羊α干扰素突变体及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种羊α干扰素突变体，还涉及羊α干扰素突变体的制备方法和应用，属于基因工程重组蛋白领域。

背景技术

干扰素(interferon，ifn)，是由英国科学家isaacs于1957年利用鸡胚绒毛尿囊膜研究流感病毒干扰现象时首先发现，是一种具有抑制细胞分裂、调节免疫、抗病毒、抗肿瘤等多种作用的细胞因子。干扰素是早期免疫应答中起重要作用，是抗病毒感染的第一道防线。根据其结合膜受体的不同，干扰素可分为三种类型。

ⅰ型干扰素是先天性免疫力的重要组成部分，对抗病毒和胞内寄生菌作用明显，主要包括ifn-α、ifn-β、ifn-ω、ifn-ε、ifn-ζ等亚型，其中ifn-α和ifn-β是哺乳动物中最主要的干扰素。ⅰ型干扰素识别受体是ifn-α/β受体(ifnar)，广泛表达于多种细胞中。ⅱ型干扰素中只有ifn-γ，主要由活化的nk细胞、knt细胞以及t细胞表达产生，其受体为ifngr。ifn-γ是重要的免疫应答分子，参与免疫应答的整个过程，调控免疫应答的走向。ⅲ型干扰素近年发现的一种新型干扰素，具有组织特异性，属于白介素10(il-10)家族成员，主要包括λ1(il-29)、λ2(il-28a)和λ3(il-28b)。其受体为il-10r2和il-28rα组成的异二聚体。目前对ⅲ型干扰素的初步了解认为，其与过敏反应和自身免疫疾病有关，具有广谱抗病毒、抗菌、抗寄生虫等作用，参与免疫调节以及对肿瘤有显著的抵制效果，其已成为生物学、临床医学、免疫学、肿瘤学等相关学科中研究与应用的重点内容。

羊是人们熟悉的家畜之一，在我国已有5000余年的饲养历史。羊天性耐寒，在我国主要产于较寒冷的高原地区，如青海、西藏、内蒙古等地，其中又以内蒙古地区羊的品种为最佳。羊绒，经过加工，可以纺织成为羊绒衫；羊毛可以做成毡子铺在床铺上；羊皮，可以做成皮草；而羊肉，主要食用肉类之一，也是冬季进补佳品。羊肉的肉质细嫩，味道鲜美，含有丰富的营养，较猪肉和牛肉的脂肪、胆固醇含量都要少。冬季食用羊肉，可收到进补和防寒的双重效果。羊吃百草，固羊有“百药之库”之称。更有“要想长寿，常吃羊肉”的说法。在医疗保健方面，羊更能发挥其独特的作用，羊肉、羊血等等可用于多种疾病的治疗，具有较高的药用价值。然而一些病毒性疾病影响着羊类的生存和发展，也影响着人们的日常生活。因此，亟需一种优质、廉价的羊α干扰素产品来消除病毒性疾病对羊类生存和发展产生的影响。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种羊α干扰素及具有高抗病毒活性的羊α干扰素突变体；利用家蚕杆状病毒表达系统制备所述羊α干扰素或羊α干扰素突变体的方法；以及所述羊α干扰素或羊α干扰素突变体在制备预防或治疗羊病毒性疾病的药物或试剂中的用途。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种羊α干扰素，其氨基酸序列为seqidno.1所示，其编码基因的多核苷酸序列为(a)或(b)或(c)所示：

(a)seqidno.2所示的多核苷酸序列；或

(b)与seqidno.2的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸序列，该多核苷酸编码的蛋白仍具有干扰素的功能或活性；或

(c)与seqidno.2的多核苷酸序列至少有80％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸编码的蛋白仍具有干扰素的功能或活性；

优选的，与seqidno.2的多核苷酸序列至少有85％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸编码的蛋白仍具有干扰素的功能或活性；

更优选的，与seqidno.2的多核苷酸序列至少有90％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸编码的蛋白仍具有干扰素的功能或活性。

进一步，一种羊α干扰素突变体，是将所述羊α干扰素的信号肽替换为ncbi上登录号为caa41790.1的信号肽得到的突变体；所述突变体的氨基酸序列为seqidno.3所示，其编码基因的核苷酸序列为seqidno.4所示。

进一步，一种羊α干扰素突变体，是将氨基酸序列为seqidno.3所示的羊α干扰素突变体的第54位氨基酸由赖氨酸(k)突变成谷氨酰胺(q)得到的突变体；所述突变体的氨基酸序列为seqidno.5所示，其编码基因的核苷酸序列为seqidno.6所示。

进一步，一种羊α干扰素突变体，是将氨基酸序列为seqidno.5所示的羊α干扰素突变体进行s30h、p32l、r57k、q60a、r63q、f71l、t76a、v77i、l91f、a94e、n101d、h109r、g118d、t121a、m142a、k158g、t178s、a179t和s184r任何一种氨基酸单位点突变获得的突变体；

优选地，将氨基酸序列为seqidno.5所示的羊α干扰素突变体进行p32l、f71l、v77i、h109r、m142a或k158g任何一种氨基酸单位点突变获得的突变体；其中，将氨基酸序列为seqidno.5所示的羊α干扰素突变体进行f71l氨基酸单位点突变获得的突变体的氨基酸序列为seqidno.7所示，其编码基因的核苷酸序列为seqidno.8所示。

其中，本发明所述氨基酸单位点突变p32l，表示将氨基酸序列为seqidno.5所示的羊α干扰素突变体的第32位氨基酸由脯氨酸(p)突变成亮氨酸(l)；依此类推。

进一步，一种羊α干扰素突变体，是将氨基酸序列为seqidno.5所示的羊α干扰素突变体进行p32l-h109r、p32l-f71l、p32l-f77l、p32l-m142a、p32l-k158g、f71l-v77i、f71l-h109r、f71l-m142a、f71l-k158g、v77i-h109r、v77i-m142a、v77i-k158g、h109r-m142a、h109r-k158g或m142a-k158g任何一种氨基酸双位点突变获得的突变体；

优选地，将氨基酸序列为seqidno.5所示的羊α干扰素突变体进行p32l-k158g、f71l-v77i或h109r-k158g任何一种氨基酸双位点突变获得的突变体；其中，将氨基酸序列为seqidno.5所示的羊α干扰素突变体进行f71l-v77i氨基酸双位点突变获得的突变体的氨基酸序列为seqidno.9所示，其编码基因的核苷酸序列为seqidno.10所示。

