本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种玉蜀黍黑粉菌单倍体菌株um02，还涉及该菌株的用途。
背景技术：
：玉米瘤黑粉病(或称玉米黑粉病)是由玉蜀黍黑粉菌(ustilagomaydis，或称为玉米黑粉菌、玉米瘤黑粉菌等)引起的玉米病害，主要发生于温暖干燥地区，且春播区比夏播区发病严重，一般发病率为5～10％，严重的可造成30～80％的产量损失，是一个亟待解决的问题。除了给玉米造成危害以外，玉蜀黍黑粉菌感染玉米果穗后在果穗上形成的菌瘿还是一种美味食品，墨西哥的阿兹特克人食用它已有600多年的历史，被称为“墨西哥松露”，在我国称为玉米蘑菇、玉米乌霉、玉米瘤黑粉菌、玉米黑霉、棒子包、稔头、乌米或黑胆等。玉米蘑菇既可生食、亦可炒菜吃，味道非常鲜美。除了具有食用价值外，它还有极高的药用价值，经常食用能益气养阴，补气安神，补中解毒，可预防和治疗肝脏系统和胃肠道溃疡，并能助消化和通便；也可用于血虚或津液不足，口干舌燥，或热病气阴两伤，烦倦口渴、心神不安、失眠多梦者；还可用于脾胃虚弱、倦怠食少、脘腹作痛或食物、药物中毒等病症。此外，玉米蘑菇的蛋白质含量在所有蘑菇家族中属于最高的之一，比玉米本身的蛋白质含量更高，尤其人体必需的赖氨酸含量非常高。因此，玉米蘑菇是一种极具市场开发潜力的食用菌资源。目前，美国已将玉米蘑菇列入食用菌行列。我国农民虽然也有吃玉米蘑菇的传统，但是还没有进行大规模生产，仅限于田间零星的自然发病的玉米蘑菇。无论是玉米品种的抗玉米瘤黑粉病鉴定，还是玉米蘑菇的生产，都需要进行玉蜀黍黑粉菌的接种。专利《一种玉米蘑菇生产方法及产品》(cn10540409593a)公开了将混有玉米黑粉菌厚垣孢子或担孢子的水溶液注射到玉米果穗顶端进行接种生产玉米蘑菇的方法，此方法虽然操作简单，但由于厚垣孢子中很容易混入其他致病菌且不易发现，所以用玉米黑粉菌厚垣孢子水溶液直接接种，经常会使整个玉米植株腐烂导致试验失败；其次，由于玉蜀黍黑粉菌属于异宗结合方式进行繁殖，必须将两种性亲和的担孢子混合并一起接种到植株体内才能成功，而现有方法是直接将厚垣孢子萌发后的担孢子混合物制成接种液进行接种，这样的混合物随机性强，并不一定能保证接种液中包含两种性亲和的单倍体菌株，从而导致人工接菌的结果存在很大不确定性，试验的准确性、一致性和重复性都很差。因此，选择性亲和的玉蜀黍黑粉菌单倍体菌株是成功进行人工接种的前提。技术实现要素：本发明目的在于提供一种玉蜀黍黑粉菌单倍体菌株，该单倍体菌株在与其性亲和的其他单倍体菌株结合后具有较强的致病性，可用于玉米瘤黑粉病抗性接种鉴定和玉米蘑菇生产。本发明第二目的在于提供上述玉蜀黍黑粉菌单倍体菌株接种母液的制备方法。本发明第三目的在于提供一种玉蜀黍黑粉菌接种液。本发明第四目的在于提供上述玉蜀黍黑粉菌单倍体菌株在玉米瘤黑粉病抗性鉴定上的用途。本发明第五目的在于提供上述玉蜀黍黑粉菌单倍体菌株在玉米蘑菇生产上的用途。本发明第六目的在于提供上述接种液在玉米瘤黑粉病抗性鉴定上的用途。本发明第七目的在于提供上述接种液在玉米蘑菇生产上的用途本发明通过以下技术方案实现：本发明提供一种玉蜀黍黑粉菌(ustilagomaydis)单倍体菌株um02，其保藏编号为cgmccno.15387。本发明还提供了上述玉蜀黍黑粉菌单倍体菌株接种母液的制备方法，包括如下步骤：(1)将低温保存的um02菌株接种在pda平板培养基上，在25℃～28℃、黑暗条件下培养1～2天，得到活化菌株；(2)用接种针挑取步骤(1)中所得的活化菌株，然后均匀涂布在pda平板培养基上，在25℃～28℃、黑暗条件下培养3～5天，得到接种用菌体；(3)单倍体菌株接种母液的配制：用灭菌载玻片将步骤(2)所得菌体从pda平板培养基上全部刮下，并按照1个培养皿平板上(培养皿直径为9cm)的菌体用1l灭菌水的比例进行稀释，即得单倍体菌株um02的接种母液。