一种生物膜材料的染毒和病毒灭活验证方法与流程

本发明涉及一种生物膜材料的染毒和病毒灭活验证方法。

背景技术

生物膜材料一般来源于动物组织，为了提高动物源性医疗器械的安全性，在生产过程需要有特定的病毒灭活工艺，并且需要有特定的方法来确认病毒是否被灭活。

在病毒的灭活验证试验中，生物膜材料首先需要加入指示病毒，即染毒。通常生物膜材料等固体材料的染毒采用浸泡染毒的方式进行，但是由于生物膜材料的体积一般都比较大，因此浸泡染毒需要的指示病毒的量也比较大；同时会存在染毒不均匀以及染毒时间长等问题。

技术实现要素：

本发明的目的是为了针对现有技术的不足，提供一种消耗指示病毒少、染毒均匀并且染毒快的生物膜材料的染毒方法，以及一种能够快速准确证明灭活效果的病毒灭活验证方法。

本发明的第一个目的是提供一种生物膜材料的染毒方法，包括如下步骤：

步骤(1)、将所述的生物膜材料用扎带固定成生物膜袋；

步骤(2)、向所述的生物膜袋中注入指示病毒。

具体地所述的生物膜材料为动物组织包膜或动物真皮，所述的动物组织包膜包括心包膜、羊膜、肠系膜中的一种。。

具体地，所述的步骤(2)中，用无菌注射器抽取所述的指示病毒，并将所述的指示病毒从扎带口注入所述的生物膜袋中，位于所述的生物膜袋内的所述的指示病毒的体积与所述的生物膜袋的容积比为1:1-1.125；优选地，所述的指示病毒的体积与所述的生物膜袋的容积比为1:1.1-1.125。

具体地，所述的指示病毒为选自emcv、prv、vsv、ppv、bvdv或reov-3中的一种或多种。

优选地，所述的指示病毒为选自emcv、prv、ppv或reov-3中的一种或多种。

本发明的第二个目的是提供一种生物膜材料的病毒灭活验证方法，将经上述染毒方法染毒后的生物膜袋，放入加有灭活液的容器中进行浸泡，取出所述的生物膜袋内的指示病毒进行检测。

具体地，所述的取出为用无菌注射器抽出所述的生物膜袋内的指示病毒。

具体地，所述的灭活液的液面低于所述的扎带的位置；优选地，所述的灭活液的液面略低于所述的扎带的位置。

本发明中，“略低于”是指灭活液的液面在扎带的位置下方一点，能够保证灭活液不会进入生物膜袋内部，但是又要保证灭活液与生物膜袋较大的接触面积。

具体地，所述的浸泡时间为1h～12h；优选地，所述的浸泡时间为2h～6h。

具体地，所述的灭活液为选自酸性溶液、碱性溶液或其他类型灭活液中的一种。

优选地，所述的酸性溶液为盐酸溶液或硫酸溶液；进一步优选地，所述的酸性溶液包括物质的量浓度为0.1～1mol/l的盐酸溶液或物质的量浓度为0.1～1mol/l的硫酸溶液。

优选地，所述的碱性溶液为氢氧化钠溶液。

优选地，所述的其他类型灭活液为选自戊二醛、甲醛、含氯消毒剂中的一种或多种，进一步优选地，所述的其他类型灭活液的质量浓度为0.5-10％。

更进一步优选地，所述的其他类型灭活液为选自质量浓度为0.625-0.65％的戊二醛溶液、质量浓度为4-4.2％的甲醛溶液、0.5-0.55％的次氯酸钠中的一种或多种。

由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：

本发明的浸泡染毒方法，操作简单方便，同时需要的指示病毒的含量少，染毒均匀并且染毒快。经过本发明的浸泡染毒后进行的病毒灭活验证方法，能够证明灭活液是否能穿透生物膜材料并灭活生物膜材料内部的与指示病毒同类的病毒，能够应用于实际工艺中，用于更快且更便捷地说明实际工艺的灭活效果，同时该方法操作简单方便有效，成本低。

附图说明

图1为指示病毒加入生物膜袋的示意图；

图2为生物膜袋加入灭活液的示意图。

具体实施方式

提供以下实施例是为了让本领域技术人员更好地理解、实施本发明，并非意在限制本发明的范围。

本发明的培养基的组分如下：氯化钙200g/l、氯化钾400g/l、无水硫酸镁97.67g/l、氯化钠6800g/l、磷酸氢钠140g/l、l-精氨酸126.98g/l、l-胱氨酸31.28g/l、l-谷氨酸292g/l、l-组氨酸41.88g/l、l-异亮氨酸52g/l、l-亮氨酸52g/l、l-赖氨酸72.47g/l、l-蛋氨酸15g/l、l-苯基丙氨酸32g/l、l-苏氨酸48g/l、l-色氨酸10g/l、l-二水合络氨酸钠51.9g/l、l-缬氨酸46g/l、泛酸钙1g/l、氯化胆碱1g/l、维生素b1g/l、肌醇2g/l、烟酰胺1g/l、维生素b61g/l、维生素b120.1g/l、维生素b11g/l、d-葡萄糖1000g/l、酚红11g/l、碳酸氢钠2200g/l，以及2％胎牛血清。