其中，本发明所述氨基酸双位点突变p32l-k158g，表示将氨基酸序列为seqidno.5所示的羊α干扰素突变体的第32位氨基酸由脯氨酸(p)突变成亮氨酸(l)，并且将第158位氨基酸由赖氨酸(k)突变成甘氨酸(g)；依此类推。

进一步，一种羊α干扰素突变体，是将氨基酸序列为seqidno.5所示的羊α干扰素突变体进行p32l-f71l-k158g、p32l-v77i-k158g、p32l-h109r-k158g、p32l-f71l-v77i、f71l-v77i-k158g、f71l-v77i-h109r、f71l-h109r-k158g或v77i-h109r-k158g任何一种氨基酸多位点突变获得的突变体；

优选地，将氨基酸序列为seqidno.5所示的羊α干扰素突变体进行f71l-v77i-k158g氨基酸多位点突变获得的突变体；该突变体的氨基酸序列为seqidno.11所示，其编码基因的核苷酸序列为seqidno.12所示。

其中，本发明所述氨基酸多位点突变p32l-f71l-k158g表示将氨基酸序列为seqidno.5所示的羊α干扰素突变体的第32位氨基酸由脯氨酸(p)突变成亮氨酸(l)，并且将第71位氨基酸由苯丙氨酸(f)突变成亮氨酸(l)，同时将第158位氨基酸由赖氨酸(k)突变成甘氨酸(g)；依此类推。

进一步，本发明公开了含有所述羊α干扰素或者羊α干扰素突变体的编码基因的重组载体或重组宿主细胞。其中，所述重组载体为重组表达载体或重组克隆载体。

进一步，所述的羊α干扰素或者羊α干扰素突变体在制备预防或治疗羊病毒性疾病的药物或试剂中的用途。

所述羊病毒性疾病包括：羊痘病毒感染、羊传染性脓疱病毒感染或水疱性口炎病毒感染所致疾病，或者牛呼吸道合胞体病毒病中的任何一种或多种。

进一步，一种制备所述羊α干扰素或者羊α干扰素突变体的方法，包括以下步骤：(1)分别将所述羊α干扰素或者所述羊α干扰素突变体的编码基因克隆到杆状病毒转移载体中，构建得到重组转移载体；(2)将重组转移载体与杆状病毒共转染昆虫细胞，获得重组杆状病毒；(3)将重组杆状病毒感染昆虫细胞或昆虫宿主，培养被感染的昆虫细胞或昆虫宿主表达相应的蛋白，纯化，即得。

其中，所述杆状病毒转移载体选自acrp23-lacz、acrp6-sc、acuwl-lacz、bacpak6、bactopac、bacmid、blucbacii(petl)、p2bac、p2blue、p89b310、pac360、pac373、pacab3、pacab4、pacas3、pacc129、pacc4、dzi、pacgp67、paciel、pacjpl、pacmlf2、pacmlf7、pacmlf8、pacmpl、pacmp2、pacrp23、pacrp25、pacrw4、pacsmag、pacuwl、pacuw21、pacuw2a、pacuw2b、pacuw3、pacuw31、pacuw41、pacuw42、pacuw43、pacuw51、pacvc2、pacvc3、pacyml、pacjcc5、pbacl、pbac2、pbluebaciii、pbluebachis、pev55、mxiv、pieineo、pjvetl、pjvnhel、pjvp10、pjvrsmag、pmbac、pp10、ppakl、ppbac、pshonex1.1、psynxivvi+、psynvi+wp、psynxivvi-、pvl1391、pvl1392、pvl1393、pvl941、pvl945、pvl985、pvtbac、pbm030或puac-5；

所述杆状病毒选自家蚕杆状病毒亲本株bmbacmid、bmnpv、acmnpv、apnpv、hanpv、hznpv、ldmnpv、mbmnpv、opmnpv、slmnpv、semnpv或spltnpv；

所述昆虫宿主选自家蚕(bombyxmori)、野蚕(bombyxmandarina)、蓖麻蚕(philosamiacynthiaricim)、樟蚕(dictyoplocajapanica)、樗蚕(philosamiacynthiapryeri)、柞蚕(antheraeapernyi)、日本柞蚕(antheraeayamamai)、野天蚕(antheraeapolyphymus)、苜蓿尺蠖(atographacaliforica)、茶尺蠖(ectropisobliqua)、甘兰夜蛾(mamestrabrassicae)、斜纹夜蛾(spodopteralittoralis)、秋粘虫(spodopterafrugiperda)、粉纹夜蛾(trichoplusiani)、行军虫(thaumetopoeawilkinsoni)、棉铃虫(heliothisarmigera)、美国棉铃虫(heliothiszea)、烟青虫(heliothisassulta)、烟草夜蛾(heliothisvirescens)、东方粘虫(pseudaletiaseparata)或舞毒蛾(lymantriadispar)；

优选的，所述杆状病毒转移载体为pvl1393；所述杆状病毒为家蚕杆状病毒亲本株bmbacmid；所述昆虫宿主为家蚕(bombyxmori)。

本发明所构建的杆状病毒转移载体包括：

(1)含有羊α干扰素(ovifn-α)基因或含有羊α干扰素信号肽突变体(ovifn-α-s突变体)基因的载体pvl-ovifn-α、pvl-ovifn-α-s；

(2)含有ovifn-α-s突变体进行保守序列突变并优化后的突变体(ovifn-α-s-c-o突变体)基因序列的载体pvl-ovifn-α-s-c-o；

(3)含有ovifn-α-s-c-o突变体进行氨基酸单位点突变后的突变体(ovifn-α-s-c-o-m1突变体)基因序列的载体pvl-ovifn-α-s-c-o-m1；

(4)含有ovifn-α-s-c-o突变体进行氨基酸双位点突变后的突变体(ovifn-α-s-c-o-m1-m2突变体)基因序列的载体pvl-ovifn-α-s-c-o-m1-m2；

(5)含有ovifn-α-s-c-o突变体进行氨基酸多位点突变后的突变体(ovifn-α-s-c-o-m1-m2-m3突变体)基因序列的载体pvl-ovifn-α-s-c-o-m1-m2-m3。

本发明所获得的重组杆状病毒包括：重组家蚕核型多角体病毒rbmbacmid(ovifn-α、ovifn-α-s)、rbmbacmid(ovifn-α-s-c-o、ovifn-α-s-c-o-m1、ovifn-α-s-c-o-m1-m2、ovifn-α-s-c-o-m1-m2-m3)。

