本发明涉及一种园林植物病原菌分离方法，尤其涉及一种铁线莲叶斑病致病菌的分离方法，属于植物保护技术领域。
背景技术：
铁线莲(clematisfloridathunb.)为毛茛科铁线莲属植物，多为木质藤本，是攀援绿化中不可缺少的良好材料，有些铁线莲的花枝、叶枝与果枝，还可作为瓶饰、切花等。近年来，随着城市现代化建设的发展和城市规模的不断扩大，人们的生态意识和环境意识逐渐增强。园林绿化在城市环境中起着重要的作用。要提高城市的绿化覆盖率，改善城市的环境质量，不仅需要平面绿化，还要把平面绿化和垂直绿化有机的结合起来，因此铁线莲作为构成垂直绿化主体的藤本植物之一，可在园林绿化中充分发挥其优势。但铁线莲的叶斑病严重影响其观赏性，筛选并鉴定出导致铁线莲叶斑病的主要病原物，对建立有效的铁线莲叶斑病防治技术具有重要意义。
技术实现要素：
发明目的：本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种铁线莲叶斑病致病菌的筛选方法，该方法分离周期短，纯化率高。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术手段为：
一种铁线莲叶斑病致病菌的筛选方法，包括如下步骤：
步骤1，致病菌悬液的制备：取带有叶斑的铁线莲叶片，切碎后置无菌生理盐水中，混合物溶液的浓度为20～25％，于一定温度下培养得到致病菌悬液；
步骤2，初筛培养基的制备：往pda培养基中加入100u/ml青霉素，混合均匀后，灭菌，得到初筛培养基；
步骤3，致病菌落群培养：将步骤1中的致病菌悬液用无菌生理盐水梯度稀释成各个浓度的稀释液，每个浓度下取1ml稀释液涂布于步骤2的初筛培养基上进行培养，获得致病菌落群；
步骤4，单菌落培养：挑取初筛培养基上长出的菌落，接种至含铁线莲汁的培养基中进行纯培养，反复分：3～5次，获得的单一菌落为致病菌落；
步骤5：从初筛菌种中筛选出铁线莲叶斑病致病菌，再进行鉴定，确定致病菌的种类。
其中，步骤1中，致病菌悬液的培养条件为：于25℃，2500rpm振荡条件下培养30～35min。
其中，步骤2中，灭菌条件为121℃下灭菌25～30min。
其中，步骤3中，对致病菌悬液进行梯度稀释，得到的梯度稀释液浓度为10-5、10-6、10-7。
其中，步骤3中，培养条件为24～26℃下培养72～78h。
其中，步骤4中，含铁线莲汁的培养基中，铁线莲汁的质量浓度为10～15％。
其中，步骤5中，筛选方法为培养基验证和铁线莲验证试验。
其中，步骤5中，致病菌的种属为：镰刀菌属、尖镰孢菌和链格饱属。
有益效果：本发明铁线莲叶斑病致病菌的筛选方法选择性强，分离周期短，纯化率高。
附图说明
图1为本发明方法分离获得的4类铁线莲叶斑病致病菌(真菌)菌落形态图。
具体实施方式
下面对本发明技术方案进行详细说明，但是本发明的保护范围不局限于所述实施例。
本发明铁线莲叶斑病致病菌的筛选方法，取带有褐色坏死斑的成熟铁线莲叶片培养致病菌悬浮液；以加入100u/ml青霉素的pda培养基制备初筛培养基；用无菌生理盐水稀释致病菌悬液成不同浓度，取1ml稀释液涂布于初筛培养基上，并在24～26℃条件下培养72～76h，获得致病菌落群；挑取初筛培养基上长出的菌落至含10％铁线莲汁的pda培养基中进行纯培养，连续分离3～5次，获得的单一菌落即为铁线莲叶斑病菌落；本发明方法具体包括如下步骤：
步骤1，致病菌悬液的制备：取带有褐色坏死斑的成熟铁线莲叶片，切碎后置无菌生理盐水中，混合物溶液的质量浓度为20～30％，于25℃水浴中、2500rpm振荡条件下培养，所得培养液即为致病菌悬液；
步骤2，初筛培养基的制备：往pda培养基中加入100u/ml青霉素(用于杀死其他细菌)，混合均匀后，于121℃下灭菌25～30min，得到初筛培养基；
步骤3，致病菌落群培养：将步骤1中的致病菌悬液用无菌生理盐水稀释10-5，10-6，10-7倍，取1ml稀释液涂布于步骤2得到的初筛培养基上，于25～26℃下黑暗培养72h-76h，获得致病菌落群；
步骤4，单菌落培养：挑取初筛培养基上长出的菌落，接种至含10％铁线莲汁的pda培养基中进行纯培养(pad培养基中含有铁线莲汁实现特定性培养)，连续分离3～5次，获得的单一菌落为铁线莲叶斑病菌落；从初筛的纯菌种中筛选出铁线莲叶斑病致病菌；
步骤5，培养基验证和铁线莲验证试验，初步验证所筛的病原菌为铁线莲叶斑病致病菌；
步骤6，对所筛选的病原菌进行鉴定，确定病原菌的种属有三类：镰刀菌属、尖镰孢菌、链格饱属。
致病菌株种属特性的分子鉴定：
采用真菌基因组快速抽提试剂盒提取致病菌菌株总依据真核微生物保守性设计真菌通用引物经扩增，扩增产物与一载体的连接细胞转化基因克隆与测序，与数据库比对等分子生物学过程，验证分离获得三种类型真菌分别为：镰刀菌(fusariumsp.)；尖镰孢菌(fusariumoxysporum)；链格胞菌(alternariasp.)。
验证试验：
a培养基验证试验：在无菌条件下，将筛选所得的致病菌落分别接种至含铁线莲汁和不含铁线莲汁的培养基中，25℃培养箱中黑暗培养一天，观察接种圈生长情况，如果含铁线莲汁培养基中接种圈明显比不含铁线莲汁培养基中接种圈大，则初步说明所筛病原菌为铁线莲叶斑病致病菌。
b铁线莲活体验证试验：在无菌条件下，将筛选所得的致病菌针刺接种于已处理的无菌铁线莲健康叶片表面，然后放至已灭菌的光照培养箱中，25～28℃培养3天，观察其发病状态是否与初筛以前叶斑病状态一致，如果是，则初步验证所筛病原菌为铁线莲叶斑病致病菌。
实施例1
将组织分离法获得的叶面微生物进行初步鉴定，此次分离鉴定出来的真菌为镰刀菌(fusariumsp)；尖镰孢菌(fusariumoxysporum)；菌落为黑色链格胞(alternariasp)、菌落为灰色链格胞(alternariasp)四类病原真菌。分离获得的4类真菌菌落形态图如图1所示。
表1铁线莲病叶真菌的分离率与菌落特征
实施例2
从表2可看出，铁线莲叶斑病病原菌混合接种发病率最高，单独每种病原菌均可以引起叶斑病发病，但不同类型致病程度不一。
表2病原菌接种健康叶片病发率
表1为本发明分离方法与现有分离方法的对比：
表1
本发明筛选方法分离出来的均为铁线莲叶斑病致病菌，而现有方法筛选分离出来的菌中含有很有附生菌，从而说明本发明分离方法纯化率高。