DAXX蛋白通过激活ERK信号通路促进卵巢癌腹水细胞增殖和转移的制作方法

本发明属于生物技术和医学领域，具体涉及daxx通过激活erk信号通路，在卵巢癌腹水细胞增殖和迁移中的作用。

背景技术

卵巢癌是女性常见的恶性肿瘤，其致死率位于女性肿瘤的第4位。美国癌症协会报道2009年美国有21550女性患上皮卵巢癌，14600个女性死于卵巢癌相关疾病。卵巢癌患者的死亡率达到69%，而乳腺癌的死亡率仅有19%。由于卵巢癌的发现较晚多伴有转移导致卵巢癌患者的5年生存率较低，大约占25%-35%。卵巢癌转移可以通过肿瘤细胞的直接扩散至邻近组织如结肠和膀胱，或腹腔液将脱离的肿瘤组织转移到整个腹腔或腹腔凹陷处。世界卫生组织统计上皮卵巢癌主要来源于上皮细胞，占卵巢癌发生的80%。常见的卵巢癌类型为浆液性乳头状卵巢癌、子宫内膜癌、粘液癌、透明细胞癌和颗粒细胞癌。人们认为高分化浆液性癌可能来源于卵巢表面上皮细胞，fallopian管上皮细胞或腹膜腔间质细胞。过去的40年，认为认为卵巢表面上皮细胞是浆液性癌的主要来源，这一理论主要由于卵巢周期性排卵后导致卵巢表面出现裂口，卵巢表面上皮细胞通过自我复制修复卵巢的这一损伤，因此，卵巢表面上皮细胞可在间质中形成包含囊肿从而恶性转变形成卵巢癌。卵巢表面上皮来源于腔上皮，而子宫体，子宫颈和输卵管上皮来源于mullerian管。卵巢表面上皮细胞表达上皮标志蛋白角蛋白和间质细胞的标志蛋白vimentin。至今仍不清楚上皮细胞是如何发展成mullerian样组织。

daxx是fas死亡结构域相关蛋白(fasdeath-associatedprotein)，可与fas死亡受体的死亡域结合。通过激活c-junnh2末端激酶通路daxx增强fas介导的凋亡同时也增强转录生长因子β依赖的凋亡。在小鼠中daxx缺失可导致胚胎致死和发育细胞凋亡。此外，实验证明通过rna干扰下调daxx可增加细胞凋亡，这些实验表明daxx具有抗凋亡作用。在一些特殊的情况下，daxx也具有促进凋亡作用，daxx促进凋亡和抑制凋亡的作用与它的亚细胞定位有关。daxx作为一种新型转录调控蛋白，与急性早幼粒细胞性白血病蛋白(promyelocytieleukemiaprotein，pml)相互作用共定位细胞核pml癌基因结构域(pmloncogenicdomains，pods)，可抑制多种转录因子的活性如cenp-c、pax3、ets1、糖皮质激素受体、雄激素受体、smad4p53等。daxx定位pods区域，可与组蛋白去乙酰基酶(humanhistonedeacetylases，hdacs)及靶基因分隔，使细胞凋亡所需要的某些基因能够有效表达，引起细胞凋亡。

技术实现要素：

本发明目的是发现了daxx在卵巢癌腹水细胞中的作用机制，提供了卵巢癌腹水细胞增殖和转移的理论依据。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明第一个方面，提供了：

检测daxx蛋白表达量的试剂在用于制备卵巢癌检测试剂中的用途。

在一个实施方式中，所述的卵巢癌是由daxx蛋白激活erk信号通路发生的。

本发明第二个方面，提供了：

一种卵巢癌腹水细胞模型，所述的细胞模型的构建方法是：

第1步，构建插入有daxx基因序列的质粒，将质粒转化在宿主细胞中，得到高表达plegfp-daxx的es-2卵巢癌细胞；

第2步，将高表达plegfp-daxx的es-2卵巢癌细胞腹腔注射至无胸腺裸鼠，并经过细胞分离，得到获得体内卵巢癌腹水细胞，作为细胞模型。

在一个实施方式中，所述的宿主细胞是es-2卵巢癌细胞。

在一个实施方式中，所述的质粒是plegfp。

本发明第三个方面，提供了：

卵巢癌腹水细胞模型在用于筛选卵巢癌治疗药物中的用途。

在一个实施方式中，卵巢癌治疗药物是指daxx抑制剂。

有益效果

本发明相对于现有的卵巢癌研究具有如下作用：通过证明daxx在卵巢癌腹水细胞转移中的作用，为卵巢癌的药物治疗靶点提供理论上有意义的参考。

附图说明

daxx促进腹水细胞增殖、迁移和克隆形成：建立了过表达daxx的es-2稳定细胞系，通过腹水模型获得了第一代腹水细胞（iascitescells）和第二代腹水细胞(iiascitescells)。

