真核表达载体、真核表达系统、二者的制备方法和应用及GDF11蛋白与流程

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其是涉及一种真核表达载体、真核表达系统、二者的制备方法和应用及gdf11蛋白。

背景技术

生长分化因子11(growthdifferentiationfactor11,gdf11)也称为骨形态发生蛋白11(bmp11)，属于转化生长因子-β(tgf-β)超家族，作为一种新的生分化因子于1999年被首次报道。

gdf11作为一个新发现的生长分化因子，其具体的生物学功能尚不完善，需要研究人员进一步的探究，但目前可以确定其在生物的胚胎发育过程中起重要作用。比如已经确定了gdf11在脊髓前/后轴、骨、骨骼肌、神经系统、消化腺和泌尿生殖系统发育中发挥重要的作用。另外，还有研究发现gdf11能明显改善骨骼肌、心肌的衰老，具有明显的抗衰老作用，虽然gdf11的抗衰老作用仍存在争议，需要进一步的研究。

另一方面，tgf-β家族成员及其受体在癌症中起主要调节作用。在正常细胞和早期癌细胞中，tgf-β信号转导途径发挥肿瘤抑制作用，而在晚期肿瘤细胞中tgf-β信号传导途径会促进癌症的转移，根据人蛋白atlas数据库分析，gdf11在乳腺癌、结肠癌、肝癌和胰腺癌中高表达，并且gdf11高表达的结直肠癌患者表现出高频率的淋巴结转移和较低的生存率，对gdf11在癌症中的机制和功能进行更深的探究、阐明是有价值。

目前，gdf11主要用于生物、医药等基础研究领域，虽然已有商业化的人源性gdf11生产，但由于其价格较昂贵，用于基础研究的成本太高。因此，开发一种能够高效表达gdf11、且成本可控的表达载体尤为重要。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的第一个目的在于提供一种真核表达载体，以缓解现有技术中存在的人源性gdf11价格较昂贵，用于基础研究的成本太高的技术问题。

本发明的第二个目的在于提供上述真核表达载体的制备方法，该方法操作简单、方便，能够有效提高生产效率，且制备得到的真核表达载体具有高表达gdf11基因的效果。

本发明的第三个目的在于提供一种稳定高效表达重组蛋白gdf11的真核表达系统，该真核表达系统能够稳定、高效地表达重组蛋白gdf11。

本发明的第四个目的在于提供上述真核表达系统的制备方法，该方法操作简单、方便，能够有效提高生产效率，且制备得到的真核表达系统具有高表达gdf11蛋白的效果。

本发明的第五个目的在于提供由上述的真核表达系统或采用上述的制备方法制备得到的真核表达系统表达的gdf11蛋白，该gdf11蛋白纯度高、活性好。

本发明的第六个目的在于提供上述gdf11蛋白的纯化方法，该方法操作简单，普适性广，且纯化出的gdf11蛋白纯度较高。

本发明的第七个目的在于提供上述真核表达载体或真核表达系统在生物医药基础研究中的应用。

本发明提供了一种真核表达载体，所述真核表达载体高表达gdf11基因，所述gdf11基因具有如seqidno.1所示的核苷酸序列。

本发明还提供了上述的真核表达载体的制备方法，所述制备方法包括：

提供pcdna3.1⁺-ksh-dhfr重组质粒，将gdf11基因片段插入到所述pcdna3.1⁺-ksh-dhfr重组质粒的多克隆位点，得到所述真核表达载体。

进一步地，将以dhfr片段和kks片段为模板，kksdr和dhfr-r为引物扩增得到的ksh-dhfr片段与pcdna3.1⁺质粒连接、转化、筛选阳性菌落后，提取得到所述pcdna3.1⁺-ksh-dhfr重组质粒；

其中，所述kks具有如seqidno.2所示的核苷酸序列；

所述kksdr具有如seqidno.3所示的核苷酸序列，所述dhfr-r具有如seqidno.4所示的核苷酸序列。

优选地，以人脂肪干细胞的cdna为模板，dhfr-f、dhfr-r为引物，扩增得到所述dhfr片段；

其中，所述dhfr-f具有如seqidno.5所示的核苷酸序列。

进一步地，以gdf11基因序列ncbireferencesequence：nm_005811为模板，gdf11-f和gdf11-r为引物，扩增得到所述gdf11基因片段；