实施例1

生物膜材料的染毒和病毒灭活验证方法包括以下步骤：

a、将9g的牛心包膜四角折起，用扎带将牛心包膜固定成容积为3.5ml的牛心包膜袋；

b、向牛心包膜袋中加入3ml指示病毒reov-3，即完成了染毒；

c、将扎好的牛心包膜袋放入容器中，在容器中加入50ml质量浓度为4％的甲醛溶液进行浸泡，甲醛溶液的高度略低于扎带的位置，浸泡3h，用无菌注射器吸出生物膜袋内的指示病毒，用含2％亚硫酸钠的培养基50倍稀释后进行tcid50检测。

效果：能灭活reov-3。

实施例2

生物膜材料的染毒和病毒灭活验证方法包括以下步骤：

a、将7g的猪真皮四角折起，用扎带将猪真皮固定成容积为2.5ml的猪真皮膜袋；

b、向猪真皮膜袋中加入2ml指示病毒ppv，即完成了染毒；

c、将扎好的猪真皮膜袋放入容器中，在容器中加入50ml物质的量浓度为0.2mol/l的硫酸溶液进行浸泡，硫酸溶液的高度略低于扎带的位置，浸泡6h，用无菌注射器吸出猪真皮膜袋内的指示病毒，用培养基20倍稀释后并用1mol/lnaoh溶液中和后进行tcid50检测。

效果：能灭活ppv。

实施例3

生物膜材料的染毒和病毒灭活验证方法包括以下步骤：

a、将3g的猪心包膜四角折起，用扎带将猪心包膜固定成容积为1.5ml的牛心包膜袋；

b、向猪心包膜袋中加入1ml指示病毒emcv，即完成了染毒；

c、将扎好的猪心包膜袋放入容器中，在容器中加入30ml质量浓度为0.2mol/l的氢氧化钠溶液进行浸泡，氢氧化钠溶液的高度略低于扎带的位置，浸泡3h，用无菌注射器吸出猪心包膜袋内的指示病毒，用培养基10倍稀释后并用1mol/lhcl溶液中和后进行tcid50检测。

效果：能灭活emcv。

实施例4

生物膜材料的染毒和病毒灭活验证方法包括以下步骤：

a、将9g的牛真皮四角折起，用扎带将牛真皮固定成容积为2.5ml的牛真皮生物膜袋；

b、向牛真皮生物膜袋中加入2.5ml指示病毒prv，即完成了染毒；

c、将扎好的牛真皮生物膜袋放入容器中，在容器中加入50ml质量浓度为0.5％的戊二醛溶液进行浸泡，戊二醛溶液的高度略低于扎带的位置，浸泡1h，用无菌注射器吸出牛真皮生物膜袋内的指示病毒，用含1％甘氨酸的培养基10倍稀释后进行tcid50检测。

效果：能灭活ppv。

对比例1(浸泡染毒)

生物膜材料的染毒和病毒灭活验证方法包括以下步骤：

a、取1片清洗后的牛心包膜，称重为9g，然后平铺于无菌采样袋中，加入18ml指示病毒reov-3，封口后平铺放置，使牛心包膜浸泡在指示病毒中，将其置于2～8℃冰箱染毒过夜；

b、次日取出浸泡染毒后的牛心包膜放入容器中，在容器中加入50ml质量浓度为4％的甲醛溶液进行浸泡，浸泡3h，取出牛心包膜，加入含2％亚硫酸钠的培养基，剪碎，匀浆30s，取匀浆悬液进行tcid50检测。

效果：能灭活reov-3。

对比例2(浸泡染毒)

生物膜材料的染毒和病毒灭活验证方法包括以下步骤：

a、取1片清洗后的猪真皮，称重为7g，然后平铺于无菌采样袋中，按照加入14ml指示病毒ppv，封口后平铺放置，使猪真皮浸泡在指示病毒中，将其置于2～8℃冰箱染毒过夜；

b、次日取出浸泡染毒后的猪真皮放入容器中，在容器中加入50ml物质的量浓度为0.2mol/l的硫酸溶液进行浸泡，浸泡6h，取出猪真皮，加入培养基剪碎，匀浆30s，取匀浆悬液中取样用培养基10倍稀释并中和后进行tcid50检测。

效果：能灭活ppv。

对比例3(浸泡染毒)

生物膜材料的染毒和病毒灭活验证方法包括以下步骤：

a、取1片清洗后的猪心包膜，称重为3g，然后平铺于无菌采样袋中，做好标记，加入6ml指示病毒emcv，封口后平铺放置，使牛心包浸泡在指示病毒中，将其置于2～8℃冰箱染毒过夜；

b、次日取出浸泡染毒后的猪心包膜放入容器中，在容器中加入30ml物质的量浓度为0.2mol/l的氢氧化钠溶液进行浸泡，浸泡3h，取出猪心包膜，加入培养基剪碎，匀浆30s，取匀浆悬液用培养基10倍稀释并中和后进行tcid50检测。

效果：能灭活emcv。

对比例4(浸泡染毒)

生物膜材料的染毒和病毒灭活验证方法包括以下步骤：

a、取1片清洗后的牛真皮，称重为9g，然后平铺于无菌采样袋中，加入18ml指示病毒prv，封口后平铺放置，使牛真皮浸泡在指示病毒中，将其置于2～8℃冰箱染毒过夜；

b、次日取出浸泡染毒后的牛真皮放入容器中，在容器中加入50ml质量浓度为0.5％的戊二醛溶液进行浸泡，浸泡1h，取出牛真皮，加入含1％甘氨酸的培养基剪碎，匀浆30s，取匀浆悬液中取样用培养基10倍稀释后进行tcid50检测。

效果：能灭活prv。