本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种与癌细胞增殖调节有关的基因及其用途。
背景技术：
20世纪末启动的人类基因组计划被公认为是生命科学史上的里程碑。2003年，在纪念dna双螺旋结构发表50周年之际，由美、英、日、法、德和中国的科学家经过13年努力所绘制的人类基因组全序列图终于完成。人类进入了后基因组时代，研究的重点转向人类功能基因组学。只有了解人类基因组的结构和功能，发明人才能解释各种疾病的分子生物学机制。人类基因组由大约3.3×109个碱基对组成，含有3.0～3.5万个编码特定蛋白的基因。单个基因功能的发挥，对于整体基因组的功能是必要的。由单个基因突变引起的疾病在临床并不少见。因此，筛选和发现与疾病发生密切相关的基因，并对其功能进行研究，是当前基因组研究的重要方向。
恶性肿瘤是目前造成人类死亡的重要疾病。从肿瘤发病的机制来看，其发生、发展是多基因参与并调控的过程。迄今为止，多种与肿瘤发生发展密切相关的基因被发现，例如p53、pten、c-myc等。一些功能明确的基因，已被作为未来肿瘤基因治疗的候选靶基因。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种与癌细胞增殖调节有关的基因及其用途。
本发明的一方面提供一种与癌细胞增殖调节有关的基因，所述基因包含seqidno.1的核苷酸序列或由seqidno:1的核苷酸序列组成。
seqidno.1所示核苷酸序列全长980bp，编码蛋白由295个氨基酸(seqidno:2)组成，序列分别如下：
seqidno:1:
ctcgggatatgcagcagccatgcctgtgcacacgctgagccccggagccccgtccgcccccgccctaccttgccgcctgcggaccagggtccctggctacctgctacgggggccggcagatggtggagcccggaaaccgagcgctgtggagcgcctggaggccgacaaggccaagtacgtcaagagcctgcacgtggccaacacccgccaggagcctgtgcagcccctgctgtccaaacagccgctcttcagccctgagactcgccgcacagtgctcacgcccagccgccgagccctgcctggcccctgccgacggccccagctggacctggacatcctcagcagcctcatcgacttgtgtgacagccccgtgtcccctgccgaggccagccgcactcctggacgggccgagggagccggccgtcctcccccagccacccctccgcgaccgccgcccagtacctctgcggtccgccgggtggacgtccgccccctgcccgcctcgcctgcccggccctgcccatcacccggccctgccgccgcctccagcccagcccggccgccgggtttgcaacgctccaagtcggacttgagcgagcgcttttctagggcagccgctgatctcgagcgcttttttaacttctgcggcctggacccggaggaggcgagagggttgggtgtggcccacctggcacgggccagctcggatatcgtgtccctggcagggcccagtgctgggccgggcagctctgaagggggctgctcccgccgcagctcggtgactgttgaggagcgggcccgggagcgcgttccctatggcgtgtcggtggtggagcgcaatgcccgcgtgatcaagtggttgtatgggctaaggcaggctcgggagagcccagcagctgaaggctaggcgccactgggcctggaattcgccacaggacggatcttacagaggcaagtggtccctggacctctcttgcatc