上述制备方法步骤(1)或(2)中所述的pda平板培养基的组成成分及其重量比为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000ml。所述pda平板培养基按照常规方法制备，即将马铃薯200g去皮后切成小块，放入800ml蒸馏水中煮沸20min，4层纱布过滤后,按照比例加入葡萄糖20g和琼脂20g，煮沸后定容至1000ml，121℃灭菌20min。上述玉蜀黍黑粉菌(ustilagomaydis)单倍体菌株um02在玉米瘤黑粉病抗性鉴定上的应用。上述玉蜀黍黑粉菌(ustilagomaydis)单倍体菌株um02在玉米蘑菇生产上的应用。一种玉蜀黍黑粉菌接种液，所述接种液中含有上述玉蜀黍黑粉菌(ustilagomaydis)单倍体菌株um02和与其性亲和的另一玉蜀黍黑粉菌单倍体菌株。上述接种液中所述的另一种玉蜀黍黑粉菌单倍体菌株的交配型为mfa2。所述的接种液中单倍体菌株um02的接种母液和与其性亲和的另一单倍体菌株的接种母液之间的体积比比例为1：1。上述接种液中还含有体积百分比为0.01％的吐温20。上述接种液中所述的单倍体菌株um02的担孢子数为1×105-1×106个/ml。上述接种液的制备方法：在使用前，按照1：1的体积比将步骤(3)所得单倍体菌株um02的接种母液与其性亲和的另一玉蜀黍黑粉菌单倍体菌株的接种母液等比例混合，并按照体积百分比为0.01％的比例加入吐温20，即为玉蜀黍黑粉菌接种液。上述接种液使用时注意要将菌体充分混匀或进行过滤，否则在接种时容易造成连续注射器堵塞。上述接种液在玉米瘤黑粉病抗性鉴定上的应用。上述接种液在玉米蘑菇生产上的应用。本发明具有的优点和有益效果：(1)用本发明玉蜀黍黑粉菌单倍体菌株um02与性亲和的交配型为mfa2的单倍体菌株混合所得的接种液接种玉米，其致病性强，接种成功率高，在高感玉蜀黍黑粉病的玉米品种伟科966上接种成功率可达80％，可用于玉米品种的玉米瘤黑粉病抗性鉴定，以及玉米蘑菇的生产；(2)用含有本发明单倍体菌株um02的接种液进行玉米瘤黑粉病抗病性鉴定试验，其试验结果准确、稳定可靠，重复性和一致性好；(3)用含本发明单倍体菌株um02的接种液生产的玉米蘑菇单体重，产量高，且便于采收和运输；(4)以本发明单倍体菌株um02作为基因工程改造的出发菌株，可用于玉米瘤黑粉菌的改良，如提高玉米瘤黑粉菌中多糖、花青素等对人体有益成分的含量等。生物保藏本发明玉蜀黍黑粉菌(ustilagomaydis)单倍体菌株um02，由本发明的发明人自行筛选得到，已于2018年2月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为：cgmccno.15387。附图说明图1.单倍体菌株筛选和交配型的鉴定电泳图谱；其中1号、2号、4号、5号、9号和10号为未成功单孢分离的单倍体混合菌株，3号、6号、7号、8号、11号为单倍体菌株；其中3号和11号单倍体菌株的交配型为mfa1；6号、7号和8号单倍体菌株的交配型为mfa2。图2.玉蜀黍黑粉菌单倍体菌株um02的交配型检测；其中1-3为玉蜀黍黑粉菌单倍体菌株um02；4为未经单孢分离的厚垣孢子萌发分离物；5为空白对照。图3.玉蜀黍黑粉菌单倍体菌株um02的系统发育树图。