其中，所述gdf11-f具有如seqidno.6所示的核苷酸序列；

所述gdf11-r具有如seqidno.7所示的核苷酸序列。

进一步地，将所述gdf11基因片段插入到所述pcdna3.1⁺-ksh-dhfr重组质粒的多克隆位点，连接、转化、筛选阳性菌落后，提取得到所述真核表达载体。

本发明还提供了一种稳定高效表达重组蛋白gdf11的真核表达系统，其宿主细胞为哺乳动物细胞cho。

本发明还提供了上述的真核表达系统的制备方法，将上述的真核表达载体或采用上述的制备方法制备得到的真核表达载体转染到cho细胞中，培养并筛选，至细胞活率达到95％以上，得到所述真核表达系统；

优选地，使用cdoptichotm培养基进行筛选。

本发明还提供了由上述的真核表达系统或采用上述的制备方法制备得到的真核表达系统表达的gdf11蛋白；

优选地，所述gdf11蛋白上设有his标签。

本发明还提供了上述的gdf11蛋白的纯化方法，将转染有所述真核表达载体的cho细胞培养基过镍柱进行纯化，得到纯化后的gdf11蛋白；

优选地，将转染有所述真核表达载体的cho细胞培养基过镍柱后，先用含有50mm咪唑的pbs洗脱至基线平衡，再用含有300mm咪唑的pbs洗脱，在30kd处有明显条带，为纯化出的gdf11蛋白。

另外，本发明还提供了上述的真核表达载体或上述的稳定高效表达重组蛋白gdf11的真核表达系统在生物医药基础研究中的应用。

本发明提供的真核表达载体，能够高表达具有如seqidno.1所示的核苷酸序列的gdf11基因。本发明提供的上述真核表达载体的制备方法，包括将gdf11基因片段插入到pcdna3.1⁺-ksh-dhfr重组质粒的多克隆位点，该方法操作简单、方便，能够有效提高生产效率，且制备得到的真核表达载体具有高表达gdf11基因的效果。本发明提供的稳定高效表达重组蛋白gdf11的真核表达系统，其宿主细胞为哺乳动物细胞cho，能够稳定、高效地表达重组蛋白gdf11。本发明提供的上述真核表达系统的制备方法，包括将真核表达载体转染到cho细胞中，培养并筛选，至细胞活率达到95％以上，通过dhfr二氢叶酸还原酶系统进行转染子筛选，能够在保证细胞活率的情况下，通过反馈调节，使gdf11基因扩增，提高蛋白的表达量。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1a为本发明实施例1提供的以人脂肪干细胞的cdna为模板pcr扩增dhfr片段的pcr结果图；

图1b为本发明实施例1提供的以kks片断和dhfr片断为模板pcr扩增ksh-dhfr片段的pcr结果图；

图1c为本发明实施例1提供的含有pcdna3.1⁺-ksh-dhfr质粒的dh5α感受态细菌菌落pcr鉴定的结果图；

图1d为本发明实施例1提供的含有pcdna3.1⁺-ksh-dhfr质粒双酶切鉴定的结果图；

图2a为本发明实施例2提供的以gdf11基因序列ncbireferencesequence：nm_005811为模板pcr扩增gdf11片段的pcr结果图；

图2b为本发明实施例2提供的含有pcdna3.1⁺-ksh-dhfr-gdf11质粒的dh5α感受态细菌菌落pcr鉴定的结果图；

图2c为本发明实施例2提供的含有pcdna3.1⁺-ksh-dhfr-gdf11质粒双酶切鉴定的结果图；

图3a为本发明实施例3提供的cho细胞转染子的鉴定结果图；

图3b为本发明实施例3提供的gdf11蛋白表达纯化的结果图；

图4为本发明实施例4提供的gdf11蛋白对mc3t3-e1细胞中碱性磷酸酶活性抑制作用的结果图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

如无特别说明，本发明实施例中使用的细胞、药品及试剂均来源为正规而易购渠道：

实施例中所用引物信息见表1。

表1序列

实施例1pcdna3.1⁺-ksh-dhfr重组质粒的构建

本实施例提供了一种构建pcdna3.1⁺-ksh-dhfr重组质粒的方法，包括如下步骤：

(a)、以dhfr-f、dhfr-r为引物(序列如表1所示)，以人脂肪干细胞的cdna为模板pcr扩增dhfr片段(结果如图1a所示，其中m为dl1000maker)，并且胶回收dhfr片段(583bp)。

(b)、以kksdr、dhfr-r(序列如表1所示)为引物，以kks片断和dhfr片断为模板pcr扩增ksh-dhfr片段(结果如图1b所示，其中m为dl1000maker)，并且胶回收ksh-dhfr片段(685bp)。

(c)、用限制性内切酶(hindⅲ，bamhⅰ)酶切ksh-dhfr片段和抽提出的pcdna3.1⁺质粒，omegagelextractionkit试剂盒胶回收后用t4连接酶16℃，连接过夜，构建pcdna3.1⁺-ksh-dhfr质粒。并进行转化将质粒转入到由本实验室保存的大肠杆菌dh5α感受态细菌中，采用42℃水浴90s的热激法。