seqidno:2:
mpvhtlspgapsapalpcrlrtrvpgyllrgpadggarkpsaverleadkakyvkslhvantrqepvqpllskqplfspetrrtvltpsrralpgpcrrpqldldilsslidlcdspvspaeasrtpgraegagrpppatpprpppstsavrrvdvrplpasparpcpspgpaaassparppglqrsksdlserfsraaadlerffnfcgldpeearglgvahlarassdivslagpsagpgsseggcsrrssvtveerarervpygvsvvernarvikwlyglrqarespaaeg
经生物信息学分析，结果显示：基因f10位于20号染色体，编码蛋白分子式为c1355h2217n429o408s7，分子量31270.5，理论等电点pi为10.46，脂肪簇指数72.85，总平均亲水性(gravy):-0.502，估计半衰期在体外人网织红细胞为30h，属不稳定蛋白。hum-mploc2.0软件分析结果显示：f10编码蛋白位于胞浆或中心体。loctree分析提示f10编码蛋白为dna结合蛋白。预测结果还显示f10蛋白不含锌指结构。对基因f10特征进行分析，结果显示基因f10无信号肽和跨膜螺旋，也没有特征性的蛋白结构域保守序列。但存在一些磷酸化位点(如ckl，ck2，pkal，pka2等)和一些蛋白质相互作用结构域(如sh3，tnkbm，traf2等)。
本发明的第二方面提供一种载体，该载体包含本发明第一方面所述的基因。
在本发明的实施方案中，所述载体为克隆载体或表达载体。
在本发明的实施方案中，所述载体还包含与所述基因可操作地连接的表达控制序列。在本发明的优选实施方案中，所述表达控制序列为启动子、增强子或终止子。
本发明的第三方面提供一种细胞，所述细胞包含本发明第一方面所述的基因或本发明第二方面所述的载体。
本发明第四方面提供一种能够特异性扩增权利要求1所述基因的引物对，所述引物对的序列分别如seqidno:3和seqidno:4所示。
本发明的第五方面提供一种组合物，包括本发明第四方面所述的引物对，以及本发明第一方面所述的基因或本发明第二方面所述的载体或本发明第三方面所述的细胞。
本发明的第六方面提供一种非诊断目的检测受试者的中本发明第一方面所述的基因的表达水平的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)获得所述受试者的样本；
(2)提取所述样本中的rna；
(3)利用本发明第四方面所述的引物对对步骤(2)获得的rna样本进行扩增。
在本发明的实施方案中，所述样本为肿瘤组织样本。
在本发明的实施方案中，所述rna为总rna。在本发明的具体实施方案中，所述rna为mrna；
本发明的第七方面提供本发明第一方面所述基因或本发明第二方面所述载体或本发明第三方面所述细胞在制备治疗癌症或妊娠滋养细胞疾病的药物中的用途。
在本发明的实施方案中，所述癌症为腺癌或鳞癌。
在本发明的具体实施方案中，所述腺癌选自子宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、结肠癌、前列腺癌中的一种或多种。
在本发明的具体实施方案中，所述鳞癌选自食道鳞癌、子宫鳞癌和皮肤鳞癌中的一种或多种。
在本发明的具体实施方案中，所述癌症为肺癌。
在本发明的实施方案中，所述妊娠滋养细胞疾病选自葡萄胎、侵蚀性葡萄胎、绒癌和胎盘部位滋养细胞肿瘤中的一种。
附图说明
图1示出了葡萄胎中f10表达，a：原位杂交染色，原放大倍数：×400；b：原位杂交染色，原放大倍数：×200；c：原位杂交染色，原放大倍数：×400。
图2示出了f10沉默对jeg-3绒癌细胞系凋亡的影响。
图3示出了f10沉默对jar绒癌细胞系凋亡的影响。
图4示出了f10沉默对bewo绒癌细胞系凋亡的影响。