图1为光镜下观察细胞生长，显示二代腹水细胞增殖较一代腹水和es-daxx细胞快。

图2为mtt检测细胞增殖的吸光度值。

图3为细胞迁移实验，显示daxx过表达促进腹水细胞迁移。

图4为迁移细胞数目倍数对比值统计。

图5为克隆形成实验，证明daxx过表达促进腹水细胞克隆形成。

图6为克隆形成数统计图。

daxx和pml蛋白在腹水细胞中形成核体复合物，腹水细胞代数增加，核体复合体数量增加

图7为光镜下腹水细胞形态。

图8为免疫印记检测腹水细胞中daxx表达量。

图9为荧光显微镜观察daxx聚集在细胞核中形成点状复合体结构，腹水细胞中核体复合体数量增加。

图10为通过免疫荧光检测daxx蛋白和pml蛋白共定位在腹水细胞核中的核体复合体。

daxx通过和cebp-β结合促进腹水细胞增殖和迁移

图11为免疫组化实验检测p-erk1/2蛋白表达量，证明p-erk1/2在腹水细胞形成的肿瘤组织中表达明显增加。

图12为免疫组化实验检测p-akt蛋白表达量，证明p-akt在腹水细胞形成的肿瘤组织中表达没明显变化，表明mapk信号通路可能与卵巢癌腹水形成密切相关。

图13为免疫印记实验，证明随着腹水代数的增加，p-erk和cebp-β蛋白的表达量明显增多。

图14为免疫共沉淀实验，证明daxx与cebp-β蛋白在腹水细胞中相互作用。

图15为免疫组化实验，显示cebp-β在人卵巢癌组织中也高表达，表明腹水细胞中daxx通过和cebp-β结合促进腹水细胞增殖和迁移。

具体实施方式

es-2cells(人卵巢细胞株)从atcc(manassas,va,usa)购买，浙江大学提供了编码daxx全长序列(plegfp-daxx)和ha-cebp-β的表达质粒。

裸鼠：6-8周龄balb/c裸鼠购自上海斯莱克。裸鼠饲养在浙江大学实验动物中心，spf级。

腹水模型及腹水细胞培养

培养高表达plegfp-daxx的es-2卵巢癌细胞，待细胞密度为80%，胰蛋白酶消化细胞，收集细胞，800r离心5min，倒掉上清，用新鲜培养液吹散细胞，呈单细胞悬液，细胞计数，收集细胞，800r离心5min，用适当的培养液重悬细胞，稀释细胞密度为1×10⁷/ml，取6-8周龄雌性裸鼠，在裸鼠腹腔内注射1×10⁶个细胞，给裸鼠打上耳号，记录好实验日期、注射部位和注射细胞类型。每周观察裸鼠1-2次，称重，30天以后取回裸鼠用注射器无菌条件下抽出裸鼠腹腔腹水，在157g离心10min后，在含有10%胎牛血清和1%青霉素链霉素的dmem中培养，这些细胞被指定为一代腹水细胞（iascitescells）。分离出来的腹水细胞即为第一代腹水细胞，将第一代腹水细胞体外培养、传代后注射到新的裸鼠腹腔，20天左右观察到裸鼠腹腔有肿胀，取回处死裸鼠后收集腹水细胞，将其命名为第二代腹水细胞。

mtt实验

在含10%胎牛血清的dmem培养基中培养腹水细胞，细胞接种在96孔板（密度为5×10³个/孔）。细胞贴壁后，96孔板加入20μl/孔四甲基偶氮唑盐溶液(pbs中5mg/ml)，37℃孵育4h，酶标仪在490nm处测定吸光度值。

克隆形成实验

将腹水细胞培养24h后用0.25%胰酶消化，用培养液将细胞吹打成单细胞悬液，血细胞计数板计数，每个6cm培养皿中种1000个细胞，37℃,5%co2培养10～14d，用考马斯亮蓝染色后计算克隆数（细胞数目大于50cells/colony）。