所述感染是指重组杆状病毒通过吞食或透过表皮来感染1-5龄的昆虫幼虫或蛹体；优选为，将重组家蚕杆状病毒感染家蚕细胞或穿刺接种1-5龄的家蚕幼虫或蛹，在感染3-6天后收集含各种羊α干扰素基因的家蚕幼虫或蛹的体液或组织匀浆；其中，所述的蛹最优为1-2天的早期嫩蛹。

本发明的有益效果是：本发明通过分析ncbi上所有羊α干扰素氨基酸序列，进行序列比对及信号肽分析，最终确定以登录号为caa41791.1的氨基酸序列为主要参考序列，与其他哺乳动物ⅰ型干扰素氨基酸序列对比，最终选用ncbi上登录号为caa41790.1的信号肽作为该氨基酸序列的信号肽进行信号肽突变，再选取每个位点上的出现频率高的偏好氨基酸进行优化，设计一条保守序列；并以保守序列为模板设计多对引物用融合pcr法进行氨基酸单位点突变、氨基酸双位点突变、氨基酸多位点突变，获得了多个羊α干扰素突变体。本发明利用家蚕杆状病毒表达系统在家蚕生物反应器中表达所述羊α干扰素突变体，所表达的羊α干扰素突变体的抗病毒活性大幅度提高，具有较为明显的抗病毒活性。本发明方法工艺简单，可快速获得大量安全可靠的羊α干扰素。本发明所述的羊α干扰素突变体能够用于制备预防或治疗羊病毒性疾病的药物或试剂，对畜牧业的发展具有重大意义。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。

术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括pna(肽核酸)、在反义技术中所用的dna类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(batzer等人，nucleicacidres.19:5081(1991)；ohtsuka等人，j.biol.chem.260:2605-2608(1985)；和cassol等人，(1992)；rossolini等人，molcell.probes8:91-98(1994))。

术语“同源性”，指与天然核酸序列的序列相似性。“同源性”包括与本发明的调控片段的核苷酸序列具有优选地85％或更高，更优选地90％或更高，以及最优选地95％或更高同一性的核苷酸序列。同源性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同源性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同源性。

术语“互补的”在此指的是两种包括反向平行核苷酸序列的核苷酸序列，反向平行核苷酸序列能在反向平行核苷酸序列的互补碱基残基之间形成氢键后彼此相互配对。本领域已知的是，当都从5’到3’的方向看序列时，两种互补链的核苷酸序列是彼此反向互补的。本领域也已知的是，两种在给定的条件组下能彼此杂交的序列不必必须是100％完全互补的。

术语“严谨杂交条件”意指在所属领域中已知的低离子强度和高温的条件。通常，在严谨条件下，探针与其靶序列杂交的可检测程度比与其它序列杂交的可检测程度更高(例如超过本底至少2倍)。严谨杂交条件是序列依赖性的，在不同的环境条件下将会不同，较长的序列在较高温度下特异性杂交。通过控制杂交的严谨性或洗涤条件可鉴定与探针100％互补的靶序列。对于核酸杂交的详尽指导可参考有关文献(tijssen,techniquesinbiochemistryandmolecularbiology-hybridizationwithnucleicprobes,"overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidassays.1993)。更具体的，所述严谨条件通常被选择为低于特异序列在规定离子强度ph下的热熔点(tm)约5-10℃。tm为在平衡状态下50％与目标互补的探针杂交到目标序列时所处的温度(在指定离子强度、ph和核酸浓度下)(因为目标序列过量存在，所以在tm下在平衡状态下50％的探针被占据)。严谨条件可为以下条件：其中在ph7.0到8.3下盐浓度低于约1.0m钠离子浓度，通常为约0.01到1.0m钠离子浓度(或其它盐)，并且温度对于短探针(包括(但不限于)10到50个核苷酸)而言为至少约30℃，而对于长探针(包括(但不限于)大于50个核苷酸)而言为至少约60℃。严谨条件也可通过加入诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂交而言，正信号可为至少两倍的背景杂交，视情况为10倍背景杂交。例示性严谨杂交条件可如下：50％甲酰胺，5×ssc和1％sds，在42℃下培养；或5×ssc，1％sds，在65℃下培养，在0.2×ssc中洗涤和在65℃下于0.1％sds中洗涤。所述洗涤可进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。

术语“突变”和“突变体”在此具有它们的常用含义，指的是在核酸或多肽序列中的遗传的、天然存在的或引入的变化，它们的意义与本领域人员通常所知的意义相同。

术语“宿主细胞”或“重组宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。

术语“转染”指真核细胞由于外源dna掺入而获得新的遗传标志的过程。

附图说明：

1.图1为细胞病变比例对应的荧光图；其中，a，“-”：无细胞病变；b，“±”：几个细胞病变；c，“+”：20％～30％细胞病变；d，“++”：50％～60％细胞病变；

2.图2为重组质粒pvl-ovifn-α的双酶切鉴定；其中，m：dna分子质量标准；1：重组质粒pvl-ovifn-α双酶切产物；-为阴性对照(转移载体pvl1393双酶切产物)；

3.图3为细胞出现荧光的各种比例的情况；其中，a：干扰素抑制vsv病毒显示的荧光；b：vsv病毒感染对照组显示的荧光；c：部分细胞感染vsv病毒显示的荧光。

具体实施方式

以下所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

转移载体pvl1393，e.coli菌株top10，bmn细胞，vero细胞，vsv-gfp病毒，均由中国农业科学院生物技术研究所保存和提供；试验家蚕品种jy1为江苏科技大学蚕业研究所提供，亲本病毒bmbacmiddna按照文献(专利号：zl201110142492.4，授权日期：2013.01.23)中所公开的方法构建。限制性内切酶、t4dna连接酶购自promega公司，pcr反应所用的lataqdna聚合酶及其它相关试剂均购自takara公司，脂质体购自invitrogen公司，dmem细胞培养基、胎牛血清为gibco公司产品。有关溶液和培养基的配置方法参照相关工具书(josephetal.，分子克隆实验指南第三版，2002；奥斯伯，等人，精编分子生物学指南，1998；davidl.spector，细胞实验指南，2001)；除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

定点突变的融合pcr方法，参照邝翡婷等人(一种载体构建的新方法：重组融合pcr法，基因组学与应用生物学，2012年，第31卷，第6期，第634-639页)所描述的方法进行。