图5示出了jeg-3细胞在裸鼠皮下肿瘤在体生长情况。
图6示出了jar细胞在裸鼠皮下肿瘤在体生长情况。
图7示出了bewo细胞在裸鼠皮下肿瘤在体生长情况。
图8示出了f10mrna在子宫颈、子宫内膜等正常组织及癌旁组织不表达，在卵巢腺癌、子宫内膜癌、乳腺癌、肝癌、胃癌等腺癌中阳性表达，食道鳞癌、宫颈鳞癌、皮肤鳞癌等鳞癌中亦呈强阳性表达(l.食道正常组织；2.食道不典型增生；3.结肠正常组织；4.胰腺正常组织：5.食道鳞状细胞癌；6.子宫鳞状细胞癌；7.皮肤鳞状细胞癌；8.结肠腺癌；9.直肠腺癌；10.前列腺腺癌；ll.子宫正常组织；12.结肠正常组织)。
图9示出了f10基因编码蛋白在子宫颈、子宫内膜等正常组织及癌旁组织不表达，在卵巢腺癌、子宫内膜癌、乳腺癌、肝癌、胃癌等腺癌中阳性表达，食道鳞癌、宫颈鳞癌、皮肤鳞癌等鳞癌中亦呈强阳性表达(l.食道正常组织；2.食道不典型增生；3.结肠正常组织；4.胰腺正常组织：5.食道鳞状细胞癌；6.子宫鳞状细胞癌；7.皮肤鳞状细胞癌；8.结肠腺癌；9.直肠腺癌；10.前列腺腺癌；ll.子宫正常组织；12.结肠正常组织)。
图10示出了f10基因过表达对a549细胞pcna和cyclind1表达的影响。
图11示出了利用rt-pcr检测f10在子宫颈癌组织和子宫颈癌癌旁组织及正常组织中的表达情况。
图12示出了利用rt-pcr检测f10在卵巢癌组织和卵巢癌癌旁组织及正常组织中的表达情况。
图13示出了利用免疫组织化学法检测f10在子宫颈癌组织和子宫颈癌癌旁组织及正常组织中的表达情况。
图14示出了利用免疫组织化学法检测f10在卵巢癌组织和卵巢癌癌旁组织及正常组织中的表达情况。
图15示出了利用rt-pcr检测f10在子宫内膜癌组织和子宫内膜癌癌旁组织及正常组织中的表达情况。
图16示出了利用免疫组织化学法检测f10在子宫内膜癌组织和子宫内膜癌癌旁组织及正常组织中的表达情况。
具体实施方式
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
实施例
以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。
除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。
实施例1基因f10的扩增
根据基因f10全长序列设计并合成引物，具体序列如下：
f10-1:5'-cgcggatccatgcctgtgcacacgctgagc-3'(seqidno:3)
f10-2:5'-cccaagcttctagccttcagctgctgggctctc-3'(seqidno:4)
用estaqdnapolymerase进行pcr反应，扩增目的片段。反应体系如下表所示：10×estaqbuffer5μl，dntp(2.5mmeach)4μl，mgcl2(25mm)3μl，cdna2μl，f10-1(10m)1μl，f10-2(10m)1μl，estaqdnapolymerase0.5μl，水33.5μl，共50μl。扩增条件：94℃10min预变性；94℃30s、55℃30s、72℃60s共30个循环；最后72℃延伸10min。
基因f10的cdna序列全长980bp(seqidno:1)，编码蛋白由295个氨基酸(seqidno:2))组成。经生物信息学分析，结果显示：基因f10位于20号染色体，编码蛋白分子式为c1355h2217n429o408s7，分子量31270.5，理论等电点pi为10.46，脂肪簇指数72.85，总平均亲水性(gravy):-0.502，估计半衰期在体外人网织红细胞为30h，属不稳定蛋白。hum-mploc2.0软件分析结果显示：f10编码蛋白位于胞浆或中心体。loctree分析表明f10编码蛋白为dna结合蛋白。预测结果还显示f10蛋白不含锌指结构。对基因f10特征进行分析，结果显示基因f10无信号肽和跨膜螺旋，也没有特征性的蛋白结构域保守序列。但存在一些磷酸化位点(如ckl，ck2，pkal，pka2等)和一些蛋白质相互作用结构域(如sh3，tnkbm，traf2等)。推测f10蛋白为非分泌蛋白，当ckl、pkal等途径激活后，sh2结构域可介导含磷酸酪氨酸分子的模体结合，sh3结构域可介导富含脯氨酸的模体的结合，从而激活下游的信号转导通路。