为了研究daxx在卵巢癌腹水细胞中的作用，我们建立了过表达daxx的es-2稳定细胞系。并且通过腹水模型获得了第一代腹水细胞（iascitescells）和第二代腹水细胞(iiascitescells)，mtt检测结果显示二代腹水细胞增殖较一代腹水和es-daxx细胞快(图1、图2).细胞迁移实验检测发现daxx过表达促进腹水细胞迁移(图3、图4)，克隆形成实验证明daxx过表达促进腹水细胞克隆形成(图5、图6)。

通过在裸鼠皮下注射不同的腹水细胞，待裸鼠皮下成瘤后，取出肿瘤组织，免疫印记检测了daxx和pml蛋白的表达，我们发现各种腹水细胞形成的肿瘤组织中均高表达daxx和pml蛋白，并且发现二代腹水细胞形成的肿瘤组织中增殖细胞数目明显增多，而其他腹水细胞中增殖细胞明显减少。这一结果说明daxx可以促进腹水细胞在裸鼠体内的增殖能力，并且随着腹水代数增加而增强。

免疫组化实验

石蜡包埋人卵巢肿瘤组织来源于嘉兴妇幼保健院。实验中使用的人卵巢肿瘤组织经嘉兴学院校伦理委员会批准。5μm切片，参照abc试剂盒(vectorlaboratories,burlingame,ca,usa)，染色包括以下几个方面：切片经h2o2(0.3%)孵育10min后，在10%山羊血清中孵育30min，然后用brd抗体，daxx抗体(sigmaaldrich,st.louis,mo,usa)，p-akt，p-erk抗体(cellsignalingtechnology,danvers,ma,usa)和cebp-β抗体(santacruzbiotechnology,dallas,tx,usa），1：2000稀释，室温孵育1小时，用pbs洗涤后，用二次抗体孵育30min。dab（dabsubstratekit,vectorlaboratories）显色。

如图11和图12所示，为了进一步寻找daxx在腹水细胞中促进细胞增殖和迁移的靶点，我们首先通过免疫组化检测腹水细胞形成的肿瘤组织中p-erk和p-akt的表达水平，如图11，免疫组化结果显示p-erk1/2在腹水细胞肿瘤组织中表达明显增加，图12中可以看出，p-akt在腹水细胞肿瘤组织中表达没明显变化，这说明mapk信号通路可能与卵巢癌的发生密切相关。

免疫荧光实验

裸鼠腹水细胞接种24h后用pbs冲洗。用5%的bsa作封闭剂，在室温下用原抗体孵育腹水细胞1小时，dapi染核。

为了检测腹水细胞中daxx的作用,我们首先在光镜下观察了腹水细胞的形态,并且通过免疫印记检测发现不同的腹水细胞daxx均过表(如图7和图8)。接下来我们通过免疫荧光检测发现daxx和pml蛋白在腹水细胞核中形成核体复合体，如图9和图10，并且发现核体复合体的数目随着腹水细胞代数增加而增加，即腹水细胞中复合体数目明显增加。

免疫印迹实验

从腹水细胞中提取的蛋白质经sds-page分离后转移到pvdf膜上，在室温下与5%bsa孵育1h。室温下，一抗孵育1小时，tbst清洗膜，以辣根过氧化物酶结合的山羊抗兔抗体作为第二抗体(cellsignalingtechnology)为二抗，室温孵育1h，tbst清洗膜。结合抗体通过ecl化学发光试剂试剂盒(amersham,gehealthcare)显示。检测抗体包括daxx(sigmaaldrich)、erk、cebp-β、p-erk和β-actin（cellsignalingtechnology）。

如图13所示，通过免疫印记检测不同腹水细胞中p-erk和cebp-β的表达量，我们发现随着腹水代数的增加p-erk和cebp-β的表达量明显增多，这可能说明p-erk和cebp-β与腹水细胞的增殖和迁移有联系。为了进一步阐明cebp-β在腹水细胞中的作用，我们通过免疫沉淀检测发现daxx与cebp-β在腹水细胞中相互作用（图14），如图15所示，免疫组化检测发现cebp-β在人卵巢癌组织中也高表达，这些结果显示在腹水细胞中daxx通过和cebp-β结合促进腹水细胞增殖和迁移。