本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及一种植物柱头外露控制基因及其编码蛋白与应用。
背景技术：
花是被子植物特有的生殖器官，花器官的正常发育直接关系到物种的繁衍，同时还会影响到开花作物的产量、品质、使用价值和经济效益。此外，花的大小、形态结构、组成器官的数目和颜色等是系统与进化植物学研究中最常用的形态学性状，花器官发育的研究对物种起源和演化研究同样具有重要的指导意义。
蝶形花亚科(faboideae；papilionoideae)是豆科三个亚科志气，大约有600属，一万余种，广泛分布于全世界，是人类食物和油料以及牧草、绿肥、和木材等的重要来源。蝶形花亚科植物的花器官多是典型的两侧对称，花冠呈蝶形。由大小、形状不同的5片花瓣组成，其中较大而不成对的一瓣为旗瓣；旗瓣下面两侧各有一瓣成翼状，称为翼瓣；翼瓣内侧另有一对花瓣，融合为舟状，包在雌蕊和雄蕊群外面，称为龙骨瓣。由于蝶形花具有不同于拟南芥的辐射对称花的独特形态构造和发育特性，一直倍受生物学家的关注，开展蝶形花亚科植物特异性花器官发育的遗传机理解析对于阐明高等植物花器官发育的分子机理调控具有重要的理论价值。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供了一种植物柱头外露控制基因及其编码蛋白与应用。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种植物柱头外露控制基因，所述基因为如下(b1)-(b4)中任一所述的dna分子：
(b1)编码区如seqidno.1所示的dna分子；
(b2)seqidno.3所示的dna分子；
(b3)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的dna序列杂交且编码权利要求1所述蛋白质的dna分子；
(b4)来源于蒺藜苜蓿并且与(b1)或(b2)或(b3)限定的dna序列具有90％以上同源性的dna分子。
本发明还公开了一种上述基因编码的蛋白质。
可选地，是如下(a1)或(a2)：
(a1)由seqidno.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(a2)将seqidno.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与具有相同功能的由seqidno.2衍生的蛋白质。
本发明还公开了一种上述基因或蛋白质在调控植物中调控花发育的应用。
本发明还公开了一种控制植物柱头外露及花瓣融合的方法，包括如下步骤：抑制目的植物中上述述基因的活性和/或上述蛋白质表达量，得到柱头外露及花瓣融合的转基因植物。
本发明还公开了一种上述的基因、蛋白质或方法在植物育种中的应用。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
本发明从蒺藜苜蓿中克隆出cabl基因，成功构建植物互补载体，采用农杆菌介导的叶盘法转化蒺藜苜蓿大花苞突变体cabl，与对照相比，转入cabl基因的柱头外露蒺藜苜蓿的花变成正常野生型的花。本发明公开的内容可为研究该基因在植物中调控花发育打下基础。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明蒺藜苜蓿r108野生型花和蒺藜苜蓿cabl柱头外露突变体花表型图；其中，a-d为野生型不同花发育时期花的表型图；f-h为cabl突变体花发育不同时期花表型图；d-e野生型花授粉完成后形成正常果荚；i-jcabl突变体由于花瓣融合，导致雄蕊被包裹，不能完成正常授粉，最后不能形成正常的果荚；k，l野生型r108旗瓣背面和腹面图；m，n野生型r108翼瓣龙骨瓣融合的背面和腹面图；o野生型的雄蕊；p，q突变体cabl融合的旗瓣背面和腹面图；r，s突变体cabl融合的翼瓣龙骨瓣背面和腹面图；
图2是本发明cabl突变体柱头育性分析；
图3是本发明cabl突变体中cabl表达量检测；
图4是本发明互补植株的表型及cabl表达量检测，其中，a代表野生型r108的表型，b代表突变体cabl表型，c代表突变体背景下转入互补载体的转基因苗，花恢复为野生型表型，d代表突变体和互补载体的转基因植株中cabl基因表达量检测。