具体实施方式以下通过实施例对本发明作进一步的解释和说明，但是不对本发明保护范围构成任何限制。如无特别说明，以下实施例中所述的方法均为常规方法，所述的化学药剂均可通过商业渠道购买。实施例1本发明玉蜀黍黑粉菌单倍体菌株的分离筛选和鉴定按照如下方法进行:(1)收集冬孢子并制备冬孢子悬液：2016年12月在海南采集自然风干的玉米瘤黑粉菌瘿，从玉米瘤黑粉菌瘿上直接挑取少量的冬孢子置于灭菌的2ml离心管中，然后加入重量百分比为1％的次氯酸钠溶液1ml，颠倒混匀2min，12000rpm下离心1min，去上清，加入灭菌水将沉淀清洗3遍，最后用无菌水将沉淀稀释，即得冬孢子悬液，其终浓度为为103个孢子/ml。(2)冬孢子培养：取步骤(1)所得的冬孢子悬液200μl涂布于pda培养基上，在25℃下培养2天，即可观察到肉眼可见的细小菌落。(3)单孢分离培养：用灭菌牙签挑取单个肉眼可见的单菌落至1ml灭菌水中，用涡旋振荡器震荡混匀，取200μl均匀涂布于pda平板培养基上，在25℃培养2天，长出的单菌落即为待筛选和鉴定的担孢子菌落。(4)单倍体菌株的鉴定：通常玉蜀黍黑粉菌中控制遗传交配的a位点共有2种交配型mfa1和mfa2。一个单倍体菌株只可能存在一种mfa基因，而两个性亲和的单倍体菌株中mfa基因必然不同。因此设计特异性引物用于检验分离得到的单倍体的交配型并判断其彼此的亲和性。以步骤(3)所得的待鉴定担孢子的dna为模板，以下述umfa1f、umfa1r、umfa2f和umfa2r引物进行pcr扩增，所述的引物序列为：umfa1f：5'-cctgggaggttgacaaagaa-3'，umfa1r：5'-ccttgagacaagcgaagtcc-3'；umfa2f：5'-ccaaccacacaccctcttct-3'，umfa2r：5'-ctgcaattgctctggaaaca-3'。以umfa1f和umfa1r为引物进行pcr扩增，所得扩增产物大小为549bp，以umfa2f和umfa2r为引物进行pcr扩增所得扩增产物大小为637bp；pcr的反应体系(25μl)为：umfa1f(10μmol/l)0.5μl，umfa1r(10μmol/l)0.5μl，umfa2f(10μmol/l)0.5μl，umfa2r(10μmol/l)0.5μl，estaqmastermix(康为世纪)12.5μl，dna模板2μl，加ddh2o至25μl。所述的pcr反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性40s，50℃退火40s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min。结果(见图1)所获得的11个待鉴定菌株中，3号、6号、7号、8号和11号菌株仅扩增出一条带，说明是单倍体菌株，予以保留；其中3号和11号菌株的扩增产物大小为500bp左右，其交配型为mfa1；6号、7号和8号菌株的扩增产物大小为600bp左右，其交配型为mfa2；其余的1、2、4、5、9和10为未成功单孢分离的单倍体混合菌，予以淘汰。按照步骤(4)所述的方法对3号菌株进行pcr扩增，结果(见图2)仅扩增出一条500bp左右的dna片段，再次证明其为单倍体菌株，其交配型为mfa1，将该单倍体菌株命名为um02。实施例2本发明单倍体菌株um02的分类鉴定(一)该菌株的形态特征：该菌株的孢子呈短棒状，无隔膜，长度15-25μm。(二)该菌株的培养特性：在pda平板培养基上，菌落呈乳白色，表面有褶皱，较湿润，类似酵母菌菌落，但挑取时比细菌和酵母菌的菌落更粘稠。