cm正方形叶盘(最好现用现剪，剪去叶片边缘及主脉四周形成伤口)；
2)取600-700μl菌液加到50ml无抗生素的yeb液体(配方见表2)中，28℃、225rpm摇床振荡培养4h至od600值约为0.6～0.8，4℃、4000rpm离心10min，倒掉上清液，将菌体在20ml冰冷的ms液体培养基悬浮，备用；
3)将提前剪好的正方形叶盘移至无菌瓶中，加入悬浮液侵染5min；
4)将叶盘移至无菌滤纸上吸干表面多余菌液，然后移至分化培养基(配方见表2)中暗培养2d；
5)2d后，把侵染后的叶盘移至烟草筛选培养基中培养，之后每隔14d更换一次培养基。
6)将在筛选培养基(配方见表2)中存活的不定芽，剪下插入生根培养基(配方见表2)中进行生根。
7)待根系长至1-2cm即可移栽到土壤中，获得抗除草剂ppt的植株。
8)烟草转基因植株筛选及鉴定
3、gus染色初选
经转化nthak8的烟草叶片的gus染色结果(见图3)。其中，由带有本发明所述nthak8基因的重组根癌农杆菌eha105-pc2301m1dpb+nthak8转化的烟草叶片(见图3左)经gus染色后呈现蓝色；不带有本发明nthak8基因的重组根癌农杆菌eha105-pc2301m1dpb+nthak8质粒的烟草叶片(见图3右)经gus染色后颜色未发生变化。
利用载体上启动子之前的正向引物+目的片段反向引物、目的片段正向引物+nos终止子之后两对引物pcr进行检测。(华大基因公司合成)。
启动子上引物f35s3n：ggaagttcatttcatttggagagseqidno:5；
终止子下引物rnos5n：tgccaaatgtttgaacgatcgggseqidno:6。
将鉴定出的转基因植株与野生型植株分别进行钾含量测定并对比其结果(见图4),其中nthak8-oe-1、nthak8-oe-2、nthak8-oe-3、nthak8-oe-4、nthak8-oe-5、nthak8-oe-6、nthak8-oe-7表示转基因植株，wt为野生型植株。通过过表达nthak8技术产生的转基因植株与野生型在同一条件下生长，其叶片的钾离子含量，从图4中可以看出过表达nthak8基因产生的株系nthak8-oe-1、nthak8-oe-2、nthak8-oe-3、nthak8-oe-4、nthak8-oe-5、nthak8-oe-6、nthak8-oe-7的叶片钾含量比野生型极显著提高，证明nthak8基因可以促进植株钾吸收。
实施例5nthak8基因的靶位点设计和sgrna载体的组装
1、nthak8基因的靶位点设计：在sgrna识别序列(不含pam序列)5'端加上用于识别酶切位点的接头序列(在上游引物5’端加上5’-gatt-3’接头，3’端加上5’-ggg-3’接头；下游引物5’端加上5’-caaa-3’接头)，合成引物(引物由华大基因公司合成)：
nthak8靶序列f：gattagaggaggatggatgtccctgggseqidno:7；
nthak8靶序列r：aaacagggacatccatcctcctctseqidno:8。
组装靶位点sgrna：
1)sgrna载体酶切:将人工合成的sgrna骨架质粒，序列如seqidno:9所示：
其中下划线为波浪线部分为bamhi酶切位点序列，下划点线为u3启动子序列,下划单线为bbsi酶切位点序列，下划双线为sgrna序列。上海旭冠生物科技公司合成。
将合成的sgrna骨架质粒按以下酶切体系进行酶切：
2)混匀后，37℃酶切2小时以上，之后进行琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外灯下切下目的条带。
目的sgrna片段回收：具体步骤同上；
靶位点引物变性、复性:
轻微混匀后，95℃变性5min,之后室温变性1h以上。将变性产物按1:25的体积比例进行稀释备用。
sgrna骨架载体与靶位点片段连接：
轻微混匀后，4℃连接过夜。
连接产物转化大肠杆菌：具体步骤同上。
阳性克隆鉴定：以平板上挑取的单克隆为pcr扩增模板，用sgrna载体引物(上游引物f)、靶位点引物(nthak8靶序列r)或sgrna载体引物(下游引物r)、靶位点引物(nthak8靶序列f)筛选阳性克隆，用taqdna聚合酶进行pcr扩增。(引物由华大基因公司合成)。
sgrna载体引物上游引物序列f：gaatctcgatccgtagaaacgseqidno:10；
sgrna载体引物上游引物序列r：aggtcttctgtgtaacgaagacseqidno:11。
1)pcr扩增体系：
2)pcr反应条件：95℃for5min；(95℃for30s；55℃for30s；72℃for1kb/min)，25-30循环，72℃for10min；16℃保存。pcr扩增结束后进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。根据条带大小将获得的阳性克隆再次挑取放入amp(配方见表1)、lb液体培养基(配方见表2)中，225rpm摇床上37℃培养16h。
3)菌液保存及质粒提取：在超净工作台上，将摇至混浊的菌液吸取850μl于1.4ml离心管中，再加入150μl的甘油混匀，保存在-80℃冰箱中。
质粒dna提取具体步骤同上。
sgrna插入pcacas9骨架载体得到sgrna-cas9编辑载体(见图2)：将上述获得的含有靶位点的sgrna根据其两端酶切位点逐步的组装到pcacas9骨架载体上。酶切pcacas9结束后需进行去磷酸化处理，回收目的片段进行连接，再将连接产物转化大肠杆菌dh5α，之后检测阳性单克隆，对其摇菌、提取质粒。
