本发明属于生物技术领域，具体涉及一种特异性靶向识别黑色素瘤耐药细胞的核酸适体与试剂盒。
背景技术：
皮肤癌是皮肤细胞不受控制地异常增殖从而形成的恶性肿瘤，它是因皮肤细胞的dna发生了不可修复的损伤（如基因突变，遗传缺陷）而引起。皮肤癌可分为三种类型：基底细胞皮肤癌，鳞状细胞皮肤癌与黑色素瘤（malignantmelanoma,mm）。其中虽然黑色素瘤的发生比例仅占各类型皮肤癌的4%，但却是恶性化程度最高的一类，易转移，也是造成皮肤肿瘤相关死亡的主要原因。黑色素瘤在我国的发病率逐年增长，年增长率为3%~5%。大多数早期黑色素瘤患者可通过外科手术治愈，但患者往往术后发生转移，预后差且5年内死亡率高。发生转移的黑色素瘤一般以内科为主的综合治疗包括：①化疗，如：达卡巴嗪、替莫唑胺等；②免疫治疗，如：pd-1抑制剂、ctla-4抑制剂等；③靶向治疗，如：威罗菲尼、达拉菲尼等；④放射治疗。
研究发现≥50%的黑色素瘤患者存在brafv600e突变，该突变可导致braf蛋白呈持续激活状态，从而引起下游mapk（mitogen-activatedproteinkinase）信号通路的持续激活，并最终导致癌细胞的存活与增殖。威罗菲尼（vemurafenib,plx4032）是一种特异靶向brafv600e的抑制剂，主要用于治疗晚期brafv600e突变型的黑色素瘤患者。相比化疗药物，威罗菲尼具有出低毒性、患者耐受性高、快速的临床应答等特点。约100%的患者对药物的持续应答时间有限，中位无进展生存期（progressionfreesurvival,pfs）约为5.1—6.8个月，而造成这一现象的原因在于肿瘤细胞对威罗菲尼产生了耐药。因此，研发新型的针对威罗菲尼耐药黑色素瘤的靶向治疗或靶向药物呈递的策略，对黑色素瘤的治疗具有重大医学意义。
核酸适体（aptamer）在肿瘤早期诊断、治疗及靶向药物呈递等诸多方面具有较大的应用前景。核酸适体是通过模拟自然进化过程的人工筛选技术-指数富集配体系统进化技术（systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment,selex）筛选与扩增得到的具有识别功能的短的单链dna或rna分子，能通过折叠形成特定的三维结构与多种类型的靶标高亲和性、高特异性结合，包括有机染料、核苷酸、氨基酸、多肽、蛋白质、细胞、病毒和细菌。核酸适体除能与各种靶标分子高特异性、高亲和力结合外，还具有分子量较小、低免疫原性、易合成、改造与标记、生物化学稳定性好、生物相容性好等多种优势。细胞-selex（cell-selex）是在selex基础上发展的一项新的细胞筛选技术，该技术筛选核酸适体是以活性细胞为筛选对象，无需事先了解靶目标的分子特征，能确保目标分子保持天然构象，最大程度保留其生物功能，该技术不仅可用于确定某种疾病或细胞的生物标志物，而且也非常有利于获得具有治疗潜力的核酸适体。到目前为止，基于细胞筛选核酸适体的工作已经在肺癌、肝癌、多发性骨髓瘤和白血病等多种细胞中开展。然而，基于威罗菲尼耐药黑色素瘤细胞株筛选核酸适体尚未有报道。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种特异性靶向识别黑色素瘤耐药细胞的核酸适体与试剂盒。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
一种特异性靶向识别威罗菲尼耐药黑色素瘤的核酸适体，所述核酸适体序列如seqidno.1所示，命名为核酸适体ll4。所述核酸适体的序列还可以是将核酸适体ll4的5'端9个碱基截去后所得的截短序列，截短序列如seqidno.2所示，命名为核酸适体ll4a，核酸适体ll4a与核酸适体ll4功能相同。
