本发明涉及人参内生菌及其用途，具体为一种人参内生菌发酵制备稀有人参皂苷的方法。
背景技术：
人参皂苷(ginsenosides)是一种固醇类化合物，属三萜类皂苷，是人参药材当中的主要药理活性成分。人参皂苷的结构分两个部分，其中一部分是疏水的苷元，另一个部分是亲水的糖基。根据其皂苷元的不同，人参皂苷可以分为三大类：齐墩果酸型皂苷(如ro)、人参二醇型皂苷(如rb1、rb2、rg3、rd、rh2、ppd)、人参三醇型皂苷(如re、rg1、rh1、ppt)，其中rg3、rh2等存在于野山参和红参中并且含量极低，称为稀有人参皂苷(rareginsenosides)。稀有人参皂苷对促进肿瘤细胞凋亡、促使肿瘤细胞的分化、提高机体免疫力等方面有重要的作用。
目前，制备稀有人参皂苷的方法有化学法和生物转化法，主要采用在人参中含量较高的rb1、rb2、rc、rd等主皂苷(majorginsenosides)分子的糖基选择性地水解制备稀有皂苷的方法。化学法如酸水解、碱水解和smith降解法等，虽然操作简单，但专一性差，难以得到某种特定结构的单体皂苷，并且收率很低，同时造成环境污染。此外，还有用化学催化剂合成稀有人参皂苷的研究报道，但是以上化学合成人参皂苷的方法存在许多缺陷，一般需要多步的保护和去保护步骤，产率较低。生物转化法是利用生物体内产生的酶的降解作用来，选择性地水解皂苷分子的侧链糖基，以达到结构修饰的目的，与化学法相比，具有高专一性、反应条件温和、无污染等特点，但是以人参或三七中得到的人参皂苷为原料，因此成本较高，并且大量获取稀有皂苷比较困难。
研究表明，生长于植物体内的内生菌产生与其宿主相同的化学成分，内生菌是获取植物活性成分的重要来源。通过内生菌发酵直接生产抗肿瘤稀有人参皂苷，其优越性是显而易见的，内生菌生长周期短、生长迅速，易于培养而不受环境因素影响，培养基相对较简单；微生物发酵法容易扩大化，利于工业化生产，成本低廉，具有十分重要的经济及生态效益等。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种利用人参内生菌制备稀有人参皂苷(f2、rg3、rh2等)的方法。
一种人参内生菌发酵制备稀有人参皂苷的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)、首先利用流水冲洗人参，将人参表面清洗后，依次用75％乙醇、无菌水、1％次氯酸钠溶液漂洗，用滤纸擦干表面，用无菌刀去除根、茎或叶的表皮或根须，切成0.8～1.2mm×4～6mm×4～6mm的小片后分别放在pda、lb和r2a平板培养基上培养2-7d，经过划线分离和培养得到单个菌落，从而获得纯培养；
2)、将单个或多个菌落接种至液体发酵培养基中进行培养4～14天；
3)、向发酵液中加入1～1.5体积的正丁醇，充分混匀，离心取上清液，真空浓缩干燥即得稀有人参皂苷。
液体培养基的配方为0.5gnh4cl，1.0gk2hpo4，0.5gkh2po4，0.25gmgso4和1.0g酵母粉和水1000ml。培养的温度为30℃～40℃，ph5-7。
进一步的，在培养基中加入丙酮酸、乙酰辅酶a、乙酸钠等前体物质和洛伐他汀、丁香酚等酶抑制剂可诱导产生稀有人参皂苷rg3。
在液体培养基中加入多个菌落，以混合菌群的内生菌发酵可得到稀有人参皂苷(f2、rg3、rh2等)。
有益效果：本发明采用人参内生菌发酵生产人参皂苷，内生菌生长周期短、生长迅速，易于培养而不受环境因素影响，培养基相对较简单，次级人参皂苷含量丰富，适宜工业化生产，通过加入丙酮酸、乙酰辅酶a、乙酸钠等前体物质和洛伐他汀、丁香酚等酶抑制剂可诱导产生稀有人参皂苷rg3。
具体实施方式
为了更清楚地理解本发明，下面通过具体的实施例进一步做详细描述。这些实施例仅用于对本发明进一步说明，而不用于限制本发明的范围。
实施例1
内生菌的分离：
首先利用流水冲洗6年生人参根，去除人参表面的泥土等杂质，然后依次用75％乙醇漂洗1分钟，无菌水冲洗4次，1％次氯酸钠溶液浸泡10分钟，再用无菌水冲洗4次，用滤纸擦干表面，用无菌刀切除人参表皮及根须，并切成1mm×5mm×5mm小片，然后分别放在pda平板培养基上培养2d，经过划线分离和培养得到单个菌落，从而获得纯培养。
菌种发酵培养：
150ml的ll液体培养基，利用高压蒸汽灭菌器，在121℃条件下灭菌40分钟，放置生物安全净化操作台冷却至室温后，接种混合内生菌pda-m，放置空气浴振荡器在30℃、150rpm条件下发酵4d后，得到发酵产物；利用移液枪取600μl的样品，加入1:1比例的正丁醇，充分混匀，离心，取上清液，提取发酵产物并用hplc分析。经hplc测试，得到稀有人参皂苷f2(14.5mg)、rg3(15.5mg)和rh2(4.65mg)。
实施例2
内生菌的分离：
首先利用流水冲洗6年生人参根，去除人参表面的泥土等杂质，然后依次用75％乙醇漂洗1分钟，无菌水冲洗4次，1％次氯酸钠溶液浸泡10分钟，再用无菌水冲洗4次，用滤纸擦干表面，用无菌刀切除人参表皮及根须，并切成1mm×5mm×5mm小片，然后分别放在r2a平板培养基上培养2d，经过划线分离和培养得到单个菌落，从而获得纯培养。
菌种发酵培养：
向150ml的ll液体培养基中添加0.01mol丙酮酸，利用高压蒸汽灭菌器，在121℃条件下灭菌40分钟，放置生物安全净化操作台冷却至室温后，接种混合内生菌r2a-m，放置空气浴振荡器在30℃、150rpm条件下发酵4d后，得到发酵产物；利用移液枪取600μl的样品，加入1:1比例的正丁醇，充分混匀，离心，取上清液，提取发酵产物并用hplc分析。经hplc测试，得到稀有人参皂苷rg3(14.8mg)。
人参皂苷检测
用移液枪取600μl的发酵液样品，按照实施例1-2提供的方法进行发酵，提取人参皂苷，利用高效液相色谱(hplc)测定人参皂苷的含量。
高效液相色谱法测定人参皂苷的具体步骤为：
a、精密准确称取人参皂苷标准品，色谱级甲醇溶解，利用峰面积绘制标准曲线。
b、色谱条件为：流动相：水(a)-乙腈(b)，洗脱梯度如表1所示；流速：1ml/min；检测波长：203nm；柱温：30℃；进样体积：10μl。
表1高效液相色谱流动相梯度表