实施例2f10基因在不同滋养细胞组织中的表达
经原位杂交实验证实其在葡萄胎组织中呈高表达(图1)。
另外，荧光定量pcr实验的结果显示(表1)：f10在葡萄胎、侵蚀性葡萄胎、绒癌组织中全部呈阳性表达，且按上述顺序f10阳性表达强度依次递增，表明基因f10与滋养细胞的增殖调节和侵袭性有关。
表1f10在葡萄胎、侵蚀性葡萄胎及绒癌中细胞滋养细胞中的表达比较
χ2＝21.256，p＜0.001
实施例3基因f10表达水平对绒癌细胞凋亡的影响
发明人通过基因转染技术及rna干扰技术，分别建立和筛选出基因f10稳定过表达及沉默的绒癌细胞系，流式细胞仪检测基因f10干预后绒癌细胞系凋亡的变化，结果显示(图2、图3、图4)：基因f10沉默可显著增加jeg-3、jar和bewo三种绒癌细胞系的凋亡比率，f10过表达则降低三种绒癌细胞系的凋亡比率(表2)。
表2f10基因干预后3种绒癌细胞系的凋亡变化
用spf级裸鼠制作皮下种植肿瘤模型，观察皮下肿瘤的生长情况，比较基因f10过表达和基因沉默对绒癌细胞系成瘤性的影响。结果显示：基因f10可增强绒癌细胞在裸鼠体内的致瘤性，表明其与绒癌细胞的增殖调节有关(表3、表4、表5、图5、图6、图7)。
表3jeg-3细胞裸鼠皮下成瘤在体生长速度
f时间*组间＝16.011,p＝0.000f时间＝136.311，p＝0.000
f组间＝68.548,p＝0.000
表4jar细胞裸鼠皮下成瘤在体生长速度
f时间*组间＝8.133,p＝0.000f时间＝163.623，p＝0.000
f组间＝37.639,p＝0.000
表5bewo细胞裸鼠皮下成瘤在体生长速度
f时间*组间＝2.618,p＝0.093f时间＝114.995，p＝0.000
f组间＝16.869,p＝0.001
实施例4基因f10在其他癌细胞中的表达情况
发明人通过原位杂交方法进一步研究了f10在其他不同恶性肿瘤组织中的表达。结果发现：f10mrna在正常组织、癌旁组织不表达，在卵巢腺癌、子宫内膜癌、乳腺癌、肝癌、胃癌等腺癌中阳性表达(图8)。
在更大范围考察各种肿瘤中的基因f10表达情况，用体外转录方法制备mrna探针，实验用材料来自组织芯片(来源人，芯片批号cc00-0l-004、cc00-11-05)，所包括的材料主要有各种腺癌和鳞癌以及对应的正常组织，以验证前期结论。所获得的结果如下：食道鳞癌细胞、子宫鳞癌细胞和皮肤鳞癌细胞呈强阳性表达，间质组织中有散在的阳性表达细胞。结肠腺癌细胞、直肠腺癌细胞和前列腺腺癌细胞呈中等强度表达(图8)。
应用组织芯片的研究结果显示了基因f10编码蛋白在组织中的分布情况，结果显示：食道鳞癌细胞、子宫鳞癌细胞和皮肤鳞癌细胞呈强阳性表达，间质组织中有散在的阳性表达细胞。结肠腺癌细胞、胃腺癌细胞和前列腺腺癌细胞呈中等强度表达。基因f10在组织中的mrna和蛋白表达情况基本一致(图9)。根据基因f10在不同组织以及不同组织的病理情况下的表达分布情况，可以得出：f10在癌组织(包括鳞癌和腺癌)中均有阳性表达，说明f10是在多种癌组织普遍表达的细胞内蛋白，与肿瘤的发生发展密切相关。
构建基因f10的真核表达载体，转染重组prc-cmv2-f10质粒于肺癌细胞系a549，结果发现f10有促进细胞增殖的作用，并提高a549细胞株中pcna和cyclind1的表达水平(图10)，说明基因f10可通过上调pcna和cyclind1的表达促进细胞的生长增殖。
发明人的研究结果表明，f10与肿瘤的细胞增殖及浸润转移密切相关，并可以作为肿瘤基因治疗的靶基因。
实施例5f10基因在宫颈癌、卵巢癌临床标本中的表达