核酸适体ll4:
5'-accgaccgtgctggactcacctcgaccagagccattgggtttcctaggaaatagggcctttactatgagcgagcctggcg-3'(seqidno.1)；在保持ll4保守序列（下划线部分）不变的情况下可将核酸适体进行修饰和改造，得到核酸适体的衍生物，核酸适体的衍生物可以为：a)对所述核酸适体ll4的两端的核苷酸进行删减，得到与ll4功能相同的核酸适体的衍生物，如核酸适体ll4a：5'-gctggactcacctcgaccagagccattgggtttcctaggaaatagg
gcctttactatgagcgagcctggcg-3'(seqidno.2)。
b)对所述核酸适体ll4两端核苷酸的碱基进行人工碱基替换，得到与ll4功能相同的核酸适体的衍生物。c)将上述核酸适体连接上荧光物质、放射性物质、治疗性物质、生物素、酶标记等物质后，得到的与所述核酸适体具有相同结合能力的核酸适体衍生物。本发明还提供一种特异性靶向识别威罗菲尼耐药黑色素瘤的试剂盒，所述试剂盒中含有所述的核酸适体。
本发明还提供一种特异性靶向识别威罗菲尼耐药黑色素瘤的靶向药物呈递载体，所述靶向药物呈递载体由所述的核酸适体制备得到。
筛选本发明所述核酸适体的方法包括如下步骤：
（1）合成序列如seqidno.3所示的初始随机ssdna筛选文库，以及序列如seqidno.4和seqidno.5所示的正向引物、反向引物，seqidno.4所示序列的5'端被异硫氰酸荧光素（fitc）标记，seqidno.5所示序列的5'端被生物素（biotin）标记；
（2）正向筛选：将初始随机ssdna文库与威罗菲尼耐药黑色素瘤细胞株sk-mel28-plx(以下简称靶细胞)孵育，孵育完成后洗脱掉未与细胞结合或者结合不牢的ssdna，收集细胞，95℃加热变性分离结合细胞的核酸适体；
（3）以步骤（1）所述的引物对步骤（2）分离出的核酸适体进行pcr扩增，得到扩增产物；
（4）用链霉亲和素葡聚糖微球分离生物素标记pcr扩增产物，然后利用0.2m氢氧化钠使双链dna变性解链，收集异硫氰酸荧光素标记的dna单链文库，作为第一轮核酸产物；
（5）正向筛选：将步骤（4）所得的第一轮核酸产物取代步骤（2）的初始随机ssdna筛选文库，并重复步骤（2）~（4），筛选得到第二轮核酸产物；
（6）第二轮核酸产物先反向筛选：将第二轮核酸产物与黑色素瘤亲代细胞sk-mel28（以下简称对照细胞）孵育，收集细胞孵育后的上清液，排除掉非特异结合的核酸序列；
（7）第二轮核酸产物再正向筛选：将步骤（6）所得的上清液与靶细胞孵育，孵育完成后洗脱掉未与靶细胞结合或者结合不牢的ssdna，分离结合于细胞的核酸适体；
（8）以步骤（1）所述的引物对步骤（7）分离出的核酸适体进行pcr扩增，得到扩增产物；
（9）将步骤（8）得到的扩增产物，重复步骤（4），筛选得到第三轮核酸产物；
（10）将第三轮核酸产物取代步骤（6）中的第二轮核酸产物，并重复步骤（6）~（9）的筛选过程；
（11）如此重复进行十五轮循环，筛选得到与靶细胞结合能力强的最终核酸产物；
（12）将最终核酸产物进行高通量测序，利用流式细胞术检测最终核酸产物中dna序列与靶细胞的结合选择性和亲和力，确定核酸适体。
本发明的有益效果在于：
本发明首次基于威罗菲尼耐药黑色素瘤细胞株与敏感株通过细胞筛选得到的核酸适体具有高亲和力（kd=82.18±12.99nm）、高特异性、分子量小、低免疫原性、低毒性；能够体外化学合成，可以对不同部位进行修饰和取代，且序列稳定，易于保存；便于标记(不需要标记的二抗)等。本发明的核酸适体能在体外和小鼠移植瘤体内特异性且高亲和力的靶向识别威罗菲尼耐药黑色素瘤细胞。利用本发明的核酸适体可为临床威罗菲尼耐药的黑色素瘤提供一种新的稳定的靶向药物呈递载体，具有重要意义。