计算干扰素的效价，利用vero/vsv*gfp系统，使用reed-muench方法，具体操作参照刘兴健，等(猫ω-like干扰素在家蚕中的表达和生物活性检测，生物技术进展，2015，5(6)：441-445)以及summersmd等(amanualofmethodsforbaculovirusvectorsandinsectcellcultureprocedures[r].texasagriculturalexperimentstation，1987)所描述的方法进行，其中判断细胞病变的标准参照图1。

每一个实施案例中的最佳改良方案均作为下一实施案例改良方案的比较标准。

实施例1羊α干扰素及其信号肽突变体基因在家蚕生物反应器中的表达与检测

ⅰ、目的基因合成和重组质粒的构建

本发明分析了ncbi上所有羊α干扰素氨基酸序列，进行序列比对及信号肽分析，最终确定以登录号为caa41791.1的氨基酸序列为原始序列，其氨基酸序列为seqidno.1所示，其编码基因的核苷酸序列为seqidno.2所示。序列分析过程中发现该序列的信号肽有多个切割峰，鉴于之前信号肽的切割位点影响干扰素的分泌效率的发现，本发明决定对羊α干扰素氨基酸序列进行突变。用signalp4.1在线对羊ifn-α氨基酸序列或相关序列进行信号肽预测，结果发现只有登录号为caa41790.1的信号肽为单峰，其它羊ifn-α氨基酸或相关序列为双峰，双峰意味着信号肽的分泌和切割效率并不是最佳，同时参考其他哺乳动物干扰素氨基酸序列进行信号肽突变设计，比较信号肽对抗病毒活性的影响，获得了羊α干扰素信号肽优化的突变体。最终将原始氨基酸序列信号肽替换为ncbi上登录号为caa41790.1的信号肽，获得ifn的羊α干扰素信号肽突变体，命名为ovifn-α-s突变体，其氨基酸序列如seqidno.3所示，基因序列如seqidno.4所示。

用dnaman软件分析限制酶酶切位点，根据酶切位点分析结果以及转移载体pvl1393和puc57上的多克隆位点，在目的基因两端加入目的基因序列中不存在的限制酶酶切位点。依据分析结果在其5'端加入bamhi酶切位点和kozak序列，3'端加入ecori酶切位点，使用taa作为终止密码子，确定好的基因序列交由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，并插入puc57载体，形成质粒puc57-ovifn-α。

如上所述，以ncbi上的登录号为caa41790.1的信号肽替代原始氨基酸序列的信号肽，即为ovifn-α-s突变体。用dnaman软件分析限制酶酶切位点，根据酶切位点分析结果以及转移载体pvl1393和puc57上的多克隆位点，在目的基因两端加入目的基因序列中不存在的限制酶酶切位点。依据分析结果在其5'端加入bamhi酶切位点和kozak序列，3'端加入ecori酶切位点，使用taa作为终止密码子，确定好的基因序列交由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，并插入puc57载体，形成质粒puc57-ovifn-α-s。

ⅱ、构建重组杆状病毒转移载体

用bamhi和ecori对质粒puc57-ovifn-α和质粒puc57-ovifn-α-s分别进行双酶切处理，利用dna凝胶回收试剂盒分别回收目的片段，t4dna连接酶分别连接目的片段和进行双酶切处理并灭活后的杆状病毒转移载体pvl1393，16℃，连接过夜。分别将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞top10，挑选菌落培养，提质粒，分别对重组质粒(重组转移载体)pvl-ovifn-α、pvl-ovifn-α-s进行bamhi和ecori双酶切，并进行1％琼脂糖凝胶电泳，其中重组质粒pvl-ovifn-α双酶切产物的电泳结果如图2所示，共分离出2个片段，小片段位于500-750bp之间，与目的基因片段588bp大小相符，大片段位于8000bp上方，与pvl1393片段9607bp大小相符。将酶切鉴定正确的质粒送北京擎科新业生物技术有限公司进行核苷酸测序，用megaalign比对结果表明序列与原先设计的序列一致，表明羊α型干扰素及其信号肽突变体基因已成功插入到pvl1393转移载体中bamhi和ecori之间。

羊α干扰素信号肽突变体核苷酸序列所需引物：

两侧上下游引物：

f：tcataccgtcccaccatcgggcgcggatccaacatggcccagc；

r：gatctgcagcggccgctccggaattctcaaggtgacgcc。

ⅲ、重组家蚕杆状病毒的获得、纯化与扩增

对bmn细胞进行复苏和传代，然后筛选重组病毒：当bmn细胞培养至细胞单层达80％左右时，倒掉旧培养基，用无血清tc-100培养基洗三次，加1.5ml无fbs培养基。向一灭菌管中依次加入1μg家蚕杆状病毒亲本株bmbacmiddna，2μg重组转移质粒pvl-ovifn-α、pvl-ovifn-α-s和5μl脂质体，用无菌双蒸水补足体积到60μl，轻轻混匀，静置15min后，逐滴加入到培养瓶中进行共转染。27℃培养4h后补加1.5ml无血清培养基和300μlfbs。27℃恒温培养4～5天，至细胞脱落浮起，收集细胞培养液，获得含有目的基因的重组病毒rbmbacmid(ovifn-α)、rbmbacmid(ovifn-α-s)。

重组家蚕杆状病毒的纯化和扩增方法如下：接种适量细胞(约70～80％)于35mm小平皿中，细胞贴壁后，吸去培养基，将收集的细胞培养液进行不同浓度稀释，取1ml加到贴壁细胞中，分布均匀。27℃感染1h后，吸去感染液，将2％低融点琼脂糖凝胶于60℃水浴中融化，冷至40℃与40℃预热的2×tc-100培养基(含20％fbs)混合均匀，每个平皿加4ml胶，待凝固后用parafilm封口，27℃倒置培养3～5d，显微镜观察。把不含有多角体的空斑挑选出来，重复以上步骤，经过2～3轮的纯化获得纯的重组家蚕杆状病毒rbmbacmid(ovifn-α)、rbmbacmid(ovifn-α-s)。

将重组家蚕杆状病毒rbmbacmid(ovifn-α)、rbmbacmid(ovifn-α-s)感染正常生长的bmn细胞，培养3天后收集上清液，上清中即含有大量的重组病毒rbmbacmid(ovifn-α)、rbmbacmid(ovifn-α-s)。