根据f10基因序列设计引物，采用逆转录荧光定量聚合酶链式反应(rt-pcr)检测30对子宫颈癌组织标本中f10基因表达，以第一对标本的癌旁组织为参考值，2-△△ct通过配对样本t检验分析，结果示子宫颈癌组织中的f10的平均表达量，显著大于子宫颈癌癌旁组织及正常组织中f10的平均表达量(p<0.05，图11)。应用rt-pcr检测20对卵巢癌组织标本中的f10基因表达，以第一对标本的癌旁组织为参考值，2-△△ct通过配对样本t检验分析，结果示卵巢癌组织中的f10的平均表达量显著大于卵巢癌癌旁组织及正常组织中f10的平均表达量(p<0.05，图12)。
另外，采用免疫组织化学法检测子宫颈癌、卵巢癌中f10基因表达蛋白的表达分布，结果显示：子宫颈癌组织中的f10的平均表达量显著大于子宫颈癌癌旁组织及正常组织中f10的平均表达量(p<0.05，图13)。卵巢癌组织中的f10的平均表达量显著大于卵巢癌癌旁组织及正常组织中f10的平均表达量(p<0.05，图14)。
实施例6：f10基因对绒癌细胞周期调节的影响
发明人选择已建立并筛选的f10基因沉默、稳定过表达绒癌细胞系jar，以未处理组绒癌细胞为对照组，采用cck8法绘制细胞生长曲线观察f10沉默及过表达对绒癌细胞生长的影响，同时使用流式细胞仪检测f10基因对细胞周期的影响，进一步通过western-blot检测绒癌细胞相关周期蛋白比如：cyclina2、cyclinb1、cyclinc、cyclind1、cycline、cdk1、cdk2、cdk3、cdk4、cdk5、cdk6、cdk7、cdk8、cdk9、p16、p21以及相关细胞周期调节因子：增殖细胞核抗原(pcna)、黏着斑激酶(fak)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶4(pak4)的表达水平差异，并用免疫荧光细胞化学技术定位及定量上述周期的蛋白的表达差异。
结果显示：
1.生长曲线反映三组细胞在第一天即开始出现增殖，均呈指数生长，f10过表达组增殖速度最快，未处理组次之，f10沉默组最慢，因此，f10基因的沉默减缓细胞生长速度，对绒癌细胞的增殖有抑制作用，而f10基因的过表达对绒癌细胞的生长有促进作用。
2.流式细胞仪检测结果显示，f10沉默组出现了明显凋亡峰，f10过表达组细胞的g2/m期细胞比例(41.37％)较f10沉默组(17.06％)升高2.4倍，未处理组(20.77％)较f10沉默组升高1.2倍，二组相比差异有显著性差异(p＜0.05)，说明f10沉默组、未处理组、f10过表达组的g2/m期细胞依次增多，说明3组细胞增殖周期依次加快。表明f10基因的沉默可能增加绒癌细胞的凋亡，而f10基因过表达有促进细胞增殖的作用。
3.绒癌细胞周期蛋白表达水平差异。
3.1细胞周期正性调节因子：westernblot检测结果示：与未处理对照组相比，f10基因沉默组cyclinb1、cyclind1、cycline、cdk3、cdk5、cdk6、cdk8、cdk9蛋白表达水平显著低于未处理对照组(p＜0.001)，f10过表达组cyclina2、b1、c、d1、e和cdk6、7、8、9蛋白表达水平显著增高(p＜0.001)；免疫荧光细胞技术检测结果示：与未处理对照组比较，f10基因沉默组cyclinb1、d1、e和cdk1、cdk3、cdk4、cdk5、cdk6、cdk8、cdk9蛋白表达水平显著低于未处理对照组(p＜0.05)，f10基因过表达组cyclinb1、d1、e和cdk1、cdk2、cdk4、cdk5、cdk6、cdk7、cdk8、cdk9蛋白表达水平显著高于未处理对照组(p＜0.05)。
3.2细胞周期负性调节因子：westernblot检测结果示：f10基因沉默组、未处理组及过表达组三组细胞p16蛋白表达阳性，且呈上升趋势，沉默组较未处理组、过表达组较未处理组均有统计学差异(p＜0.05)，免疫荧光细胞技术检测p16蛋白表达结果于westernblot检测结果一致。结合westernblot检测结果与免疫荧光细胞技术检测结果示三组细胞p21的蛋白表达差异并不显著。