附图说明
图1为本发明实施例筛选过程中适体文库的富集过程：左图峰形代表对照细胞sk-mel28与异硫氰酸荧光素（fitc）标记的初始文库和第12轮、14轮、15轮筛选产物结合后的荧光强度；右图峰形代表靶细胞sk-mel28-plx与异硫氰酸荧光素（fitc）标记的初始文库和第12轮、14轮、15轮筛选产物结合后的荧光强度；
图2为本发明实施例中核酸适体(seqidno.1)与对照细胞sk-mel28及靶细胞sk-mel28-plx结合能力的流式检测结果；
图3为本发明实施例中核酸适体(seqidno.1)的序列优化分析；
图4为本发明实施例中核酸适体(seqidno.1)、核酸适体(seqidno.2)与靶细胞结合的拟合曲线及解离常数(kd)；
图5为本发明实施例中核酸适体(seqidno.2)与靶细胞sk-mel28-plx的结合稳定性检测；
图6为本发明实施例中核酸适体(seqidno.2)在完全培养基中稳定性的分析；
图7为本发明实施例中核酸适体(seqidno.2)在同时接种两种类型肿瘤（左：黑色素瘤sk-mel28右：威罗菲尼耐药黑色素瘤sk-mel28-plx）的裸鼠模型中的靶向识别作用。
具体实施方式
细胞来源：
本实验筛选所用黑色素瘤亲代细胞株sk-mel28购自美国atcc细胞库，所用威罗菲尼耐药黑色素瘤细胞株sk-mel28-plx由本申请发明人课题组通过逐渐增加药物浓度的方法筛选获得。
本发明利用核酸适体的体外筛选技术cell-selex，以威罗菲尼耐药黑色素瘤细胞株sk-mel28-plx为正筛细胞（靶细胞），以黑色素瘤亲代细胞株sk-mel28为反筛细胞（对照细胞），从体外合成的随机寡聚dna文库中筛选出与耐药细胞特异结合的核酸适体。
实施例1：威罗菲尼耐药黑色素瘤细胞株sk-mel28-plx特异性核酸适体的筛选
（1）所用核酸文库和引物的设计：
初始随机ssdna筛选文库：
5'-accgaccgtgctggactcannnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnactatgagcgagcctggcg-3'（n代表a、t、c和g四种碱基）（seqidno.3），即该初始随机ssdna筛选文库理论库容量为442条dna；
上游引物：5'-异硫氰酸荧光素-accgaccgtgctggactca-3'(seqidno.4)；
下游引物：5'-生物素-cgccaggctcgctcatagt-3'(seqidno.5)；
（2）正向筛选：
2.1孵育：用结合缓冲液溶解上述的初始随机ssdna筛选文库，95℃水浴高温变性10min，变性完之后迅速放入冰中冷却10min，然后与已经培养和预处理好的靶细胞在4℃，水平摇床上孵育2h。
2.2解离：孵育完成后移除孵育培养皿中溶液，用洗涤缓冲液洗涤孵育培养皿中的细胞，用1mlrnasefreeh2o刮取孵育培养皿中细胞，收集于1.5ml离心管中，95℃加热变性10min，冰上复性10min，2000rpm离心5min后取上清，分离结合的核酸序列。
（3）进行pcr扩增文库：取步骤2中筛选所得的核酸序列进行常规pcr1扩增，上游引物：5'-异硫氰酸荧光素-accgaccgtgctggactca-3'；下游引物：5'-生物素-cgccaggctcgctcatagt-3'；扩增条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s；57.7℃退火30s；72℃延伸30s进行预扩增8个循环，最后72℃延伸5min。之后从pcr1产物中取扩增体系的2.4%作为模板设置不同循环数进行pcr2扩增，用3%琼脂糖凝胶电泳进行验证找出最优循环数。用此最优循环数以剩下的pcr1扩增产物为模板进行大量pcr3扩增。