具体实施方式
以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
蒺藜苜蓿r108(野生型)：thenobelfoundation。
cabl突变体：thenobelfoundation。
pearlygate203质粒：由实验室保存，购自invitrogen；
pentr/d-topocloningkit(invitrogen)：k240020
农杆菌gv3101：waryonggt707(北京华越洋公司)
yep固体培养基：蛋白胨10g、酵母提取物10g、氯化钠5g、琼脂粉10g，蒸馏水定容至1l。
yep液体培养基：蛋白胨10g、酵母提取物10g、氯化钠5g，蒸馏水定容至1l。
愈伤诱导液体培养基(ph5.8)：大量元素母液100ml、微量元素母液1ml、有机元素母液1ml、铁盐母液140mg、肌醇100mg、蔗糖30g、生长素4mg、细胞分裂素0.5mg、头孢200mg、特美汀250mg、草胺磷2mg，定容至1l。
愈伤诱导固体培养基(ph5.8)：大量元素母液100ml、微量元素母液1ml、有机元素母液1ml、铁盐母液140mg、肌醇100mg、蔗糖30g、生长素4mg、细胞分裂素0.5mg、头孢200mg、特美汀250mg、草胺磷2mg、phytagel3.2g，定容至1l。
分化培养基(ph5.8)：大量元素母液100ml、微量元素母液1ml、有机元素母液1ml、铁盐母液140mg、肌醇100mg、蔗糖20g、头孢200mg、特美汀250mg、草胺磷2mg、phytagel3.2g，定容至1l。
生根培养基(ph5.8)：murashige&skoogbasalmediumwithvitamins2.215g/l(公司：phytotechnologylaboratories，货号：16b0519138a)
铁盐母液：乙二胺四乙酸二钠37.3mg、七水合硫酸亚铁27.8mg。
大量元素母液：七水合硫酸镁1.85g、硝酸钾28.3g、硫酸铵4.63g、二水合氯化钙1.66g、磷酸二氢钾4g，蒸馏水定容至1l。
微量元素母液：一水合硫酸锰1g、硼酸500mg、七水合硫酸锌100mg、碘化钾100mg、二水合钼酸纳10mg、五水合硫酸铜20mg、六水合氯化钴10mg，蒸馏水定容至1l。
有机元素母液：烟酸500mg、盐酸硫胺素500mg、盐酸吡哆醇500mg，蒸馏水定容至1l。
实施例1、cabl及其编码基因cabl的发现：
通过筛选蒺藜苜蓿tnt1插入突变体库，获得了一个柱头外露，花瓣融合的突变体，命名为cabbage-like(cabl)。
cabl突变体和蒺藜苜蓿r108(野生型)的花表型观察结果见图1；通过表型观察发现，突变体在花发育的各个时期表现出比野生型r108花苞增大的表型，柱头外露。由于花瓣融合卷曲，雄蕊不能正常授粉，生成正常的果实。进一步解剖发现，突变体cabl各个花瓣与野生型相比，出现明显的卷曲，融合。由于花瓣包裹作用，雄蕊不能正常包裹柱头，同时，在雄蕊上，产生花粉的数量与野生型相比，明显减少。
二、突变体的育性分析
由于突变体柱头外露，为了研究突变体柱头的育性，对突变体进行了杂交，如图2所示：a为选取生长状态一直的cabl花苞，给其中一朵授予野生型花粉；b4天后，授粉的花苞开始长出果荚螺旋的结构，未授予花粉的花苞干枯；c15天后，授粉的花苞长成与野生型相同的正常果荚，未授粉的花苞凋落，死亡。说明cabl突变体的柱头仍具有生物学活性。为植物杂交提供便利。
三、cabl及其编码基因的获得
1、提取蒺藜苜蓿r108(野生型)完全开放的花的总rna，并反转录为cdna。
2、以步骤1得到的cdna为模板，采用引物cabl-f和引物cabl-r组成的引物对进行扩增，得到pcr扩增产物。
cabl-f：5’-caccatggagatagaacaaagttacaaa-3’，其核苷酸序列如seqidno.4所示；
cabl-r：5’-attcctactttgattagaaatgta-3’，其核苷酸序列如seqidno.5所示。