3.3丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶4(pak4)：westernblot检测结果示f10基因沉默组pak4蛋白表达水平显著低于未处理对照组(p＜0.05)，f10基因过表达组pak4蛋白表达水平显著高于未处理对照组(p＜0.05)，与免疫荧光细胞技术检测结果一致。
3.4增殖细胞核抗原(pcna)：westernblot检测结果示三组细胞的增殖细胞核抗原pcna蛋白水平表达无差异，而免疫荧光细胞技术检测结果示：f10基因沉默组pcna达水平显著低于未处理对照组(p＜0.05)，f10基因过表达组pcna蛋白表达水平显著高于未处理对照组(p＜0.05)。
3.5黏着斑激酶(fak)：westernblot检测结果示f10基因沉默组及过表达组fak蛋白表达水平均显著高于未处理对照组(p＜0.05)，以f10沉默组与未处理组差异更明显，免疫荧光细胞技术检测fak蛋白表达结果示f10基因沉默组fak蛋白表达水平均显著高于未处理对照组(p＜0.05)；而f10过表达组与对照组间无明显差异。
3.6绒癌细胞中细胞周期蛋白调节因子的定位：在绒癌细胞中，cyclina2、d1和cdk7蛋白表达完全在肿瘤细胞核中；cycline、cdk1、cdk2、cdk6、cdk8、cdk9、p21蛋白主要表达在细胞核，少量在胞浆中；cyclinb1、c和cdk3、cdk4、cdk5、p16、pak4、fak蛋白主要定位于细胞质中，pcna在细胞核和细胞质中均有表达。
实施例7：f10基因在子宫内膜癌组织中的表达分析
发明人采用原位杂交方法，分别对6例子宫内膜腺癌、7例正常子宫内膜组织中f10mrna表达情况进行的检测，结果显示：f10mrna在子宫内膜癌中均呈阳性表达，阳性信号位于腺癌细胞的胞质中，多为中等强度阳性表达，呈蓝紫色。f10mrna在子宫内膜正常组织中的表达均为阴性。表明：新基因f10高表达与子宫内膜癌的发生密切相关。
根据f10基因序列设计引物，采用逆转录荧光定量聚合酶链式反应(rt-pcr)检测30对子宫内膜癌组织标本中的f10基因表达，以第一对标本的癌旁组织为参考值，2-△△ct通过配对样本t检验分析，结果示子宫内膜癌组织中的f10的平均表达量显著大于子宫内膜癌癌旁组织及正常组织中f10的平均表达量(p<0.05，图15)。另外，采用免疫组织化学法检测子宫内膜癌中f10基因编码蛋白的表达分布，结果显示：子宫内膜癌组织中的f10的平均表达量显著大于子宫内膜癌癌旁组织及正常组织中f10的平均表达量(p<0.05，图16)。
采用反义rna转染基因沉默技术，将人子宫内膜腺癌kle细胞系中的基因f10沉默，结果发现基因f10的沉默对kle细胞的增殖有明显的抑制作用，基因f10沉默的kle细胞凋亡率分别较对照组增加2.4倍(24h)和3.6倍(48h)。基因f10沉默的kle细胞克隆凋亡率较对照组增加近9倍，细胞色素cmrna表达上调、胞浆细胞色素c表达增加，bcl-2mrna和蛋白表达下调。表明基因f10沉默后，出现了bcl-2基因下调，使得其抑制细胞色素c从线粒体释放作用减弱，从而导致细胞色素c从线粒体的释放增加，最终促进了细胞的凋亡。
实施例8：f10基因对子宫内膜癌细胞系ishikawa和hec-1a细胞周期的调节
建立和采用基因转导技术，分别构建真核质粒表达载体及rnai慢病毒载体，设计并构建重组体和f10基因空载体，将重组体和空载体分别转染到ishikawa和hec-1a细胞系，经筛选及包装，获得f10基因稳定过表达及沉默及相应空载体转染细胞系。应用细胞免疫荧光技术定位及定量子宫内膜癌相关周期蛋白调节因子cyclind1、cycline、cdk2、cdk4、cdk6、p16、p21以及相关细胞周期调节因子：丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶4(pak4)、增殖细胞核抗原(pcna)及黏着斑激酶(fak)的表达差异。