ⅳ、羊α型干扰素及其突变体在家蚕体内表达

将重组病毒培养液按10⁵pfu/头的剂量注射5龄起蚕，在27℃、70％～80％湿度的条件下培养，家蚕幼虫生长晚期，ovifn-α在多角体基因启动子的作用下得到高效表达。接种感染3.5d～4d左右，可以观察到家蚕幼虫体节肿胀、行为异常、食欲下降等症状，当观察到幼虫体积明显缩小，停止进食时，收集血淋巴，-20℃保存备用。

ⅴ、羊α型干扰素及其突变体蛋白抗病毒活性检测

采用微量细胞病变抑制法在vero/vsv*gfp系统上检测蚕血淋巴中表达的羊α型干扰素的抗病毒活性。将状态良好的vero细胞以1.0×10⁵个/ml的密度接种于96孔培养板中。将已超声破碎并过滤除菌的蚕血淋巴用含70ml/l胎牛血清的dmem培养液配制成不同稀释度的溶液，将稀释好的样品按100μl/孔接种于已经铺满vero细胞的培养孔内，每个稀释度和对照蚕血至少设8个复孔，同时设不加蚕血淋巴及vsv*gfp的细胞对照组和添加vsv*gfp的病毒对照组，于37℃、5％co2条件下培养18～24h。将稀释至100tcid50的vsv*gfp病毒，按100μl/孔加入已经吸弃上清液的培养孔内，置于37℃、5％co2条件下培养。在倒置荧光显微镜下观察，当病毒对照组各孔中大量细胞出现荧光，而细胞对照组中的细胞仍完全生长良好，无荧光出现时，则表明对照系统完全合格，即可作全面观察。

结果在倒置荧光显微镜下观察到，细胞对照组中的细胞生长状态良好，无荧光出现；感染病毒对照组中的细胞发生病变，大多数细胞出现荧光，添加重组羊α干扰素蛋白的细胞具有抵抗病毒感染的能力(图3)。根据羊α干扰素对vero细胞的保护作用，观察细胞的病变程度，待有绿色荧光细胞出现，这一孔细胞就记为“+”，按照reed-muench方法计算干扰素的效价。检测结果列于表1，抗病毒活性测定结果表明，在蚕幼虫体内表达的ovifn-α有较为显著的抗病毒活性，效价达3.16×10⁵u/ml，ovifn-α-s抗病毒效价高于ovifn-α，为5.62×10⁵u/ml，达到了预期的效果，说明通过利用只有一个特异性切割位点的ncbi上登录号为caa41790.1的信号肽来提高ovifn-α抗病毒活性是可行和有效的。

表1重组羊α干扰素抗病毒活性的检测结果

实施例2ovifn-α-s突变体进行保守序列突变并优化后在家蚕生物反应器中的表达与检测

ⅰ、羊α型干扰素突变体基因的构建

将从ncbi上获得的所有羊α干扰素氨基酸序列及相关序列进行比对，得到一条保守序列。该保守序列与原始氨基酸序列相比区别在于将原始氨基酸序列的第54位赖氨酸(k)变成谷氨酰胺(q)。故基于实施例1的结果，将羊α干扰素信号肽突变体(ovifn-α-s突变体)的氨基酸序列的第54位k变成q，得到新的羊α干扰素突变体，命名为ovifn-α-s-c突变体，其氨基酸序列如seqidno.5所示。

另外，本发明利用optimumgene^tm技术对上述羊α干扰素突变体基因进行优化，根据生物反应器家蚕的密码子偏好性对基因序列进行改造，对影响基因转录效率、翻译效率和蛋白折叠的gc含量、cpg二核苷酸含量、密码子偏好性、mrna的二级结构、mrna自由能稳定性、rna不稳定性基序、重复序列等多种相关参数进行优化设计，有利于提高所优化基因在家蚕中的转录效率与翻译效率，并保持最终翻译成的蛋白序列不变。

为了提高在家蚕杆状病毒真核表达体系中的翻译起始效率，在基因前面加了kozak序列aac，为了提高翻译终止效率，终止密码子改为taa。此外，还去除了基因序列内部的bamhi、ecori、smai等限制性酶切位点，在基因上游加上了bamhi，在基因下游加上了ecori限制性酶切位点，以便后续克隆到真核转移载体pvl1393中。

所设计的α型干扰素突变体基因进行优化后的序列由生物科技公司人工合成，命名为ovifn-α-s-c-o突变体，其核苷酸序列如seqidno.6所示，合成的基因片段插入puc57载体，形成质粒puc57-ovifn，命名为puc57-ovifn-α-s-c-o。

ⅱ、构建重组杆状病毒转移载体

用bamhi和ecori对质粒puc57-ovifn-α-s-c-o进行双酶切处理，玻璃奶法回收目的片段，t4dna连接酶连接目的片段和进行双酶切处理并灭活后的杆状病毒转移载体pvl1393，16℃，连接过夜。将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞top10，挑选菌落培养，提质粒，对重组质粒(重组转移载体)pvl-ovifn-α-s-c-o进行bamhi和ecori双酶切，并进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果分离出2个片段，小片段位于500-750bp之间，与目的基因片段588bp大小相符，大片段位于8000bp上方，与pvl1393片段9607bp大小相符。将酶切鉴定正确的质粒送北京擎科新业生物技术有限公司进行核苷酸测序，用megaalign比对结果表明序列与原先设计的序列一致，表明羊α型干扰素突变体基因已成功插入到pvl1393转移载体中bamhi和ecori之间。

ⅲ、重组家蚕杆状病毒的获得、纯化与扩增

重组家蚕杆状病毒的获得方法同实施例1，最终获得含有目的基因的重组病毒rbmbacmid(ovifn-α-s-c-o)。重组家蚕杆状病毒的纯化和扩增方法同实施例1，经纯化获得纯的重组家蚕杆状病毒rbmbacmid(ovifn-α-s-c-o)。将重组家蚕杆状病毒rbmbacmid(ovifn-α-s-c-o)感染正常生长的bmn细胞，培养3天后收集上清液，上清中即含有大量的重组病毒rbmbacmid(ovifn-α-s-c-o)。

ⅳ、羊α型干扰素突变体在家蚕体内表达(同实施例1)