3、将步骤2得到的pcr扩增产物进行测序，得到目标基因的编码区序列，如序列表的seqidno.1所示，编码序列表的seqidno.2所示的蛋白质。将序列表的seqidno.2所示的蛋白质命名为cabl，由697个氨基酸残基组成。将cabl的编码基因命名为cabl基因。将基因的cds(seqidno.1)在苜蓿网站(http://blast.jcvi.org/medicago-blast/)进行比对，得到cabl基因的基因组序列，如seqidno.3所示。
四、cabl与柱头外露表型连锁关系确认
通过筛选蒺藜苜蓿tnt1插入突变体库，获得了cabl的另外一个插入突变体和cabl-2(nf3589)将之前的nf2856命名为cabl-1。其中cabl-2出现与cabl-1完全相同的表型。rt-pcr检测在cabl-1cabl-2中cabl基因表达缺失如图3显示。
实施例2、cabl基因的功能验证
一、互补表达载体的构建
将上述扩增得到的列表的序列1pcr片段回收后，连接到pentr/d-topo克隆载体，测序正确后。利用hpa1将载体线性化后回收，然后通过lr反应连接到最终载体pearlygate203上，得到重组质粒p35spro::cabl(已经测序验证)。
二、互补突变体植株的获得
1、将步骤一制备的重组质粒p35spro::cabl转化农杆菌gv3101，得到重组菌gv3101/p35spro::cabl。
2、将步骤1得到的重组菌gv3101/p35spro::cabl接种于含有50mg/ml的利福平抗生素和50mg/ml的卡那抗生素的yep固体培养基上，28℃培养至长出单菌落，挑取单菌落至yep液体培养基中，28℃、200rpm振荡培养过夜。
3、完成步骤2后，取500μl菌液接种于5mlyep液体培养基中，再加入5μl100mg/ml的乙酰丁香酮，28℃、200rpm振荡培养至od600nm＝0.8，3800rpm离心菌液15min收集菌体。
4、采用含有100mg/l的乙酰丁香酮的sh3a液体培养基重悬步骤3得到的菌体，调菌液od600nm＝0.2，得到侵染液。
5、取生长4周左右wf1突变体第一片复叶，用75％乙醇洗约10s，再用5％次氯酸钠消毒5min，在超净台用无菌水至少洗5次，切割叶片后放到步骤4得到的侵染液中，侵染15min。
6、完成步骤5后，将侵染后的叶片转移到sh3a固体培养基上，培养四周至出现白色胚性愈伤组织(两周更换一次培养基)。
7、完成步骤6后，将白色胚性愈伤组织转移到分化培养基上，培养四周至分化出绿色胚状体(两周更换一次培养基)。
8、完成步骤7后，将绿色胚状体转移到生根培养基上，两周更换一次培养基，生根长叶后移至蛭石中，直至成苗，得到互补突变体植株。
三、互补突变体植株的表型
1、观察互补植株的花表型(3个互补植株表型均相同)。结果如图4a-图4c所示。结果表明，与突变体相比，互补突变体植株的花由柱头外露表型变为野生型正常花，互补3个line植株中cabl基因表达量明显升高。
2、提取突变体和互补植株的rna，利用qrt-pcr检测cabl表达变化，同样发现相比突变体，3株互补植株cabl表达明显升高。进一步证明cabl基因为柱头外露，花瓣融合的控制基因。
其中，qrt-pcr检测所用到的引物如下所示：
cablqpcr-f：5’-accaggctatttcactgctc-3’，其核苷酸序列如seqidno.6所示；
cablqpcr-r：5’-acttttctttgcgaccattgag-3’，其核苷酸序列如seqidno.7所示。
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。
序列表
<110>中国农业科学院生物技术研究所
<120>一种植物柱头外露控制基因及其编码蛋白与应用
<130>2018
<160>7
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>2094
<212>dna
<213>蒺藜苜蓿(medicagotruncatula)
<400>1
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<211>697
<212>prt
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