(d)、经过连接、转化后，挑取单克隆培养并进行菌落pcr鉴定与双酶切鉴定。菌落pcr鉴定可见1、2号菌在700bp左右处有明显条带为ksh-dhfr片段(结果如图1c所示，其中m为dl1000maker)。后保留2号菌并提取质粒进行双酶切鉴定，琼脂糖核酸电泳结果中出现了一条大于5000bp的条带为pcdna3.1⁺质粒，一条700bp左右条带为ksh-dhfr片段(结果如图1d所示，其中m为dl5000maker)。结果表明，本实施例成功构建了pcdna3.1⁺-ksh-dhfr质粒，并且最终通过测序得到了再次确认。

实施例2pcdna3.1⁺-ksh-dhfr-gdf11重组质粒的构建

本实施例提供了一种构建真核表达载体pcdna3.1⁺-ksh-dhfr-gdf11的方法，包括如下步骤：

(a)、以gdf11-f、gdf11-r为引物(序列如表1所示)，以gdf11基因序列ncbireferencesequence：nm_005811为模板pcr扩增gdf11片段(结果如图2a所示，其中m为dl1000maker)，omegagelextractionkit试剂盒胶回收gdf11片段(330bp)。

(b)、以限制性内切酶(bamhi，xhoi)酶切pcdna3.1⁺-ksh-dhfr质粒和gdf11片段并进行胶回收，胶回收后用t4连接酶16℃连接过夜连接，构建pcdna3.1⁺-ksh-dhfr-gdf11质粒，并进行转化将质粒42℃水浴热激90s转入到dh5α感受态细菌中。

(c)、经过连接、转化后，挑取单克隆培养并进行菌落pcr鉴定与双酶切鉴定。菌落pcr可见300bp左右处有明显条带为gdf11片段(结果如图2b所示，其中m为dl1000maker)。提取质粒进行双酶切鉴定，琼脂糖核酸电泳结果中出现了一条大于5000bp的条带为pcdna3.1⁺-ksh-dhfr质粒，一条300bp左右条带为gdf11片段(结果如图2c所示，其中m为dl5000maker)。结果表明，成功构建了pcdna3.1⁺-ksh-dhfr-gdf11质粒，为本发明提供的真核表达载体。并且通过测序得到了再次确认。

该真核表达载体能够高表达gdf11基因，gdf11基因序列如下(seqidno.1)：

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实施例3转染和筛选稳定的转染子以及gdf11蛋白的表达纯化

利用电转的方法将pcdna3.1⁺-ksh-dhfr-gdf11质粒稳定转染到cho细胞中，电转杯中每400μl细胞加入pcdna3.1⁺-ksh-dhfr-gdf11质粒30μg，电转仪程序为：500v，500μs，电转2次，后转至冰上孵育5～10min。电转完成后培养48h，进一步使用cdoptichotm培养基通过dhfr二氢叶酸还原酶系统进行转染子筛选，筛选过程台盼蓝染色计算细胞存活率，直到筛选完成并使目的细胞存活率达到95％以上后，提细胞rna进行反转录，基因水平鉴定确定gdf11的编码基因已经整合到cho细胞基因组中(结果如图3a所示，其中m为dl1000maker)。后直接采用镍柱蛋白纯化的方法，取培养基上清用滤纸过滤一遍，过滤后过ni2+柱。cho细胞表达的gdf11蛋白上有his标签，会挂在ni2+柱上。然后先用含有50mm咪唑的pbs(ph＝8.0)洗脱至基线平衡，再用含有300mm咪唑的pbs(ph＝8.0)洗脱，300mm咪唑洗脱液在30kd左右处有明显条带，为纯化出的目的蛋白(结果如图3b所示，其中m为蛋白maker)，使用bca法测定浓度，经bca法测定蛋白浓度为125μg/ml，然后进行活性鉴定。

实施例4gdf11蛋白活性鉴定

标准：gdf11能抑制mc3t3-e1细胞成骨分化过程中的碱性磷酸酶活性，取p8代的mc3t3-e1细胞铺24孔板，设置成骨分化培养基组，以及成骨分化培养基+gdf11(浓度梯度)组。每3天换液一次，在培养7天后检测碱性磷酸酶活性。结果如图所示，gdf11能显著抑制mc3t3-e1细胞中碱性磷酸酶的活性，经计算得出其ec50为90.84ng/ml(结果如图4所示)。结果证明获得了具有活性的gdf11蛋白。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

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