(三)本发明单倍体菌株um02的分子鉴定：以um02菌株的基因组dna为模板，使用真菌通用引物its1和its4对真菌基因组its区段进行pcr扩增，所述引物序列为：its1：5’-tccgtaggtgaacctgcgg-3’；its4：5’-tcctccgcttattgatatgc-3’。所述的pcr反应体系(25μl)，其中：its1(10μmol/l)0.5μl，its4(10μmol/l)0.5μl，estaqmastermix(康为世纪)12.5μl，模板2μl，加ddh2o至25μl。所述的pcr反应程序：95℃预变性5min，95℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。取5μl扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，在紫外透射仪下检测pcr产物大小，将pcr扩增产物直接送交生物工程(上海)股份有限公司测序，得到菌株um02的its序列(seqidno.1)。将测序结果在ncbi网站上进行blast比对，结果本发明单倍体菌株um02与玉蜀黍黑粉菌的序列同源性达到99％，同时利用mega5.2软件构建系统发育树，结果um02(见图3)与玉蜀黍黑粉菌聚合到一起，说明菌株um02属于玉蜀黍黑粉菌(ustilagomaydis)。综合以上分析结果可知，本发明单倍体菌株um02属于玉蜀黍黑粉菌(ustilagomaydis)，且和现有的玉蜀黍黑粉菌菌株不同，是一种新的玉蜀黍黑粉菌单倍体菌株。实施例3本发明单倍体菌株um02接种母液的制备按照如下方法进行:(1)菌种活化：将低温保存的um02菌株接种在pda平板培养基(其制备方法为：将马铃薯200g去皮后切成小块，放入800ml蒸馏水中煮沸20min，4层纱布过滤后,加入葡萄糖20g和琼脂20g，煮沸后定容至1000ml，121℃灭菌20min)上，在25℃、黑暗条件下培养1天，得到活化菌株。(2)菌体制备：用接种针挑取适量步骤(1)中所得的um02活化菌株均匀涂布在pda平板培养基上，在25℃、黑暗条件下培养3天，得到um02菌体。(3)接种母液的制备：用灭菌载玻片将步骤(2)所得菌体从pda平板培养基上全部刮下并按照1培养皿(培养皿直径为9cm)平板上的菌体用1l灭菌水的比例进行稀释，配制成单倍体菌株um02的接种母液。此时得到的单倍体菌株um02的接种母液中担孢子数为1×105-1×106个/ml。实施例4：含有单倍体菌株um02的接种液的接种发病试验(1)按照实施例3所述的方法分别制备实施例1中所选的6号、7号和8号单倍体菌株的接种母液。(2)使用时，将实施例3制备的单倍体菌株um02的接种母液分别与其性亲和的6号、7号和8号单倍体菌株的接种母液分别按照1：1的体积比等比例混合，并按照体积百分比为0.01％的比例加入吐温20，混合均匀，分别制得um02与8号单倍体菌株混合的接种液i，um02与7号单倍体菌株混合的接种液ii，um02与6号单倍体菌株混合的接种液iii。注意要将菌体充分混匀或进行过滤，否则在接种时容易造成连续注射器堵塞。(3)于2017年3月30日在河北省农林科学院植物保护研究所的试验温室中，在花盆中播种高感瘤黑粉病的玉米品种伟科966，每个处理播种60株，定期对幼苗进行浇水。待玉米6～7叶期时，用连续注射器将步骤(2)中所制备的接种液i、接种液ii或接种液ii从幼苗茎侧方向刺入进行接种，接种量为2ml，接种后20天调查发病率。