（4）制备dna单链文库：用链霉亲和素葡聚糖微球分离生物素标记步骤（3）中最终得到的pcr扩增产物，然后利用0.2m氢氧化钠使双链dna变性解链，收集异硫氰酸荧光素标记的dna单链文库，作为第一轮核酸产物。
（5）正向筛选：将步骤（4）所得的第一轮核酸产物取代步骤（2）的初始随机ssdna筛选文库，并重复步骤（2）~（4），筛选得到第二轮核酸产物。
（6）第二轮核酸产物先反向筛选：将第二轮核酸产物与对照细胞孵育，孵育完成后收集细胞孵育后的上清液，排除掉非特异结合的核酸序列。
（7）第二轮核酸产物再正向筛选：将步骤（6）所得的上清液与靶细胞孵育，孵育完成后洗脱掉未与靶细胞结合或者结合不牢的ssdna，分离结合于细胞的核酸适体。
（8）以步骤（1）所述的引物对步骤（7）分离出的核酸适体进行pcr扩增，得到扩增产物。
（9）将步骤（8）得到的扩增产物，重复步骤（4），筛选得到第三轮核酸产物。
（10）核酸适体循环筛选：将第三轮核酸产物取代步骤（6）中的第二轮核酸产物，并重复步骤（6）~（9）的筛选过程。
（11）如此重复进行十五轮循环，如图1，筛选得到与靶细胞结合能力强的最终核酸产物。
（12）将最终核酸产物（第十五轮核酸产物）进行高通量测序，利用流式细胞术检测测序所得dna序列与靶细胞的结合选择性和亲和力，如图2所示，确定核酸适体ll4。
核酸适体ll4序列为:
5'-accgaccgtgctggactcacctcgaccagagccattgggtttcctaggaaatagggcctttactatgagcgagcctggcg-3'(seqidno.1)。
实施例2：核酸适体(seqidno.1)的序列优化分析
用mfold软件对筛选到的核酸适体ll4的二级结构进行分析优化，通过逐渐删减两端固定序列的方式，得到删减后的7条ssdna链。将已经准备好的异硫氰酸荧光素标记的核酸适体(seqidno.1)，初始文库和7条删减后的ssdna链加到相应sk-mel28-plx细胞样品中（每个样2×105个细胞），4℃，孵育1h，孵育完后1000rpm离心5min，去上清，再用洗涤缓冲液洗涤两次，每次1000rpm，5min。洗涤完后用400μl结合缓冲液重悬，用流式细胞术检测删减后的ssdna链与靶细胞结合情况。如图3结果显示，截短序列ll4a与靶细胞的结合能力强于核酸适体ll4。
核酸适体ll4a序列为:
5'-gctggactcacctcgaccagagccattgggtttcctaggaaatagg
gcctttactatgagcgagcctggcg-3'(seqidno.2)。
实施例3：核酸适体(seqidno.1)、核酸适体(seqidno.2)与靶细胞结合的拟合曲线及解离常数(kd)
将得到的核酸适体ll4(seqidno.1)、核酸适体ll4a(seqidno.2)在5'端标记异硫氰酸荧光素分子制成分子探针，分别取0nm、25nm、50nm、75nm、100nm、200nm、300nm、400nm、500nm的分子探针溶液，与2×105个sk-mel28-plx细胞4℃孵育1h，孵育完后1000rpm离心5min，去上清，再用洗涤缓冲液洗涤两次，每次1000rpm，5min。洗涤完后用400μl结合缓冲液重悬，用流式细胞仪测定细胞表面的荧光强度。如细胞能结合荧光标记的核酸适体，则以荧光强度对探针浓度作图，用公式y＝bmaxx/(kd+x)计算核酸适体的平衡解离常数kd。如图4结果显示，核酸适体的平衡解离常数均在纳摩尔范围内，且核酸适体ll4a(seqidno.2)与靶细胞的亲和力优于核酸适体ll4(seqidno.1)。