ⅴ、羊α型干扰素突变体蛋白抗病毒活性检测

检测方法同实施例1。

结果在倒置荧光显微镜下观察到，细胞对照组中的细胞生长状态良好，无荧光出现；感染病毒对照组中的细胞发生病变，大多数细胞出现荧光，添加重组羊α干扰素蛋白的细胞具有抵抗病毒感染的能力。根据羊α型干扰素对vero细胞的保护作用，观察细胞的病变程度，待有绿色荧光细胞出现，这一孔细胞就记为“+”，按照reed-muench方法计算干扰素的效价。检测结果列于表2，抗病毒活性测定结果表明在蚕幼虫体内表达的ovifn-α-s-c-o有较为显著的抗病毒活性，效价达1.95×10⁶u/ml，达到了预期的效果，说明在羊α干扰素信号肽突变体上进行保守序列突变并优化的方法来提高ovifn-α抗病毒活性是可行和有效的。

表2羊α干扰素突变体优化后抗病毒活性的检测结果

实施例3ovifn-α-s-c突变体优化并进行氨基酸单位点突变后在家蚕生物反应器中的表达与检测

ⅰ、羊α型干扰素突变体基因的构建

基于实施例2的结果，本发明获得了具有高抗病毒活性的羊α干扰素突变体-ovifn-α-s-c突变体，以密码子优化后的ovifn-α-s-c-o突变体的基因序列为模板，设计多对引物对保守序列进行定点突变，定点突变是利用融合pcr的方法进行。

将测序正确的质粒pvl-ovifn-α-s-c-o用bamhi和ecori进行双酶切处理，琼脂糖凝胶电泳后采用玻璃奶法回收目的片段，再应用融合pcr技术设计引物对目的片段进行定点突变，之后用t4dna连接酶连接目的片段及进行双酶切处理并灭活后的杆状病毒转移载体pvl1393(16℃，过夜连接)。将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞top10，挑选菌落培养，提质粒，用bamhi和ecori双酶切鉴定阳性克隆，将鉴定正确的重组质粒送北京擎科生物技术有限公司测序，测序正确的质粒命名为pvl-ovifn-α-s-c-o-m1。

突变位点分别为s30h、p32l、r57k、q60a、r63q、f71l、t76a、v77i、l91f、a94e、n101d、h109r、g118d、t121a、m142a、k158g、t178s、a179t和s184r；所得的羊α干扰素突变体命名为ovifn-α-s-c-o-m1(s30h、p32l、r57k、q60a、r63q、f71l、t76a、v77i、l91f、a94e、n101d、h109r、g118d、t121a、m142a、k158g、t178s、a179t和s184r)突变体。

本发明将突变后表达的干扰素效价比较高的点突变列在此处，做为进一步突变改良的基础，而突变后表达的突变体干扰素效价很差的突变位点就不在此一一列出，因为成功的突变体比例是比较低的，所以后续的实施例中也照此原则进行。

ovifn-α-s-c-o突变体核苷酸序列进行氨基酸单位点、双位点及多位点突变所需引物：

1)两侧上下游引物：

f:tcataccgtcccaccatcgggcgcggatccaacatggctttcgtcctctcc；

r:gatctgcagcggccgctccggaattcttacggtgaagccaaatcgccg；

2)中间上下游引物

(1)f1：gacttgccacacaaccacgctcctctgagtagatcaactt；

r1：aagttgatctactcagaggagcgtggttgtgtggcaagtc；

(2)f2：ccacacaactctgctctcctgagtagatcaactttggtgttg；

r2:caacaccaaagttgatctactcaggagagcagagttgtgtgg；

(3)f3:tgtctccaagacagaaaagatttccagttcccccgg；

r3:ccgggggaactggaaatcttttctgtcttggagaca；

(4)f4:gacagaagagatttcgctttcccccgggaagtggttaac；

r4:gttaaccacttcccgggggaaagcgaaatctcttctgtc；

(5)f5:gatttccagttcccccaggaagtggttaacggttctcaa；

r5:ttgagaaccgttaaccacttcctgggggaactggaaatc；

(6)f6:gaagtggttaacggttctcaattgcagaagaatcagacc；

r6:ggtctgattcttctgcaattgagaaccgttaaccacttc；

(7)f7:ttccagaagaatcaggccgtgagcgttctccacg；

r7:cgtggagaacgctcacggcctgattcttctggaa；

(8)f8:cagaagaatcagaccatcagcgttctccacgaaatgc；

r8:gcatttcgtggagaacgctgatggtctgattcttctg；

(9)f9:cagattttcaacctcttccacaccgcgagatcatct；

r9:agatgatctcgcggtgtggaagaggttgaaaatctg；

(10)f10:aacctcttccacaccgaaagatcatctgctgcctggaac；

r10:gttccaggcagcagatgatctttcggtgtggaagaggtt；

(11)f11:tcatctgctgcctgggacaataccctgttgcacgaatt；

r11:caattcgtgcaacagggtattgtcccaggcagcagatga；

(12)f12：ctgttggaagaattgagaacagccctccaccaacagc；

r12：gctgttggtggagggctgttctcaattcttccaacag；

(13)f13：caccaacagctgcaagacctggaaacctgcctcgt；

r13：acgaggcaggtttccaggtcttgcagctgttggtg；

(14)f14：ctgcaaggcctggaagcctgcctcgtgcaggctatg；

r14：catagcctgcacgaggcaggcttccaggccttgcag；

(15)f15：gattcgcctactctggccttgaaaagatacttccaaagaataagac；

r15：gtcttattctttggaagtatcttttcaaggccagagtaggcgaatc；

(16)f16：tacctggacgaaaagggccacagcggttgtgcttgg；

r16：ccaagcacaaccgctgtggcccttttcgtccaggta；

(17)f17：agagccttctcatcatcagcagacctgcaagaaagcttg；

r17：caagctttcttgcaggtctgctgatgatgagaaggctct；

(18)f18：gccttctcatcaacaacagacctgcaagaaagcttgagaag；

r18：cttctcaagctttcttgcaggtctgttgttgatgagaaggc；

(19)f19：gcagacctgcaagaaagattgagaagtaaagacggcgatt；

r19：aatcgccgtctttacttctcaatctttcttgcaggtctgc；

画下划线的部分表示突变的氨基酸位点。

ⅱ、构建重组杆状病毒转移载体

用重组酶(peasy-uniseamlesscloningandassemblykit)将玻璃奶法回收的上述目的片段与经过bamhi和ecori双酶切的灭活杆状病毒转移载体pvl1393同源重组。重组产物转化大肠杆菌感受态细胞top10，挑选菌落培养，提质粒，对重组质粒(重组转移载体)pvl-ovifn-α-s-c-o-m1进行bamhi和ecori双酶切，并进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果分离出2个片段，小片段位于500-750bp之间，与目的基因片段588bp大小相符，大片段位于8000bp上方，与pvl1393片段9607bp大小相符。将酶切鉴定正确的质粒送北京擎科新业生物技术有限公司进行核苷酸测序，测序正确的质粒命名为pvl-ovifn-α-s-c-o-m1(s30h、p32l、r57k、q60a、r63q、f71l、t76a、v77i、l91f、a94e、n101d、h109r、g118d、t121a、m142a、k158g、t178s、a179t和s184r)。并用megaalign比对，结果表明序列与原先设计的序列一致，表明羊α型干扰素突变体基因已成功插入到pvl1393转移载体中bamhi和ecori之间。

