本发明属于分子生物学和免疫学技术领域，涉及引起坦布苏病毒抗体依赖增强作用的抗原的应用。
背景技术：
坦布苏病毒病是一种以食欲急剧减退、产蛋量骤降为主要特征的新发疫病，给鸭鹅养殖业造成了重大经济损失，引发该病的坦布苏病毒属于黄病毒科、黄病毒属，该属病毒包括登革病毒、日本脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病毒、寨卡病毒等虫媒病毒。
病毒通过表面蛋白黏附于宿主细胞上的特异性受体起始感染过程。病毒表面蛋白的特异性抗体可以通过封闭表面蛋白阻抑病毒与受体的黏附，将病毒“中和”，使其失去感染细胞的能力。然而在有些情况下，抗体在病毒感染过程中却发挥相反的作用。它们协助病毒进入靶细胞，提高感染率，这一现象称为抗体依赖增强作用。目前，在多个科属的病毒中发现了抗体依赖增强作用现象，包括黄病毒、肠道病毒71型、埃博拉病毒、流感病毒等。坦布苏病毒属于黄病毒，在临床上同样观察到抗体依赖增强作用，可导致病毒的持续感染和持久的病毒血症。
坦布苏病毒病发病急，传播迅速，感染率高，临床上较难控制。目前市场上有商品化的全病毒灭活疫苗和弱毒疫苗，免疫后可诱发高水平抗体，产生保护性免疫应答。但是，由于坦布苏病毒存在抗体依赖增强作用，疫苗免疫后的保护效果并不理想，存在二次感染后促进病毒增殖、增强致病性的隐患。因此，鉴定引起坦布苏病毒抗体依赖增强作用的抗原在疫苗研发中具有重要作用，可通过分子设计去除该类抗原，避免出现抗体依赖增强作用，确保疫苗免疫效果，对坦布苏病毒病的防控具有重要意义。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供了一种引起坦布苏病毒抗体依赖增强作用的抗原及其编码基因。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
一种引起坦布苏病毒抗体依赖增强作用的抗原，其氨基酸序列为482-smtflavggilvfla-496(seqidno.1)。
编码本发明所述的引起坦布苏病毒抗体依赖增强作用的抗原的基因。
所述的基因其核苷酸序列如seqidno.2所示。
本发明所述的引起坦布苏病毒抗体依赖增强作用的抗原在制备坦布苏病毒疫苗中的应用。
本发明所述的引起坦布苏病毒抗体依赖增强作用的抗原在制备坦布苏病毒检测试剂中的应用。
本发明所述的引起坦布苏病毒抗体依赖增强作用的抗原编码基因在制备坦布苏病毒疫苗中的应用。
本发明所述的引起坦布苏病毒抗体依赖增强作用的抗原编码基因在制备坦布苏病毒检测试剂中的应用。
制备本发明所述抗原的方法，通过人工直接合成或通过体外表达获得。例如通过含有在适当的转录启动子控制下的编码所需肽的重组核酸分子的微生物表达肽，以及从所属微生物收集所需肽。
有益效果：
本发明首次鉴定了一个引起坦布苏病毒抗体依赖增强作用的抗原，其氨基酸序列为482-smtflavggilvfla-496。本发明用大肠杆菌表达的抗原免疫雏鸭，诱导产生特异性抗体，在雏鸭受到坦布苏病毒攻击后，该抗原的抗体可促进坦布苏病毒增殖，显著升高攻毒雏鸭体内病毒含量，导致产生持久的病毒血症。
本发明提供的抗原可诱导特异性抗体，在坦布苏病毒感染过程中，促进病毒增殖，引起抗体依赖增强作用。基于该发现，在未来坦布苏病毒疫苗研发中，可通过分子设计去除该类抗原，避免疫苗引起抗体依赖增强作用，保证保护效果，因此，鉴定引起坦布苏病毒抗体依赖增强作用的抗原对研制有效、安全的疫苗和防控坦布苏病毒的流行具有重要的应用价值。
附图说明
图1引起坦布苏病毒抗体依赖增强作用的抗原纯化的westernblot鉴定
图2引起坦布苏病毒抗体依赖增强作用的抗原对病毒增殖的促进作用
具体实施方式
实施例1引起坦布苏病毒抗体依赖增强作用的抗原的获得
根据引起坦布苏病毒抗体依赖增强作用的抗原的编码基因序列，采用人工合成方法获得编码基因片段，通过ecori和sali酶切位点插入到质粒pgex-4t-1中得到重组质粒pgex-4t-28。将表达载体pgex-4t-28导入大肠杆菌中，得到表达抗原的工程菌株。将得到的工程菌株接种lb培养基，待od600nm为0.4-0.6时加入终浓度为1mmol/l的iptg对含有表达载体pgex-4t-b的工程菌进行蛋白的诱导表达。表达产物采用glutathione-agarose(sigma)进行纯化，操作步骤按照说明书进行。得到纯化的抗原进行westernblot鉴定，结果显示得到目的蛋白(图1)。
实施例2引起坦布苏病毒抗体依赖增强作用的抗原诱导产生特异性抗体
1、将实施例1获得的抗原蛋白免疫9日龄雏鸭，每只200μg，首次免疫用等体积弗氏完全佐剂乳化。免疫2周后进行加强免疫一次，每只200μg，加强免疫用等体积弗氏不完全佐剂佐剂乳化。对照组雏鸭免疫相同体积的pbs，其余处理相同。
2、加强免疫后2周，对免疫组和对照组雏鸭进行翅静脉采血，分离血清，通过间接elisa检测特异性抗体效价。
实施结果：免疫组雏鸭血清中特异性抗体效价均高于1:6400，而对照组雏鸭血清中特异性抗体效价均为阴性，说明抗原蛋白具有良好的免疫原性，可诱导雏鸭产生高水平特异性抗体。
实施例3抗原特异性抗体在体内对病毒增殖的促进作用
1、将实施例2中加强免疫2周后的雏鸭进行坦布苏病毒攻毒试验。每只的攻毒剂量为104tcid50。
2、攻毒后1-5天，每天无菌采集雏鸭翅静脉血，分离血清，接种已长成单层的bhk-21细胞。37℃孵育2h后，pbs洗涤3次，加入含1％胎牛血清的rpmi1640，37℃培养3天。收集细胞，荧光定量rt-pcr检测病毒核酸含量。采用相对定量方法(2-δδct)进行分析。检测病毒核酸所使用的引物为：上游引物：5’-gtgagatcttactgctatgag-3’；下游引物：5’-acttggcacatgtctgtatgc-3’。内参选用gapdh基因，上游引物：5’-acttggcacatgtctgtatgc-3’；下游引物：5’-caccagcatcaccccattt-3’。
实施结果：抗原蛋白免疫组雏鸭血清中坦布苏病毒的含量显著高于对照组(大于104倍)，且病毒血症持续时间长于对照组(图2)。
序列表
<110>江苏省农业科学院
<120>引起坦布苏病毒抗体依赖增强作用的抗原的应用
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
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<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
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sermetthrpheleualavalglyglyileleuvalpheleuala
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<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
tctatgacttttctagctgtaggaggaattttagtcttcctggca45