实施例4：核酸适体(seqidno.2)与靶细胞sk-mel28-plx的结合稳定性检测
准备两管靶细胞sk-mel28-plx样品（每个样2×105个细胞），将已经准备好的异硫氰酸荧光素标记的核酸适体(seqidno.2)加到相应细胞样品中，一组样品在4℃，孵育1h，另一组样品在37℃，孵育1h，孵育完后1000rpm离心5min，去上清，再用洗涤缓冲液洗涤两次，每次1000rpm，5min。洗涤完后用400μl结合缓冲液重悬，流式细胞术检测细胞的荧光信号强度。如图5结果显示，在4℃和37℃的条件下，靶细胞与异硫氰酸荧光素标记的核酸适体(seqidno.2)的结合强弱没有差异，说明核酸适体(seqidno.2)与靶细胞结合稳定，不受温度的影响。
实施例5：核酸适体(seqidno.2)在完全培养基中稳定性的分析
将3μm异硫氰酸荧光素标记的核酸适体(seqidno.2)溶于400μl含10％fbs的mem细胞培养基中，在37℃分别孵育0h，2h，4h，6h，8h，12h，24h，36h，48h，每次取出40μl的样品，立即95℃变性10min，变性完后立即置于-80℃保存。当所有时间点样品收集完毕，将样品置于4℃，待其溶解后，取9ul样品于3％的琼脂糖凝胶中进行电泳分离，然后经凝胶成像仪成像分析。如图6结果显示，核酸适体(seqidno.2)能在上述培养基稳定存在8h。
实施例6：cy5标记的核酸适体(seqidno.2)在裸鼠模型中的应用测试
balb/c-nu小鼠购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，雌性，四周龄。待裸鼠适应新环境后，在同一只裸鼠的左侧背部皮下注射4百万个对照细胞sk-mel28，右侧背部皮下注射4百万个靶细胞sk-mel28-plx，使裸鼠成瘤，肿瘤细胞生长约15-20天（肿瘤直径大小为0.5-1.0cm）。皮下双侧成瘤的裸鼠通过尾静脉注射6.4nmolcy5标记的核酸适体ll4a(seqidno.2)，在固定的时间点通过ivisluminaii小动物成像系统采集荧光信号。如图7结果显示：在同时接种两种类型肿瘤（左：对照细胞右：靶细胞）的裸鼠模型中，通过尾静脉注射荧光标记的核酸适体ll4a(seqidno.2)5min后，右侧靶细胞位置就出现荧光信号；30min后，该位置的荧光信号强度达到最强；60min后荧光信号有所降低；2h后荧光信号几乎消失，3h时荧光信号完全消失。而左侧对照细胞肿瘤组织处，在整个观察过程中，都未见荧光信号。肾脏为代谢场所，故也可见荧光信号。
核苷酸序列表
<110>中南大学
<120>一种特异性靶向识别黑色素瘤耐药细胞的核酸适体与试剂盒
<160>5
<210>1
<211>80
<212>dna
<400>1
accgaccgtgctggactcacctcgaccagagccattgggtttcctaggaaatagggcctttactatgagcgagcctggcg80
<210>2
<211>71
<212>dna
<400>2
gctggactcacctcgaccagagccattgggtttcctaggaaatagg
gcctttactatgagcgagcctggcg71
<210>3
<211>80
<212>dna
<400>3
accgaccgtgctggactcannnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnactatgagcgagcctggcg80
<210>4
<211>19
<212>dna
<400>4
accgaccgtgctggactca19
<210>5
<211>19
<212>dna
<400>5
cgccaggctcgctcatagt19