结果(见表1)本发明单倍体菌株um02与性亲和的6号、7号或8号单倍体菌株组合接种后玉米瘤黑粉病发病率分别26.3％、80.0％和66.7％，说明本发明玉蜀黍黑粉菌单倍体菌株um02(3号菌株)能与交配型相配(交配型为mfa2)的不同单倍体菌株组合接种后都能发病，而且接种成功率(或发病率)都较高；其次，um02与不同单倍体菌株的组合之间发病率差异很大，其中um02与7号单倍体菌株的组合致病力最强，接种后发病率最高，可用于玉米瘤黑粉病抗性鉴定和玉米蘑菇生产。另外，本试验由于是在温室中进行，玉米植株生长较弱，抗病能力较差，所以导致各处理发病率较大田试验中发病率高。表1本发明单倍体菌株um02与其性亲和不同单倍体菌株组合接种对比试验结果实施例5：本发明单倍体菌株um02与7号单倍体菌株组合接种效果对比试验(一)试验材料：伟科966(高感玉米瘤黑粉病)(二)试验处理：(1)处理1：实施例4制备的接种液ii(即um02和7号单倍体菌株组合)。(2)处理2：将2016年12月在海南采集的玉蜀黍黑粉菌冬孢子按照专利《一种玉米蘑菇生产方法及产品》(201510937192.3)所述的方法制备的接种液。(三)试验方法(1)2017年6月19日在河北省农林科学院植物保护研究所的试验农场播种，每个处理2行，行长5米，每行播种20-25株，行距0.6米，田间管理同一般大田管理。待玉米6叶-7叶期开始接种。(2)将处理1和处理2接种液中担孢子浓度用灭菌水调整为1×105-1×106个/ml，使用连续注射器从幼苗茎侧方向刺入接种，接种量为2ml。接种后15-20天进行调查，调查时随机选择连续10株作为一组进行调查，共调查3组，记录每组的发病数，计算每组的发病率。结果(见表2)处理1的接种成功率(发病率)明显高于处理2，其次，处理1各组发病率数据的方差明显小于处理2，说明使用本发明单倍体菌株um02与其交配型相配的单倍体菌株混合后的接种液接种发病率比未经单倍体分离的黑粉菌单倍体混合物的发病率高，且发病更加稳定，试验重复性、一致性好，试验可靠性高。表2本发明单倍体菌株um02与7号单倍体菌株组合接种发病率对比试验结果分组处理1发病率(％)处理2发病率(％)140302504034010平均值43.326.7标准差4.712.5实施例6：利用含本发明单倍体菌株um02的接种液对玉米品种进行抗玉米瘤黑粉病鉴定试验(一)试验材料：(1)恒源5号、东单335和中单909(已经通过玉米品种审定的对玉米瘤黑粉病有不同抗性的玉米品种)；(2)齐319(玉米瘤黑粉病抗性鉴定抗病对照自交系)；(3)掖478(玉米瘤黑粉病抗性鉴定感病对照自交系)。(二)试验方法：(1)2017年6月23日在河北省农林科学院植物保护研究所的试验农场播种，每个品种种植2行，行长5米，行距0.6米，田间管理同一般大田管理。(2)在玉米6～7叶期进行接种，接种前按照实施例4制备的接种液ii(um02与7号单倍体菌株组合)，采用连续注射器从幼苗茎侧方向刺入接种，每株接种量为2ml。接种后15～20天进行调查，记录每个品种的发病数，计算发病率，并进行抗病等级鉴定。结果(见表3)使用含有本发明单倍体菌株um02的接种液对玉米品种进行抗瘤黑粉病的抗病性鉴定试验结果与已公布的玉米品种审定公告中的该品种的抗病性鉴定结果完全一致，说明使用含有本发明单倍体菌株um02的接种液对玉米品种的抗瘤黑粉病的抗病性鉴定结果准确、可靠，可用于玉米新品种的抗瘤黑粉病的接种鉴定。表3利用本发明含有um02的接种液对不同品种玉米抗瘤黑粉病抗性鉴定试验结果注：“hs”代表高感，“s”代表感病，“mr”代表中抗，“r”代表抗病实施例7：利用含有本发明单倍体菌株um02的接种液生产玉米蘑菇试验(一)试验材料：伟科966(高感瘤黑粉病)(二)试验设计：(1)处理1：实施例4制备的接种液ii(um02与7号单倍体菌株组合)。