一种新月弯孢霉在C14α-羟基化中的应用的制作方法

本发明属于生物技术和甾体药物转化技术领域，特别涉及一种新月弯孢霉cicc40301在c14α-羟基化中的应用。

背景技术：

甾体药物具有广泛的药理和生理活性，在抗炎、抗肿瘤、调节性功能和生育控制等方面具有极其重要的作用。例如某些甾体化合物的c11α-羟基化产物是合成地塞米松、强的松龙等药物的重要中间体；14α-羟基雄甾-4-烯-3,6,17-三酮具有抵抗子宫癌的功效。然而天然甾体药物往往存在药理活性较低的问题，在甾体药物的特定位点引入羟基可以显著提高其药理与生理活性。

甾体化合物结构复杂且含有多个非对称中心，用化学合成法在甾体化合物的关键位点引入氧原子非常困难，涉及多步复杂的保护和去保护反应，如在黄体酮的c11α位引入羟基需要9步化学反应，而利用黑根霉(rhizopusnigricans)转化可以一步完成c11α-羟化反应，获得c11α-羟基黄体酮，得率可达85％。

由于微生物转化具有特异性强、效率高、污染低等优点，已广泛应用到抗炎药、免疫抑制剂、促孕药、利尿剂以及避孕药的生产中。目前已报道的具有甾体转化活性的微生物多达1500种，但成功应用工业生产的菌株并不多，进一步研究开发工业生产菌种对于改进甾体生物转化效率和拓宽微生物催化在甾体工业中的应用范围具有重要意义。

14α-羟基甾体药物具有重要的生理活性和药用价值，已经成为人们研究的热点。研究发现14α-羟基-雄甾-4-烯-3,6,17-三酮具有抑制人体胎盘和子宫肿瘤中的芳香化酶活性与雌激素的生成，因此具有有效的抗肿瘤功效。而雄甾-4-烯-3,17-二酮(4ad)经c14α-羟基化，可获得合成该抗肿瘤药物的关键中间体c14α-4ad。

丝状真菌新月弯孢霉(curvularialunata)在工业上用于c11β羟化reichsteins化合物(rs)，生产具有抗炎活性的氢化可的松。本发明首次发现新月弯孢霉菌株cicc40301具有c14α-羟基化能力，可对4ad进行转化，通过tlc、hplc、¹hnmr、¹³cnmr方法确认其主要转化产物之一为c14α-4ad。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题，是提供新月弯孢霉cicc40301在c14α-羟基化中的应用，所述新月弯孢霉cicc40301能够转化4ad获得c14α-4ad。

具体转化方法如下：

将新月弯孢霉cicc40301按0.4-2％的接种量接种于ypd液体培养基中，25-30℃培养24-36h后，投0.1％-0.3％的雄甾-4-烯-3,17-二酮底物(4ad)，再转化24-48h；

转化24-48h后，c14α-4ad的得率达到40％-50％。

有益效果：

本发明首次发现了具有c14α羟基化能力的新月弯孢霉，新月弯孢霉cicc40301具有明显转化4ad的功能，经详细鉴定，其中一个主要转化产物为c14α-4ad，可作为合成抗肿瘤药物14α-羟基-雄甾-4-烯-3,6,17-三酮的关键中间体，得率达到40％-50％。这一发现将为甾体化合物的c14α羟基化提供新的途径。

附图说明：

图1新月弯孢霉转化4ad反应式；

图2新月弯孢霉cicc40301转化4ad的tlc分析结果；

其中，1-产物；2-底物；

图3新月弯孢霉cicc40301转化4ad产物hplc分析；

其中，a-底物；b-产物；

图4新月弯孢霉cicc40301转化4ad产物1hplc检测色谱图；

图5新月弯孢霉cicc40301转化4ad产物1核磁共振氢谱检测；

图6新月弯孢霉cicc40301转化4ad产物1核磁共振碳谱检测。

具体实施方式：

为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。

本发明所用新月弯孢霉cicc40301购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，4ad甾体底物购自北京紫竹药业有限公司，乙酸乙酯、氯仿等有机试剂购自天津市化学试剂六厂，tlc硅胶板购自青岛海洋化工厂，其他试剂未特别注明来源的，均购自上海生工生物工程股份有限公司。

以下实施例中所使用的ypd液体培养基质量体积百分比组成为：2％葡糖糖，2％蛋白胨，1％酵母粉，其余为水，ph自然，115℃灭菌20min。

实施例1新月弯孢霉cicc40301转化4ad的方法

新月弯孢霉转化4ad反应式如图1所示。

取200μl的新月弯孢霉菌株种子液接于50mlypd液体培养基中，28℃培养36h后，投0.2％的雄甾-4-烯-3,17-二酮底物(4ad)，再转化48h，c14α-4ad得率为48.3％。

实施例2新月弯孢霉cicc40301转化4ad的方法

将新月弯孢霉cicc40301经种子培养后，按1％的接种量接种于ypd液体培养基中，25℃培养24h后，投0.1％的雄甾-4-烯-3,17-二酮底物(4ad)，再转化24h；

