本发明属于检测领域，具体涉及一种可以特异性检测ev71病毒的适配体及试剂盒。
背景技术：
肠道病毒71型(ev71)属于小rna病毒科(picornaradae)肠道病毒属(enterovirus)成员，归属于人类肠道病毒a。1974年schmidt等人首次报道从美国加利福尼亚暴发的表现为神经系统症状疾病(1969～1973年)的患者中分离到ev71，随后，世界上许多国家相继报道了ev71病毒在不同地区的流行情况，ev71病毒已在世界范围内引起多次暴发与流行，人们逐渐认识到ev71病毒是手足口病的主要病原。目前已知ev71的感染可以导致手足口病、疱疹性咽喉炎、无菌性脑膜炎等多种与神经系统相关的疾病。手足口病多发生于5岁以下儿童，表现口痛、厌食、低热、手、足、口腔等部位出现小疱疹或小溃疡，多数患儿一周左右自愈，少数患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症。个别重症患儿病情发展快，导致死亡。目前缺乏有效治疗药物。而抗病毒治疗一般在发病24小时到48小时前使用才是最佳的，因此，急需一些可以快速并灵敏检测ev71病毒的方法，从而可以早发现早治疗。
核酸适配体(aptamer，又称适配体，适配子)是能高亲和性、高特异性的结合某种生物靶标的单链寡核酸分子(ssdna或ssrna)。核酸适配体是通过指数富集配体系统进化技术(systematlcevolutlonofllgandsbyexponentlalenrlchment，selex)从人工合成的dna/rna文库中筛选得到的能够高度特异性结合靶标分子的单链dna/rna。已报道核酸适配体的靶标包括金属离子、有机小分子、多肽、蛋白质、细胞甚至组织等。核酸适配体的分子识别功能与抗体类似，具有与抗体分子相当甚至更强的靶标识别能力，但与抗体相比具有很多优良的特性，如分子量小，能批量生产，不易失活，无免疫原性、容易合成与标记、快速的穿透组织、良好的代谢动力学、不同批次之间产品不会存在差异和具有很好化学稳定性，在生物检测、疾病诊断治疗等领域具有重要的应用前景。
目前ev71的检测方法包括病毒的分离培养法、逆转录聚合酶链反应、ev71中和抗体测定法、ev71-igm胶体金免疫层析法、ev71抗体酶联免疫吸附法、补体结合试验等。但这些技术均有耗时长，灵敏度不高，成本高昂等缺点。因此，急需一种灵敏度高，时间短，成本低廉的检测方法。而适配体则是解决上述问题的一种方法。中国专利号cn201110067159(一种检测手足口病病原的纳米探针芯片及其应用方法)公开了一个与ev71vp1区结合的适配体，但其也仅说明能够与ev71进行结合，并未深入研究其结合率以及灵敏性和特异性。
因此，开发一种灵敏性高，稳定性好的ev71适配体的需求是非常迫切的，并且现有技术中还并未有针对ev71vp2的适配体。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种可以特异性检测ev71病毒的适配体及试剂盒。其具有灵敏度高，制备简单，成本低廉，容易保存的优点。
本发明提供的核酸适配体，是如序列表的序列1所示的单链dna(seqidno.1)；
所述核酸适配体与ev71病毒vp2蛋白具有较好的亲和能力。
还可将所述核酸适配体进行修饰或改造，得到所述核酸适配体的衍生物。
所述核酸适配体的衍生物可为如下任意一种：
a)将所述核酸适配体的骨架改造为硫代磷酸酯骨架，得到的与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体的衍生物；
b)将核酸适配体改造为肽核酸，得到的与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体的衍生物；
c)将所述核酸适配体连接上荧光、放射性和治疗性物质后，得到的与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体的衍生物。
所述核酸适配体可用于制备检测ev71病毒的试剂盒。
本发明还保护一种辅助检测ev71病毒患者的试剂盒，包括所述核酸适配体。所述试剂盒还可包括包被有ev71病毒vp2蛋白单克隆抗体的酶标板(如96孔板)。利用本发明的核酸适配体，可以在ev71病毒感染初期，通过检测ev71病毒vp2抗原而不是抗体实现对ev71病毒的检测。为上述的抗病毒药物的治疗提供契机。
利用本发明的核酸适配体，可以捕获溶液中的ev71病毒vp2蛋白，也可以检测溶液中的ev71病毒，将有利于ev71病毒血清学诊断和血液筛查。利用本发明的核酸适配体，部分代替单克隆抗体捕获vp2蛋白进行ev71病毒检测，具有高灵敏、成本低、易制备、易保存的优点。本发明具有很高的应用价值。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