ⅲ、重组家蚕杆状病毒的获得、纯化与扩增

重组家蚕杆状病毒的获得方法同实施例1，最终获得含有目的基因的重组病毒rbmbacmid(ovifn-α-s-c-o-m1)。重组家蚕杆状病毒的纯化和扩增方法同实施例1，经纯化获得纯的重组家蚕杆状病毒rbmbacmid(pvl-ovifn-α-s-c-o-m1)。将重组家蚕杆状病毒rbmbacmid(ovifn-α-c-o-m1)感染正常生长的bmn细胞，培养3天后收集上清液，上清中即含有大量的重组病毒rbmbacmid(ovifn-α-s-c-o-m1)。

ⅳ、羊α型干扰素突变体在家蚕体内表达(同实施例1)

ⅴ、羊α型干扰素突变体蛋白抗病毒活性检测

检测方法同实施例1。

结果在倒置荧光显微镜下观察到，细胞对照组中的细胞生长状态良好，无荧光出现；感染病毒对照组中的细胞发生病变，大多数细胞出现荧光，添加重组羊α干扰素蛋白的细胞具有抵抗病毒感染的能力。根据羊α型干扰素对vero细胞的保护作用，观察细胞的病变程度，待有绿色荧光细胞出现，这一孔细胞就记为“+”，按照reed-muench方法计算干扰素效价，检测结果列于表3，所有羊α干扰素突变体测得效价在4.68×10⁵u/ml～3.98×10⁶u/ml，其中p32l、f71l、v77i、h109r、m142a和k158g这6个位点突变后，表达的羊α干扰素效价略高于信号肽突变的保守序列表达测得的效价，而其余位点突变后效价不变甚至降低，说明这6个位点的突变是有效突变，可以达到提高ovifn-α-s-c突变体抗病毒活性的目的。其中，ovifn-α-s-c-o-f71l突变体具有最强抗病毒作用，其氨基酸序列为seqidno.7所示，编码基因的核苷酸序列为seqidno.8所示。

表3重组羊α干扰素单位点突变抗病毒活性的检测结果

实施例4ovifn-α-s-c-o-m1突变体进行氨基酸双位点突变后在家蚕生物反应器中的表达与检测

ⅰ、羊α型干扰素突变体基因的构建

鉴于实施例3的结果，确定部分位点的突变是有效突变，可以达到提高ovifn-α-s-c突变体的抗病毒活性目的。考虑到氨基酸的排列顺序是蛋白质的一级结构，并决定着蛋白质的高级结构，且实施例3中进行的氨基酸单位点突变有部分突变位点的位置可能是相互关联的，故尝试进行氨基酸双位点突变。本发明将抗病毒活性提高的单突变位点p32l、f71l、v77i、h109r、m142a和k158g两两组合，进行双位点突变，双位点突变是在实施例3获得的单位点突变序列的基础之上，以其(ovifn-α-s-c-o-m1)作为模板，利用相应的引物(详见实施例3)，通过融合pcr的方法进行第二位的定点突变，从而获得双位点突变的目的片段。

双突变位点为p32l-h109r、p32l-f71l、p32l-f77l、p32l-m142a、p32l-k158g、f71l-v77i、f71l-h109r、f71l-m142a、f71l-k158g、v77i-h109r、v77i-m142a、v77i-k158g、h109r-m142a、h109r-k158g、m142a-k158g共15种组合，所获得的羊α干扰素突变体命名为ovifn-α-s-c-o-m1-m2(p32l-h109r、p32l-f71l、p32l-f77l、p32l-m142a、p32l-k158g、f71l-v77i、f71l-h109r、f71l-m142a、f71l-k158g、v77i-h109r、v77i-m142a、v77i-k158g、h109r-m142a、h109r-k158g、m142a-k158g)突变体。

ⅱ、构建重组杆状病毒转移载体

用重组酶(peasy-uniseamlesscloningandassemblykit)将玻璃奶法回收的上述目的片段与经过bamhi和ecori双酶切的灭活杆状病毒转移载体pvl1393同源重组。重组产物转化大肠杆菌感受态细胞top10，挑选菌落培养，提质粒，对重组质粒(重组转移载体)pvl-ovifn-α-s-c-o-m1-m2进行bamhi和ecori双酶切，并进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果分离出2个片段，小片段位于500-750bp之间，与目的基因片段588bp大小相符，大片段位于8000bp上方，与pvl1393片段9607bp大小相符。将酶切鉴定正确的质粒送北京擎科新业生物技术有限公司进行核苷酸测序，测序正确的质粒命名为pvl-ovifn-α-s-c-o-m1-m2(p32l-h109r、p32l-f71l、p32l-f77l、p32l-m142a、p32l-k158g、f71l-v77i、f71l-h109r、f71l-m142a、f71l-k158g、v77i-h109r、v77i-m142a、v77i-k158g、h109r-m142a、h109r-k158g、m142a-k158g)。并用megaalign比对，结果表明序列与原先设计的序列一致，表明羊α型干扰素突变体基因已成功插入到pvl1393转移载体中bamhi和ecori之间。

ⅲ、重组家蚕杆状病毒的获得、纯化与扩增

重组家蚕杆状病毒的获得方法同实施例1，最终获得含有目的基因的重组病毒rbmbacmid(ovifn-α-s-c-o-m1-m2)。重组家蚕杆状病毒的纯化和扩增方法同实施例1，经纯化获得纯的重组家蚕杆状病毒rbmbacmid(ovifn-α-s-c-o-m1-m2)。将重组家蚕杆状病毒rbmbacmid(ovifn-α-s-c-o-m1-m2)感染正常生长的bmn细胞，培养3天后收集上清液，上清中即含有大量的重组病毒rbmbacmid(ovifn-α-s-c-o-m1-m2)。