转化24h后，c14α-4ad得率达到41.5％。

实施例3新月弯孢霉cicc40301转化4ad的方法

将新月弯孢霉cicc40301经种子培养后，按2％的接种量接种于ypd液体培养基中，30℃培养36h后，投0.3％的雄甾-4-烯-3,17-二酮底物(4ad)，再转化40h；

转化40h后，c14α-4ad得率达到45.2％。

实施例4tlc薄层层析检测产物

样品处理：取1ml实施例1转化完成获得的发酵液于1.5ml离心管，用200μl乙酸乙酯萃取，剧烈震荡，使其与发酵液充分混合，12000r/min离心5min分层。用内径为0.3mm的毛细吸管(长10cm)吸取约2-4cm上层乙酸乙酯层点样于硅胶层析板上。在距层析板边缘1cm处点样，样点间距0.5cm。在展开之前需要用展开剂将层析缸饱和30min。

层析：将点有样品的硅胶板放入层析缸中展开，加盖，密封，待展开剂前沿快到顶端时，取出点样板，烘干。采用紫外检测仪观察层析斑点的颜色和大小。展开剂为氯仿:丙酮:乙酸乙酯＝5.5:3.5:1。

tlc薄层层析检测产物结果如图2所示。结果显示该菌株能够转化4ad生成两种产物，且得率相似。

实施例5高效液相色谱分析转化产物

在50ml离心管中加入实施例1转化完成获得的发酵液30ml，再向其中加入10ml的乙酸乙酯，充分振荡萃取，12000r/min离心2min收集乙酸乙酯有机相，将剩下的菌液重复两次，合并有机相，hplc检测，hplc色谱图如图3所示，hplc结果显示，4ad底物出峰时间为4.434min(a)，4ad两种转化产物的出峰时间分别为2.774min和3.048min(b)。

色谱条件：色谱柱为c18柱(4.6mmdl×250lmm，5μm)，乙腈-水为流动相，流动相比为80:20，流速0.8ml/min，柱温25℃，进样量10μl，采用紫外检测器，检测波长240nm。本方法中所用乙腈为色谱纯，水为去离子水经过滤超声处理。

实施例6新月弯孢霉cicc40301转化4ad产物1纯化及鉴定

将实施例4层析后的tlc板中产物1进行刮tlc板分离。分离之后的样品用二氯甲烷和甲醇(二氯甲烷:甲醇＝5:1)复溶，用旋转蒸发仪在40℃中将有机溶剂挥发，再用油泵将剩余的甲醇挥发，得到转化产物样品。为了进一步鉴定得到的产物是否纯净，取分离纯化的产物于干净的1.5mlep管中，加入600μl80％乙腈溶液完全溶解后，经0.22μm膜过滤至液相小瓶中，备用。

(1)将上述分离获得的产物按实施例5所述方法进行hplc分析，结果如图4所示，出峰时间为3.005min，说明该产物确为实施例4中产物1，且纯度可达95％以上。

(2)将上述分离获得的产物进行核磁共振检测，核磁共振条件：溶剂为氘代二甲基亚砜，¹hnmr、¹³cnmr谱分别用400mhz和101mhz记录，核磁共振仪利用布鲁克ascend400系列。

氢谱结果如图5所示。

氢谱表征数据：¹hnmr(400，mhz，dmso-d6)δ5.641(s，1h)，4.304(s，1h)，2.393(m，4h)，2.096(m，2h)，1.821(d，j＝5.6hz，3h)，1.69(d，j＝10.4hz，2h)，1.600(s，1h)，1.495(m，2h)，1.382(m，4h)，1.150(s，3h)，0.921(s，3h)。

碳谱结果如图6所示。

碳谱表征数据：¹³cnmr(101mhz，dmso-d6)δ218.03(c-17)，197.98(c-3)，170.82(c-5)，123.02(c-4)，78.93(c-14)，52.09(c-13)，46.41(c-9)，38.20(c-10)，37.35(c-12)，35.27(c-1)，33.62(c-2)，32.78(c-6)，31.63(c-7)，28.89(c-8)，25.43(c-15)，24.51(c-16)，18.82(c-11)，17.12(c-19)，16.82(c-18)。

根据新月弯孢霉cicc40301转化4ad产物1的¹hnmr、¹³cnmr结果，碳谱中c14位的化学位移从4ad的51.67变为79.43，后者与文献报道c14α-4ad的碳谱数据一致，氢谱的特征峰(h4＝5.641，h18＝0.921，h19＝1.150)的化学位移值与文献报道c14α-4ad的氢谱数据一致，鉴于4ad母核的c14α-h被oh取代，故产物确认为c14α-4ad。

计算结构计算分子量为302，化学式为c19h26o3。

c14α-4ad的碳谱数据和氢谱数据来源于以下文献：

文献1：yildirimk，kurua.biotransformationofsomesteroidsbyaspergilluscandidus[j].journalofchemicalresearch,2015,39(9):546-549.

文献2：kirkdn,tomshc,douglasc，etal.asurveyofthehigh-filed1hnmrspectraofthesteriodhormones,theirhydroxylatedderivatives,andrelatedcompounds[j].journalofthechemicalsociety,perkintransactions2，1999,12:2655-2817.

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。