质粒转化农杆菌：具体步骤上。
crispr/cas9定点编辑体系转化烟草：具体步骤同上。
基因编辑株系筛选及检测。
1)ctab法提取烟草基因组dna
2)向2％ctab提取液中β-巯基乙醇(含量为2％)，置于65℃的恒温水浴锅中预热10min以上。
3)取100mg植株叶片于1.5ml离心管中，加入液氮用研磨棒迅速研磨成粉末，向离心管中加入700μl的预热的ctab提取液，摇匀。
65℃恒温水浴锅中水浴裂解45-60min，最好每10min将离心管上下轻轻摇晃一次。
4)裂解后冰浴10min，加入等体积(700μl)的氯仿：异戊醇(24:1)轻轻上下颠倒2-3min，12000rpm室温离心10min，将分层的上清液移至新离心管中。
5)再次加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)重复抽提一次，上下颠倒混匀，12000rpm室温离心10min。
6)将上清液至新的离心管中，并加入2/3体积的异丙醇(储存在-20℃冰箱)，上下轻轻混匀，置于-20℃冰箱30min以上，12000rpm室温离心10min。
7)白色沉淀即为dna，向沉淀中加入600μl75％乙醇轻轻颠倒使dna悬浮，放置20min，再用75％乙醇漂洗一次后，再用无水乙醇脱水2min。
8)去掉无水乙醇，抽真空干燥12-15min，至dna完全干燥(否则影响dna溶解)，加入30-40μlddh2o溶解，保存在-20℃冰箱备用。
基因编辑株系筛选
1)以转基因植株dna作pcr扩增模板，在靶位点上下游设计引物(华大基因公司合成)，用taqdna聚合酶进行pcr扩增。
上游引物f：gaaacaagaaacaacaactgtggaaseqidno:12；
下游引物r：ctgggaaaagtgtccaagatcagseqidno:13。
2)pcr扩增体系：
3)pcr反应条件：95℃for5min；(95℃for30s；55℃for30s；72℃for1kb/min)，25-30循环，72℃for10min；16℃保存。将pcr产物直接测序，和野生型序列进行比对，以确定靶基因是否发生突变，并计算效率。
突变类型的测定
1)将上述确定靶基因发生突变的pcr产物进行胶回收后与peasy-t1cloningvector载体连接，存于2ml的灭菌离心管中，连接体系如下：
回收的pcr产物4μl；
peasy-t1cloningvector1μl；
轻轻混合，室温(20℃-37℃)反应5min。反应结束后，将离心管置于冰上
2)转化的具体步骤：
①加上述连接产物于50μltrans1-t1感受态细胞中(在感受态细胞刚刚解冻时加入连接产物)轻弹混匀，冰浴20-30min。
②42℃水浴热激30s，立即置于冰上2min。
③加入250μl平衡至室温的lb液体培养基(配方见表2)，于摇床37℃、220rpm振荡培养1h。
④取8μl500mmiptg和40μl50mg/mlx-gal混合，均匀的涂在含amp(配方见表1)的lb固体培养基(配方见表2)上，37℃培养箱中放置30min。
⑤待iptg和x-gal被吸收后，取200μl菌液均匀的涂到上述的lb固体培养基(配方见表2)上，37℃倒置暗培养过夜。
区别之处在于蓝白斑筛选；鉴别阳性克隆时挑选白斑而非蓝斑。将阳性克隆进行测序，每棵单株需测不少于5个单克隆。利用dnaman软件对所有测序获得的序列和目标基因的参考序列进行比对分析，并统计靶基因碱基突变类型及效率。
将编辑植株与野生型植株分别进行钾含量测定并对比其结果(见图5)。图5是通过crispr-cas9技术编辑产生的编辑植物与野生型在同一条件下生长，其叶片的钾离子含量，从图5中可以看出基因编辑株系nthak8-2、nthak8-3、nthak8-4、nthak8-6、nthak8-7比野生型的钾含量极显著降低，证明将nthak8基因编辑后降低了植物对钾离子的吸收。
本发明实施例中所使用的相关培养基配方说明如下：
以下有关培养基中所称的“常规灭菌”是指如下条件的灭菌：121℃下蒸气灭菌20min。
抗生素及生化试剂贮存液的配制：常用抗生素及生化试剂贮存液的使用溶剂、贮存浓度、工作浓度或体积见下表。配置步骤：称取固体药品溶于少量溶剂中，待溶解后定容，再分装并贮存于-20℃。(其中以水为溶剂的需用0.22μm滤膜过滤除菌后再分装)
表1抗生素配制表
表2培养基配制表
表3主要实验试剂及试剂盒厂家表
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
sequencelisting
<110>西南大学
<120>nthak8基因及其用途
<130>p西南大学-0002
<160>13
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>1830
<212>dna
<213>烟草nc89
<400>1
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cacctttatatgtatacaagagcacatttgcagaggatattcatcattcagagtctaatg120
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