结果显示：
1.细胞周期正性调节因子：细胞免疫荧光检测结果示：与未处理对照组相比，ishikawa和hec-1a细胞系中f10基因沉默组cyclind1、cycline、cdk4、cdk6、cdk8蛋白表达水平显著低于未处理对照组显著降低(p＜0.05)，f10过表达组cyclind1、e和cdk2、4、6蛋白表达水平显著增高(p＜0.001)。两类细胞的f10基因过表达空载体组、f10沉默基因空载体组及未处理组之间无显著差异(p＞0.05)。
2.细胞周期负性调节因子：细胞免疫荧光检测结果示：ishikawa和hec-1a细胞系中f10基因沉默组、未处理组及过表达组三组细胞p16蛋白表达阳性，且呈上升趋势，沉默组较未处理组、过表达组较未处理组均有统计学差异(p＜0.05)。两类细胞的f10基因过表达空载体组、f10沉默基因空载体组及未处理组之间无显著差异(p＞0.05)。ishikawa和hec-1a细胞系中f10基因沉默组、未处理组及过表达组三组细胞p21蛋白表达阳性，且呈下降趋势，沉默组较未处理组、过表达组较未处理组均有统计学差异(p＜0.05)。两类细胞的f10基因过表达空载体组、f10沉默基因空载体组及未处理组之间无显著差异(p＞0.05)。
3.丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶4(pak4)：免疫荧光细胞技术检测结果示ishikawa和hec-1a细胞系f10基因沉默组pak4蛋白表达水平显著低于未处理对照组(p＜0.05)，f10基因过表达组pak4蛋白表达水平显著高于未处理对照组(p＜0.05)。两类细胞的f10基因过表达空载体组、f10沉默基因空载体组及未处理组之间无显著差异(p＞0.05)。
4.增殖细胞核抗原(pcna)：ishikawa和hec-1a细胞系中f10基因沉默组、未处理组及过表达组三组细胞pcna蛋白表达阳性，且呈上升趋势，沉默组较未处理组、过表达组较未处理组均有统计学差异(p＜0.05)。两类细胞的f10基因过表达空载体组、f10沉默基因空载体组及未处理组之间无显著差异(p＞0.05)。
5.黏着斑激酶(fak)：免疫荧光细胞技术检测结果示ishikawa和hec-1a细胞系中f10基因沉默组、未处理组及过表达组三组细胞fak蛋白表达阳性，且呈上升趋势，沉默组较未处理组、过表达组较未处理组均有统计学差异(p＜0.05)。两类细胞的f10基因过表达空载体组、f10沉默基因空载体组及未处理组之间无显著差异(p＞0.05)。
实施例9：基因f10参与人肺癌细胞系a549增殖和凋亡的调节
发明人选取bel7402(人肝癌细胞学)、hic(人小肠癌细胞系)、hepg2(人肝癌细胞系)、pc-3(人前列腺癌细胞系)、a549(人肺腺癌细胞系)、mgc(人胃癌细胞系)、16hbe(人支气管上皮细胞系)、293(人肾上皮细胞系)八种细胞，利用细胞免疫组化技术和荧光定量pcr技术筛选出f10低表达的细胞株，结果表明：新基因f10在人的8种细胞中呈不同程度的表达。其中f10基因在mgc、pc、bel7402中高表达，在hepg2、hic中表达次之，在293中表达量较低，在16hbe、a549中表达量最低。
以pegfp-n1为真核表达载体，设计并构建出pegfp-n1-f10重组质粒，将pegfp-n1-f10质粒转染a549细胞，成功构建稳定过表达f10基因的a549细胞系。利用mtt检测细胞体外增殖能力，发现从基因转染12h开始，f10基因过表达组a549细胞较阴性对照组和空白对照组生长增快，表明f10基因促进a549细胞增殖。同时，采用tunel-fitc/hoechst33258染色检测细胞凋亡，发现阴性对照组和空白对照组a549细胞中出现凋亡现象的细胞均明显较f10基因过表达组多，表明f10基因过表达抑制a549细胞凋亡。