n1-nta琼脂糖微珠购自qlagen公司。链霉亲和素修饰的96孔板(购于plerce公司)。辣根过氧化物酶(hrp)标记的链霉亲和素购自plerce公司。大肠杆菌(e.coll)dh5α菌株购自北京鼎国公司。大肠杆菌(e.coll)bl21(de3)菌株购自lnvltrogen公司。原核表达载体plml；公众可以从中国科学院化学研究所获得。
实施例1相关蛋白和相关溶液的制备
一、带组氨酸标签的ev71vp2蛋白(靶标蛋白)的制备
1.vp2蛋白的编码基因的扩增
vp2蛋白的序列是本领域已经公知的。如：genbank：kf051454.1。
以ev71病毒为模板，作为pcr扩增的模板，用引物1和引物2组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。
引物1(上游引物)：5’-gaattctggaagttgccggatgtg-3’；
引物2(下游引物)：5，-ggatccaccacccccgtgtgacag-3’；
pcr扩增条件：95℃2min(1个循环)；95℃30s，60℃30s，72℃30s(35个循环)；72℃10min,4℃保存(1个循环)。
2.原核表达载体的构建
①用限制性酶ecorl和bamhl双酶切步骤1的pcr扩增产物，得到酶切产物。
②用限制性酶ecorl和bamhl双酶切原核表达载体plml，回收载体骨架。
③通过连接酶将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接，得到连接产物。
④将连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，用含氨苄青霉素(amp)的lb平板筛选阳性克隆，提取质粒依次进行酶切鉴定和测序鉴定。
测序结果表明，得到了重组质粒plml-vp2(骨架质粒为原核表达载体plml，在ecorl和bamhl酶切识别位点之间插入了ev71病毒vp2蛋白的编码基因与载体上的组氨酸标签的编码基因融合，表达带组氨酸标签的ev71病毒vp2蛋白)。
3.带组氨酸标签的ev71病毒vp2蛋白的原核表达鉴定
①将重组质粒plml-vp2转化大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，用含氨苄青霉素的lb平板筛选阳性克隆。
②挑取阳性克隆于lb液体培养基，37℃振摇过夜，加入1ptg(终浓度1mmol/l)继续培养诱导10h。
③13000rpm离心1m1n，收集菌体进行sds-page电泳和westernblot。westernblot的一抗为anti-his(购自slgma公司)。westernblot的结果表明，菌体中含有带组氨酸标签的ev71病毒vp2蛋白。
4.带组氨酸标签的ev71病毒vp2蛋白的大量表达、纯化及检测
①将重组质粒plml-vp2转化大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，得到重组菌。
②将步骤①得到的重组菌接种lb培养基，37℃振荡培养过夜，按1∶50的体积比转接到含50ug/ml氨苄青霉素的lb培养基中，37℃200r/h培养约2h(使od600在0.6-0.8之间)，加入1ptg(终浓度1mmol/l)继续培养诱导12h。
③3500rpm离心收集菌体，在含100ug/ml溶菌酶的startbuffer(0.02m磷酸钠，0.5mnacl，ph7.4)中超声破碎(频率120w，每个循环内超声3s停3s，400个循环，在冰浴上进行)，4℃、10000rpm离心10m1n，收集裂解上清。
④将裂解上清上样于n1-nta偶联的琼脂糖黏附柱(购自ge公司)，用washlngbuffer(0.02m磷酸钠，0.5mnacl，0.05m咪唑，ρh7·4)洗涤去除杂蛋白，用elutlonbuffer(0.02m磷酸钠，0.5mnacl，0.5m咪唑，ph7.4)洗脱目的蛋白，得到带组氨酸标签的ev71病毒vp2蛋白(用ev71病毒vp2抗原检测试剂盒检测为阳性)。
实施例2、核酸适配体的筛选和制备以及特异性检测
一、核酸适配体的核苷酸序列
从体外人工合成的两端为固定序列、中间为35个随机序列、全长为85个碱基的ssdna文库，采用selex技术、结合诱变pcr技术，通过克隆、测序、亲和力测定等手段，筛选获得与ev71病毒vp2蛋白特异结合的单克隆核酸适配体。核酸适配体的核苷酸序列为：
序列1：5’-atgccgacggcatgcgctacgtgcatgcacatgtaccgttacctcacaatgggcctgggctgctaccctaacttaccagcgtgta-3’
二、核酸适配体的特异性(通过荧光素检测)
1.用异硫氰酸荧光素(fitc)标记上述制备的核酸适配体1
2.用异硫氰酸荧光素(fitc)标记公开号：cn201110067159中的适配体序列1,2,3：
5’-atacgggagccaacaccattctatcgttccggacgcttatgccttgccatctacagagcaggtgtgacggat-3’；(核酸适配体2，seqidno.2)