ⅳ、羊α型干扰素突变体在家蚕体内表达(同实施例1)

ⅴ、羊α型干扰素突变体蛋白抗病毒活性检测

检测方法同实施例1。

结果在倒置荧光显微镜下观察到，细胞对照组中的细胞生长状态良好，无荧光出现；感染病毒对照组中的细胞发生病变，大多数细胞出现荧光，添加重组羊α干扰素蛋白的细胞具有抵抗病毒感染的能力。根据羊α型干扰素对vero细胞的保护作用，观察细胞的病变程度，待有绿色荧光细胞出现，这一孔细胞就记为“+”，按照reed-muench方法计算干扰素效价，检测结果列于表4，所有羊α干扰素突变体测得效价在5.62×10⁵u/ml～5.01×10⁶u/ml，其中p32l-k158g、f71l-v77i、h109r-k158g三组双突变后，表达的羊α干扰素效价略高于保守序列、单突变序列表达测得的效价，而其余几组位点突变后效价不变甚至降低，说明这3个组合位点的突变是有效突变，可以达到提高ovifn-α-s-c-o-m1突变体抗病毒活性的目的。其中，ovifn-α-s-c-o-f71l-v77i突变体具有最强抗病毒作用，其氨基酸序列为seqidno.9所示，其编码基因的核苷酸序列为seqidno.10所示。

表4重组羊α干扰素双位点突变抗病毒活性的检测结果

实施例5ovifn-α-s-c-o-m1-m2突变体进行氨基酸多位点突变后在家蚕生物反应器中的表达与检测

ⅰ、羊α型干扰素突变体基因的构建

鉴于实施例4的结果，考虑到氨基酸的排列顺序是蛋白质的一级结构，并决定着蛋白质的高级结构，推测可能是由于进行的氨基酸单位点突变有部分突变位点的位置相互靠近彼此关联的，故尝试进行氨基酸多位点突变。本发明将获得的具有高效价的双突变位点组合，确定第三个突变位点，多位点突变是在实施例4获得的双位点突变序列的基础之上，以其(ovifn-α-s-c-o-m1-m2)作为模板，利用相应的引物(详见实施例3)，通过融合pcr的方法进行第三位的定点突变，从而获得多位点突变的目的片段。

获得了以下8种组合：p32l-f71l-k158g、p32l-f71l-k158g、p32l-h109r-k158g、p32l-f71l-v77i、f71l-v77i-k158g、f71l-v77i-h109r、f71l-h109r-k158g、v77i-h109r-k158g。所获得的羊α干扰素突变体命名为ovifn-α-s-c-o-m1-m2-m3(p32l-f71l-k158g、p32l-f71l-k158g、p32l-h109r-k158g、p32l-f71l-v77i、f71l-v77i-k158g、f71l-v77i-h109r、f71l-h109r-k158g、v77i-h109r-k158g)突变体。

ⅱ、构建重组杆状病毒转移载体

用重组酶(peasy-uniseamlesscloningandassemblykit)将玻璃奶法回收的上述目的片段与经过bamhi和ecori双酶切的灭活杆状病毒转移载体pvl1393同源重组。重组产物转化大肠杆菌感受态细胞top10，挑选菌落培养，提质粒，对重组质粒(重组转移载体)pvl-ovifn-α-s-c-o-m1-m2-m3进行bamhi和ecori双酶切，并进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果分离出2个片段，小片段位于500-750bp之间，与目的基因片段588bp大小相符，大片段位于8000bp上方，与pvl1393片段9607bp大小相符。将鉴定正确的重组质粒送北京擎科生物技术有限公司测序，测序正确的质粒命名为pvl-ovifn-α-s-c-o-m1-m2-m3(p32l-f71l-k158g、p32l-v77i-k158g、p32l-h109r-k158g、p32l-f71l-v77i、f71l-v77i-k158g、f71l-v77i-h109r、f71l-h109r-k158g、v77i-h109r-k158g)。并用megaalign比对，结果表明序列与原先设计的序列一致，表明羊α型干扰素突变体基因已成功插入到pvl1393转移载体中bamhi和ecori之间。

ⅲ、重组家蚕杆状病毒的获得、纯化与扩增

重组家蚕杆状病毒的获得方法同实施例1，最终获得含有目的基因的重组病毒rbm-bacmid(ovifn-α-s-c-o-m1-m2-m3)。重组家蚕杆状病毒的纯化和扩增方法同实施例1，经纯化获得纯的重组家蚕杆状病毒rbm-bacmid(ovifn-α-s-c-o-m1-m2-m3)。将重组家蚕杆状病毒rbm-bacmid(ovifn-α-s-c-o-m1-m2-m3)感染正常生长的bmn细胞，培养3天后收集上清液，上清中即含有大量的重组病毒rbm-bacmid(ovifn-α-s-c-o-m1-m2-m3)。

ⅳ、羊α型干扰素突变体在家蚕体内表达(同实施例1)

ⅴ、羊α型干扰素突变体蛋白抗病毒活性检测

检测方法同实施例1。

结果在倒置荧光显微镜下观察到，细胞对照组中的细胞生长状态良好，无荧光出现；感染病毒对照组中的细胞发生病变，大多数细胞出现荧光，添加重组羊α干扰素蛋白的细胞具有抵抗病毒感染的能力。根据羊α型干扰素对vero细胞的保护作用，观察细胞的病变程度，待有绿色荧光细胞出现，这一孔细胞就记为“+”，按照reed-muench方法计算干扰素效价，检测结果列于表5，所有羊α干扰素突变体测得效价在1.38×10⁶u/ml～6.31×10⁶u/ml，其中f71l-v77i-k158g三位点突变后，表达的羊α干扰素效价远高于保守序列、单突变序列、双突变序列表达测得的效价，为1.26×10⁷u/ml。而其余几组位点突变后效价不变甚至降低，说明此组合位点的突变是有效突变，可以达到提高ovifn-α-s-c-o-m1-m2突变体抗病毒活性的目的。ovifn-α-s-c-o-f71l-v77i-k158g突变体的氨基酸序列为seqidno.11所示，其编码基因的核苷酸序列为seqidno.12所示。

表5重组羊α干扰素多位点突变抗病毒活性的检测结果

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>浙江善测禾骑士生物科技有限公司

<120>羊α干扰素突变体及其制备方法和应用

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