采用rt-pcr和westernblot检测技术，发明人发现f10基因过表达组a549细胞中bax和caspase-3的mrna和蛋白表达均低于阴性对照组和空白对照组，表明f10基因下调a549细胞中caspase-3和bax表达，两者参与了对凋亡的调控，表明f10基因过表达抑制a549凋亡。
发明人还利用mtt和tunel-fitc/hoechst33258染色检测技术，发现经紫杉醇处理后，阴性对照组和空白对照组a549细胞均较f10基因过表达组细胞生长持续减慢，凋亡细胞增多，表明f10基因过表达抑制a549细胞对紫杉醇化疗的敏感性。采用rt-pcr和westernblot检测，发现经紫杉醇处理后，f10基因过表达组a549细胞中bax和caspase-3的mrna和蛋白表达均低于阴性对照组和空白对照组，表明f10基因下调紫杉醇处理后的a549细胞中caspase-3和bax表达，进而抑制其对紫杉醇的化疗敏感性。
将三组细胞接种裸鼠，成瘤率均为100％，但阴性对照组和空白对照组a549细胞的成瘤时间均较f10过表达的a549细胞显著延长，而两个对照组之间无显著性差异。大体观察f10过表达a549细胞成瘤体积较对照组体积明显增大。就生长速度而言，f10过表达的a549细胞组肿瘤在体生长速度显著快于对照组。切片显示，对照组成瘤组织中出现了较多的坏死细胞，而f10过表达组无此现象。免疫组化分析，两组对照组中细胞成瘤组织内bcl-2几乎无表达，而f10过表达组成瘤组织中则bcl-2表达较多，阳性细胞呈弥漫性分布。两对照组成瘤组织中bax和caspase-3表达均明显强于f10基因过表达组。
发明人还通过观察细胞体外增殖并利用流式细胞技术检测，进一步证明f10基因对细胞的增殖和细胞周期的影响。结果发现：f10基因过表达可促进a549细胞增殖；f10基因转染a549细胞48小时后，其中g2/m期细胞比例较对照组细胞升高1.2倍，s期升高2.1倍。利用免疫组化方法检测细胞中增殖核抗原(pcna)和细胞周期素d1(cyclind1)这二种在细胞周期中起关键作用的调节蛋白的表达变化，结果表明：f10基因的过表达使a549细胞中pcna和cyclindl表达上调。
发明人利用差异显示技术(dd-pcr)粗筛f10基因对a549细胞基因表达谱的影响，实验分四组：质粒prc-cmv2/f10+(f10表达载体)、prc-cmv2(空载体)、prc-cmv2/f10-(f10基因反向表达载体)瞬时转染a549细胞组及空白细胞对照组。结果显示：四组间基因差异显示的电泳条带扩增后测序获得annexini(钙依赖磷脂结合蛋白i)、ipla2(membraneassociatedcalciumindependentphospholipasea2，膜偶联非钙依赖的磷脂酶a2)、datfi(deathassociatetranscriptionfactor，死亡相关的转录因子)、stat1(信号转导子与转录激活子)、baspl(homosapiensbrainabundant，membraneattachedsignalprotein1，人类脑中含量丰富，膜粘附信号蛋白1)等5个基因。annexini、stat1、baspl在正向f10基因转染组高表达，datf1、ipla2在正向f10基因转染组表达量降低，以此表明f10可能参与促进细胞增殖、抑制细胞凋亡的过程，最终扰乱细胞正常生长代谢过程。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>南方医科大学南方医院
<120>一种与癌细胞增殖调节有关的基因及其用途
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