(2)处理2：将2016年12月在海南采集的玉蜀黍黑粉菌冬孢子按照《一种玉米蘑菇生产方法及产品》(201510937192.3)所述方法制备的接种液。(三)试验方法：(1)2017年5月5日播种，每处理1行，3次重复。行长5m,行距60cm，株距25cm，田间管理同一般的大田管理。于玉米花丝抽出前接种。(2)处理1和处理2接种液中担孢子浓度均为1×105-1×106个/ml，用连续注射器从雌穗顶部通过花丝通道向果穗内部注射接种液2ml。接种后的第16-19天进行采收，并统计发病率及玉米蘑菇产量。表4用本发明um02与其性亲和的单倍体菌株组合接种的发病率及玉米蘑菇产量试验结果结果(见表4)用含有本发明单倍体菌株um02的接种液接种的处理1的发病率为52.9％，折算亩产量为325.7kg；而用处理2的接种液接种的发病率为40.2％，折算亩产量为233.8kg，处理1的发病率和亩产量都明显高于处理2。说明含有本发明玉蜀黍黑粉菌单倍体菌株um02的组合致病性强，接种成功率高，可用于玉米瘤黑粉菌的生产。且本试验接种时期选择在花丝抽出前，多为整个果穗发病，不仅产量高，且包裹在苞叶内部，便于采收和运输。序列表<110>河北省农林科学院植物保护研究所<120>一种玉蜀黍黑粉菌单倍体um02及其应用<130>2018s1211inh<141>2018-05-18<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>775<212>dna<213>ustilagomaydis<400>1tttttgatgaaccttttttttctgaggtgtggctcgcacctgtccaactaaacctgagct60accttttttatataacacggttgcatcggtcggtctgtcgaaaccagtagcgctcatagc120gagcagcgtctggggaaagacgggtcggcgcttcttaccaacacttttgaacactaggat180tggaaggacaaaaatcatttttttgatgatggaagcgactggtaatgcggtcgtctaaat240tgaaaaaacaacttttggcaacggatctcttggttctcccatcgatgaagaacgcagcga300attgcgataagtaatgtgaattgcagaagtgaatcatcgaatctttgaacgcaccttgcg360ctcccggcagatttaatctggggagcatgcctgtttgagggccgcgaattgtttcgaacg420acagcttttttttcttgttgagaaagagctggcggatcggtagtgagggtctctgccatt480taccgtggctccctcgaaatgcattagcgcatccattggaaggcggaaagacggacgaaa540gctcgagtttttttgccctcgcttccctgccgggttttgataatgtcaggacttcggagg600cgaagagagggcgggagctggacgcaacgacttttctgctgtttggcgtgcttctgaacc660ccgcccatgcctctgctttaaccacagaggaagggatttatttttcaattcatcggcctc720agattggtaggactacccgctgaacttaagcatatcaaaaaggcgggagagaaaa775当前第1页12