5’-atccgtcactcctgctctgtagatggcaaggcataagcgtccggaacgatagaatggtgttggctcccgtat-3’；(核酸适配体3，seqidno.3)
5’-atacgggagccaacaccatgaatatctcttctacctcctctcctccctttacttagagcaggtgtgacggat-3’(核酸适配体4，seqidno.4)。
3.靶标和对照蛋白的固定
①取200uln1-nta琼脂糖微珠置于5ml离心管中，移走上清，pbs缓冲液洗涤三次；
②将步骤①的微珠分散于1ml靶标蛋白或对照蛋白，例如ev71病毒vp1蛋白、vp3蛋白、bsa、人血红蛋白、流感ha蛋白，gp120蛋白中，室温孵育1h，pbs缓冲液离心洗涤三次；
③将步骤①的微珠重新分散于1mlpbs缓冲液中，置于4℃备用。
4.核酸适配体与靶标蛋白结合的特异性
设置3组以进行实验：
第1组：将1ul10umfitc标记的核酸适配体1,2,3,4与50ul固定有靶标蛋白ev71vp2的微珠孵育1h；
第2组：将1ul10umfitc标记的随机文库与50ul固定有靶标蛋白的微珠孵育1h；
第3-8组：将1ul10umfitc标记的核酸适配体1,2,3,4和随机文库与50ul分别固定有6种对照蛋白的微珠孵育1h；
各组均在刚加入微珠结合前和孵育1小时结合后，测量上清中的荧光强度。
特意率(结合率)＝(结合前荧光强度-结合后荧光强度)/结合前荧光强度x100％。
结果表明：适配体1与vp2的结合高达98.6％，与靶标蛋白vp2结合有很好的特异性，且适配体1与其他对照蛋白均不能结合，随机文库也无法与靶标蛋白结合。另外地，适配体2,3,4与vp1的特异性要小于本申请适配体1与vp2的特异性。
另外通过常规的结合性试验，得到适配体1的解离常数为13nm。
适配体2,3,4的解离常数分别为15nm，17nm和20nm。
实施例3.采用核酸适配体板检测血清中的ev71病毒
取80ul含有ev71病毒的血清；与结合缓冲液等体积混合后加入到核酸适配体板，200ul每孔，37℃孵育2小时；洗涤液洗涤后，加入hrp修饰的ev71病毒vp2蛋白抗体，37℃孵育1小时；洗涤液洗涤后，加入显色液a+b，显色5分钟；设置对照。
显色后检测450nm下的光吸收值。计算核酸适配体板的相对吸光强度。结果表明，核酸适配体1可以检测血清中的靶标病毒。通过pcr检验病毒滴度，发现采用适配体检测的效果强于pcr检测的方法。
实施例4.elisa检测生物素标记的适配体1特异识别vp2蛋白
一定量的vp2蛋白融于碳酸盐缓冲液中，按照100μl/孔加入到酶联条中，4℃包被蛋白过夜；
弃包被液，每孔加入100μl含1％casein蛋白的马来酸封闭液，室温封闭60min；
将经过处理后的生物素标记的适配体1，2，3，4加入酶联条中，使核酸序列与包被的蛋白共同孵育37℃2h；
弃去孔内液体，每孔用350μl的洗涤液洗涤，重复洗涤3次，最后一次洗涤后要把孔内液体完全甩干；
每孔加入100μl按照1∶100稀释好的hrp酶，室温孵育30min，弃去孔内液体，洗板5次，方法同上；
每孔加入100μltmb显色底物，37℃避光显色，当有明显颜色变化时，加10μl终止液，酶标仪读数。
elisa的实验结果也证明，适配体1可以与vp2蛋白结合，而不能与vp1结合，而2,3,4不能与vp2蛋白结合，而可以与vp1结合。
实施例5.稳定性试验
将核酸适配体1分别置于常温的血清中，4周后，通过pcr检测其残留量，发现仍然有95％保持活性。活性检测发现，其活性基本没有变化。说明该适配体具有较好的稳定性。
序列表
<110>邵玉芹
<120>一种能特异性检测ev71病毒的适配体及试剂盒
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>85
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
atgccgacggcatgcgctacgtgcatgcacatgtaccgttacctcacaatgggcctgggc60
tgctaccctaacttaccagcgtgta85
<210>2
<211>72
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
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<212>dna
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<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
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